Os autores gostariam de agradecer Travis Wheeler ea loja de máquina do Departamento de Biologia Celular e Fisiologia da Universidade de Pittsburgh para a construção do palco amostra crio-fluorescência, Changlu e Tao Cheng Xu, da Universidade de Ciência e Tecnologia da China para técnico assistência, e Dr. Teresa Brosenitsch para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (GM082251 &amp; GM085043).

1. Cultura de células HeLa em revestido de carbono, EM Localizador Grids ouro <ol><li> Descarga luminescente do lado de carbono de um R2 de 200 mesh / 2 Quantifoil ouro EM localizador grade com menos de 25 mA para 25 seg. </li><li> Brasão da grade EM com fibronectina, flutuando-lo, do lado do carbono para baixo, em uma gota de 40 mL de 50 mg / ml solução fibronectina, em seguida, desinfectá-lo sob a luz UV por 2 horas em uma capa de cultura de tecidos. </li><li> As células HeLa placa na grade a uma densidade de 2 x 4 10 células / ml (total de 2 ml de cultura) em uma placa de cultura de vidro de fundo e crescer as células a 37 ° C, com 5% de CO2, em DMEM suplementado com 4,5 g / L de L-glutamina e glicose, 10% de soro inactivado pelo calor fetal de vitelo, 100 unidades / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina, por aproximadamente 18 horas. As células HeLa são infectadas após S / N cultura. </li></ol> 2. HIV-1 e infecção de células imagens ao vivo <ol><li> Adicionar um rastreador celular fluorescente (CMTPX Red, 1 ml / 2 ml) para a cultura com fundo de vidroprato (a partir do passo 1.3) e incubar o prato a 37 ° C durante 10 minutos, para permitir a absorção dos do corante fluorescente. </li><li> Lavar as células com PBS e adicionar 50 ul de meio fresco pré-aquecido. </li><li> Coloque o prato sobre a câmara da célula viva, a 37 ° C, de um campo varrido microscópio confocal scanner. Selecione vários campos (10-15 posições) que contêm 1-3 células / quadrados, com as células entre duas fases de mitose quando eles estão mais espalhada e plana (ver Figuras 2C e 2D), pois requer cryoEM regiões relativamente finas do amostra. Guarde estas posições para a imagem futura (passo 2.5). </li><li> Infectar as células com VSV-G pseudo tipados HIV-1 que contêm partículas de GFP-Vpr (usamos 40 uL de uma amostra contendo 40 ng / ml de p24). Quando a adição das partículas de vírus na parte inferior do prato, ter o cuidado de não perturbar a grade EM, uma vez que as posições para a imagiologia já foram seleccionados e armazenados. </li><li> Imediatamente após a adição de viriões, recolher time-lapse de alta velocidade imagens confocal 3D, nas posições previamente selecionadas (a partir do passo 2.3) para 20-40 min. </li><li> Imagens confocal foram adquiridos usando MetaMorph e analisados ​​pelo rastreamento de partículas 3D automatizado para a dinâmica de partículas individuais, utilizando software Imaris (veja a Figura 1). Uma vez que estamos relacionando o comportamento dinâmico de difração limitada HIV-1 com partículas ultra celular, time-lapse de imagens ao vivo de células e de rastreamento de partículas 3D são fundamentais para os resultados. No entanto, para uma estrutura grande e estática, uma imagem de fluorescência simples (sem células viva) seria suficiente para a análise correlativos. </li></ol> 3. Frozen-hidratado EM Preparação de Amostras Para minimizar o atraso de tempo entre a colheita da última imagem confocal e crio-fixação da amostra, a FEI Vitrobot (ou outro dispositivo de vitrificação) deve ser iniciado e preparado para imersão de congelamento durante a recolha de imagens ao vivo de células de fluorescência confocal.<ol><li> Ligue o dispositivo de vitrificação e definir a sua temperatura ambiente até 22 ° C, a humidade alvo de 100%, o tempo de blotting para 7 seg, e o tempo de espera e tempo para drenar um seg. </li><li> Coloque a caixa de armazenamento da rede no êmbolo Dewar e preparar etano líquido frio. Monte o Dewar para o dispositivo vitrificação. </li><li> Imediatamente após imagens de células ao vivo confocal (seção 2), coloque o prato de cultura em um bloco de cobre resfriado e transferi-lo para a sala de preparação de amostras cryoEM. Coloque a grade de EM para a pinça especializados e rapidamente apagar afastado todos os meios de comunicação sobre a grade. O mata-borrão é feito manualmente, com papel de filtro, após o que 4 ul de solução de 15 nm de ouro grânulo misturado com microesferas fluorescentes de 0,2 um é imediatamente colocada na grelha. As contas de ouro são utilizados como marcadores fiduciais para auxiliar a recolha de dados tomográficos e alinhamento. As microesferas fluorescentes são usadas para ajudar correlação entre as imagens fluorescentes e cryoEM (Veja Figuras 2c-2F). </li><li> Coloque as pinças para o dispositivo de vitrificação e instruir o dispositivo para apagar e mergulhar congelamento em etano líquido 16. Os parâmetros optimizados blotting para alcançar o melhor resultado são: tempo blot, 7 seg; blot deslocamento, 0; tempo de drenagem, 1 s, a temperatura de 22 ° C, e humidade de 100%. </li><li> Transferir a grade congelado-hidratado a um detentor cryoEM para imagiologia cryoET imediata, ou para um armazenamento de azoto líquido para posterior utilização do dewar. </li></ol> 4. Cryo-fluorescência Microscopia de Luz Um sistema de home-built, câmara de amostra crio-fluorescência e fase (Figura 3) é necessária para levar a cabo os passos 4,1-4,10. As especificações detalhadas e descrição da fase pode ser encontrada em junho et al. 15. <ol><li> Encha um líquido auto-pressurizado nitrogênio Dewar com nitrogênio líquido, pelo menos 2 horas antes de começar a microscopia de luz crio-fluorescência (ver Figura 3A). </li><li> Montar uma homebuilt crio-ffase de amostra luorescence 15 (Figura 3) num microscópio de fluorescência invertida de luz, tal como uma Olympus IX 71. </li><li> Ligação a entrada de azoto líquido da fase de crio-amostra ao Dewar auto-pressurizado e colocar a tomada de protecção de sobrecarga de azoto líquido para um recipiente adequado. Conecte uma linha de gás nitrogênio seco a uma luva colocada sobre a lente objetiva manter a lente quente e livre de geada. </li><li> Depositar uma plataforma de bloco de cobre (seta preta na Figura 3b) para a câmara de-fase de crio para o carregamento da grelha amostra congelada-hidratado. Esfriar e encha a câmara de estágio crio cobre com nitrogênio líquido através da linha de entrada da auto-pressurizado Dewar enchimento. </li><li> Quando o estágio crio atinge a temperatura de nitrogênio líquido (em ~ 4-6 min), a transferência de caixa de armazenamento da rede (a partir do passo 3.5) para o estágio crio. </li><li> Coloque a grade de amostra congelada hidratado no cartucho espécime EM sobre o bloco de cobre e clipe da glivrar no local usando um anel C (se estiver usando um cartucho de microscópio Polara), ou colocar um anel de cobre pré-arrefecido na parte superior (seta preta na figura 3d), para manter a grade no lugar e também para facilitar a recuperação da rede após imagem crio-fluorescência (se, por um não-Polara microscópio crio-eletrônico). </li><li> Coloque o cartucho (a partir do passo 4.6) na câmara interior do crio-fase (seta branca na Figura 3b). </li><li> Procurar e encontrar as mesmas partículas virais a partir dos dados de imagem em células vivas. Desde a grade EM tem um índice, é fácil de localizar a mesma partícula no grid em ambas as imagens de células ao vivo e imagens de crio-florescence. </li><li> Adquirir crio-DIC e imagens GFP nas posições identificadas de acordo com crio-condição, utilizando um microscópio de luz com um longo trabalho (2,7-4 mm) lente objetiva. Durante a imagem crio-fluorescência, verificar periodicamente o nível de nitrogênio líquido no estágio crio e recarregá-lo, se necessário, para manter a fase de amostra abaixo -170° C. </li><li> Após a conclusão da imagiologia crio-fluorescência, cuidadosamente devolver o cartucho de amostra até a plataforma de bloco de cobre e armazenar o cartucho num vaso Dewar de azoto líquido para análise futura cryoET com um sistema Polara. Se estiver usando um não-Polara microscópio crio-eletrônico, retire o anel de cobre, recuperar a malha amostral, coloque-o em uma caixa de armazenamento de rede, e armazenar a amostra em nitrogênio líquido Dewar até que a amostra é analisada por cryoET. </li><li> Para a análise de dados, se sobrepõem os crio-DIC e GFP imagens obtidas a partir do passo (4.9, ver figura 4b) e correlacionar as posições dos sinais de GFP na imagem crio-fluorescência com aqueles obtidos na série de imagens ao vivo de células. </li></ol> 5. Cryo-elétron Tomografia <ol><li> Coloque o cartucho de amostra para a estação de um microscópio eletrônico equipado com uma arma de emissão de campo, como Polara G2 microscópio crio-transferência. </li><li> Em modo de baixa-dose-pesquisa com uma ampliação de 140X, identify e salvar as quadrículas associadas (a partir do passo 4.11) em um arquivo de palco. </li><li> Sob o modo de baixa dose busca em uma ampliação de 3.500 X, insira um 100 mM objetivo abertura, busca e salvar todos os cargos correlacionados com sinais GFP em um segundo arquivo de palco. </li><li> Sob o modo de baixa dose de exposição, encontrar uma área em branco para ajustar a intensidade do feixe a uma dose de 1 ou 2 e - / a 2 e refinar o eixo de inclinação, usando a função y palco, pela queima de longe o gelo em uma região de carbono sem importância com várias contas de ouro. </li><li> No modo de baixa dose de focagem, ajuste a distância focal para ~ 3 mM e ajustar o ângulo de alinhamento da direcção do foco a ser paralelo ao eixo de inclinação. </li><li> Sob o modo de baixa dose-pesquisa, lembre-se posições salvas (a partir do passo 5.3), ajuste a altura eucentric amostra e verificar a faixa de inclinação para a área de interesse. Adquirir uma imagem de projeção com muito baixa dose de elétrons (~ 1 e - / a 2) entre 8 e 10 um desfocagem, em exposiçõesmodo ure, para confirmar as partículas do vírus correlatos para tomografia crio-eletrônico. </li><li> Mude para o modo de baixa dose-foco. No menu de funções de auto TEM, preceder a altura eucentric automatizada e concentrar funções na área do foco. </li><li> Configurar os parâmetros para a aquisição de uma série de inclinação. Para Figura 4 neste artigo, ângulos de inclinação variando ± 70 °, abaixo e acima de 45 °, a 3 ° e 2 ° de inclinação incrementos, respectivamente, foram utilizados, com 6 um desfocar e aproximadamente 70 e - / uma dose de 2 total. </li><li> Repita os passos 5.7 e 5.8 para todos os cargos salvos. Batch tomografia software pode ser utilizado para a recolha automática de dados em múltiplas posições para aumentar o rendimento. </li></ol> 6. Reconstrução tridimensional usando IMOD 17 <ol><li> Inspecione a série tilt-prima para ajustar os valores mínimos e máximos de densidade e determinar se há qualquer ponto de vista a ser excluído devido à mudança de imagem grande. </li><li> Comece eTomo e painel tomogram configuração usando o tipo de eixo, tamanho do pixel, diâmetro fiducial, etc. Em seguida, crie pt scripts. </li><li> Configurar o intervalo principal de tal forma que várias fases do cálculo tomogram pode ser ajustado / seguido simultaneamente. Modificar os parâmetros necessários e executar os programas específicos que são exigidos por cada etapa de processamento (Veja eTomo tutorial, <a href="http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html" target="_blank">http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html</a> ). </li><li> Na fase final, criar uma pilha alinhada completo (com uma média de erro residual inferior a 0,6) e reconstruir tomografias utilizando um algoritmo de projecção de trás ponderada em IMOD. </li><li> DeNoise áreas potenciais de interesse utilizando um programa de reforço da borda de difusão anisotrópica não linear implementado em 3D IMOD com parâmetros apropriados para aumentar o contraste e clareza. </li></ol>

<ol>
	<li>Leis, A., Rockel, B., Andrees, L., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+cells+at+the+nanoscale.">Visualizing cells at the nanoscale.</a> Trends in Biochemical Sciences. 34, 60-70 (2009).</li><li>Maurer, U. 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D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+biogenesis+of+individual+HIV-1+virions+in+live+cells.">Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells.</a> Nature. 454, 236-240 (2008).</li><li>Koch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+fusion+of+pseudotyped+HIV-1+particles+in+real+time+by+live+cell+microscopy.">Visualizing fusion of pseudotyped HIV-1 particles in real time by live cell microscopy.</a> Retrovirology. 6, 84 (2009).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+receptor+arrays+in+frozen-hydrated+sections+and+plunge-frozen+specimens+of+E.+coli+engineered+to+overproduce+the+chemotaxis+receptor+Tsr.">Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the chemotaxis receptor Tsr.</a> Journal of Microscopy. 216, 76-83 (2004).</li><li>Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+structure+determination+of+native+mammalian+cells+using+cryo-FIB+and+cryo-electron+tomography.">3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 180, 318-326 (2012).</li><li>Sartori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+microscopy:+bridging+the+gap+between+fluorescence+light+microscopy+and+cryo-electron+tomography.">Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 160, 135-145 (2007).</li><li>Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-fluorescence+microscopy+facilitates+correlations+between+light+and+cryo-electron+microscopy+and+reduces+the+rate+of+photobleaching.">Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching.</a> Journal of Microscopy. 227, 98-109 (2007).</li><li>van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+correlative+cryo-fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+applied+to+whole+mitochondria+in+human+endothelial+cells.">Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells.</a> European Journal of Cell Biology. 88, 669-684 (2009).</li><li>Rigort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromachining+tools+and+correlative+approaches+for+cellular+cryo-electron+tomography.">Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 172, 169-179 (2010).</li><li>Gruska, M., Medalia, O., Baumeister, W., Leis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+tomography+of+vitreous+sections+from+cultured+mammalian+cells.">Electron tomography of vitreous sections from cultured mammalian cells.</a> Journal of Structural Biology. 161, 384-392 (2008).</li><li>Jun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+HIV-1+with+correlative+live-cell+microscopy+and+cryo-electron+tomography.">Direct visualization of HIV-1 with correlative live-cell microscopy and cryo-electron tomography.</a> Structure. 19, 1573-1581 (2011).</li><li>Dubochet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens.">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 21, 129-228 (1988).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).</li><li>Whitfield, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+periodically+expressed+in+the+human+cell+cycle+and+their+expression+in+tumors.">Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors.</a> Molecular Biology of the Cell. 13, 1977-2000 (2002).</li><li>Agronskaia, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+fluorescence+and+transmission+electron+microscopy.">Integrated fluorescence and transmission electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 164, 183-189 (2008).</li><li>Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused-ion-beam+thinning+of+frozen-hydrated+biological+specimens+for+cryo-electron+microscopy.">Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 4, 215-217 (2007).</li></ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Nós apresentamos um conjunto simples de protocolos para fornecer uma abordagem correlativa avançada para analisar eventos celulares dinâmicos usando time-lapse imagens de fluorescência confocal, em células vivas seguido por cryoET. Nosso desenvolvimento metodológico para correlacionar a imagem ao vivo de células em 3D com alta resolução cryoET é fundamental para investigar muitos problemas biológicos desafiadoras, tais como a visualização, dinâmico (não estático, como relatado anteriormente), e difraçã...

Tomografia crio-eletrônico (cryoET) é uma técnica de imagem poderosa que permite a visualização tridimensional (3D) de células e tecidos e fornece insights sobre a organização de organelas nativas e estruturas celulares com resolução molecular em um de perto o estado fisiológico 1. No entanto, a natureza inerentemente não corado de baixo contraste amostra congelada-hidratado, combinada com a sua sensibilidade à radiação, torna difícil localizar áreas de interesse dentro de uma célula e, subsequentemente, realizar a série de inclinação com êxito, sem danificar a zona alvo. A fim de superar estes problemas, uma abordagem que combina correlativo microscopia óptica e electrónica é necessária. Especificidades destacadas por meio de rotulagem fluorescente são identificados e localizado por microscopia de fluorescência de luz, e, em seguida, as suas coordenadas são transferidos para o microscópio electrónico de aquisição de dados estruturais de alta resolução em 3D. Este método correlativo ajuda para localizar o alvo de umreas de interesse a serem abordados. Devido à limitação da espessura da amostra com cryoEM (&lt;300 nm), actualmente apenas as regiões periféricas da célula são adequadas para análise estrutural por CryoET 3D. Reduzindo ainda mais a espessura das amostras congeladas hidratadas por vítreo secção 8 ou crio-concentrado feixe de íons (FIB) moagem 9 iria expandir a capacidade de imagem correlativa. Anteriormente, os métodos correlatos foram utilizados principalmente para facilitar a aquisição de dados cryoET para grandes e estática das estruturas 10-13. Nestes estudos, crio etapas foram implementadas para aceitar grades cryoEM e caber em cada um microscópio vertical ou um microscópio invertido 10,11,14. Embora a mudança grades parece bastante simples em seus projetos, há adicional de transferência etapas envolvidas para a grade de EM, aumentando a chance de que a grade pode ser deformada, danificada e contaminada. Recentemente, demonstrou um avanço técnico emmicroscopia correlativa que nos permite visualizar diretamente os eventos dinâmicos que são, por natureza, difícil de capturar, como o HIV-1 e as interações da célula hospedeira em estágios iniciais da infecção 15. Conseguimos isso através da concepção e implementação de um estágio da amostra crio-microscopia de luz que adapta um sistema de cartucho para minimizar os danos espécime devido ao manuseio da rede, facilitando assim a correlação. Nosso projeto inclui um suporte integrado cartucho espécime, permitindo que tanto crio-microscopia de luz e crio-eletrônico a ser realizado, em seqüência, no mesmo suporte da amostra, sem transferência de amostras, agilizando assim o processo correlato. Além disso, também implementado um procedimento de correlação exacta e fiável utilizando esferas de látex fluorescentes como marcadores fiduciais.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine</td>
			<td>Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA</td>
			<td>12-604F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>F1141-1MG</td>
			<td>HeLa cell culture on EM grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell tracker</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>C34552</td>
			<td>Red CMTPX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A gold conjugates</td>
			<td>Ted Pella, Inc., Redding, CA</td>
			<td>15822-1</td>
			<td>15 nm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &mu;m fluorescent microspheres</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>F8811</td>
			<td>Yellow-green fluorescent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated fetal calf bovine serum</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>10082-139</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom culture dish</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold quantifoil finder EM grids</td>
			<td>Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany</td>
			<td>R2/2 Au NH2 200 mesh</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>70011-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow-discharge device 100X</td>
			<td>EMS, Hatfield, PA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun</td>
			<td>FEI, Hillsboro, OR</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>300 keV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark III</td>
			<td>FEI, Hillsboro, OR</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX 71 microscope</td>
			<td>Olympus America Inc., Center Valley, PA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon TiE microscope</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sweptfield confocal microscope</td>
			<td>Prairie Technologies, Middleton, WI</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tokai Hit live cell chamber</td>
			<td>Tokyo, Japan</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-fluorescence sample stage</td>
			<td>Home-made</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

correlative microscopy for 3d structural analysis of dynamic interactions

Tomografia crio-eletrônico (cryoET) permite a visualização em 3D de estruturas celulares com resolução molecular em um estado próximo do fisiológico 1. No entanto, a visualização directa de complexos virais individuais no seu ambiente celular do hospedeiro com cryoET é um desafio 2, devido à natureza pouco frequentes e dinâmica de entrada viral, especialmente no caso do VIH-1. Enquanto lapso de tempo de imagem de células vivas produziu uma grande quantidade de informações sobre muitos aspectos do ciclo de HIV-janeiro 03-07 de vida, a resolução oferecida por microscopia de células vivas é limitado (~ 200 nm). Nosso trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de um método de correlação que permite a visualização direta dos eventos iniciais da infecção pelo HIV-1 pela combinação de microscopia de luz fluorescente de células vivas, crio-microscopia fluorescente e cryoET. Deste modo, os sinais vivo de células e crio-fluorescente pode ser utilizada para orientar a amostragem de precisão cryoET. Além disso, a informação estrutural obtida a partir de cryoET pode be complementado com os dados funcionais dinâmicos adquirida através de imagens ao vivo de células de alvo marcado fluorescente. Neste artigo de vídeo, nós fornecemos métodos detalhados e protocolos para investigação estrutural do HIV-1 e interações célula hospedeira usando imagens ao vivo de células em 3D correlativo de alta velocidade e análise estrutural cryoET de alta resolução. As células HeLa infectadas com o HIV-1 partículas foram caracterizadas pela primeira vez por microscopia confocal em células vivas, e a região contendo a mesma partícula viral foi então analisado por tomografia crio-electrónica para detalhes estruturais 3D. A correlação entre dois conjuntos de dados de imagem, de imagem óptica e eletrônica de imagem, foi realizada através de microscopia de luz fase crio-fluorescência construídos em casa. A abordagem aqui pormenorizadas serão úteis não só para o estudo das interacções das células do vírus-hospedeiro, mas também para várias aplicações em biologia celular, tais como sinalização, o tráfico de receptor de membrana da célula, e em muitos outros processos celulares dinâmicas. &lt;/ P&gt;

Para caracterizar o comportamento dinâmico das partículas de vírus, as células HeLa infectadas com o HIV-1 foram visualizados por meio de microscopia confocal de células vivo de alta velocidade e os movimentos das partículas foram analisadas por rastreamento automatizado de partículas 3D (Figura 1). Para evitar que o lapso de tempo de vários minutos, que pode ocorrer entre a colheita da última imagem ao vivo de células confocal e de imersão de congelação (o que pode ser suficiente para perd...

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Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Nós descrevemos um método de microscopia correlativa que combina alta velocidade de microscopia de luz fluorescente de células vivas 3D de alta resolução tomografia crio-eletrônico. Nós demonstrar a capacidade do método dinâmico de imagem por correlativo, as pequenas partículas de HIV-1 que interagem com células HeLa hospedeiras.

Microscopia correlativo para Análise Estrutural 3D de interações dinâmicas

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.9K visualizações.  University of Pittsburgh School of Medicine. Nós descrevemos um método de microscopia correlativa que combina alta velocidade de microscopia de luz fluorescente de células vivas 3D de alta resolução tomografia crio-eletrônico. Nós demonstrar a capacidade do método dinâmico de imagem por correlativo, as pequenas partículas de HIV-1 que interagem com células HeLa hospedeiras.

Vídeo: Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence microscopy and environmental scanning electron microscopy (ESEM) of whole cells in hydrated state. Fluorescent quantum dots (QDs) were coupled to EGFR via a two-step labeling protocol, providing an efficient and specific protein labeling, while avoiding label-induced clustering of the receptor. Fluorescence microscopy provided overview images of the cellular locations of the EGFR. The scanning transmission electron microscopy (STEM) detector was used to detect the QD labels with nanoscale resolution. The resulting correlative images provide data of the cellular EGFR distribution, and the stoichiometry at the single molecular level in the natural context of the hydrated intact cell. ESEM-STEM images revealed the receptor to be present as monomer, as homodimer, and in small clusters. Labeling with two different QDs, i.e.,&#160;one emitting at 655 nm and at 800 revealed similar characteristic results.

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

Estudando a estequiometria do Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico em células intactas utilizando Microscopia Correlativo

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Bioengenharia

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Preparação de 3D colágeno Géis e microcanais para o estudo das interações 3D<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

Correlativa luz e de Microscopia Eletrônica Usando Quantum Dot Nanopartículas

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

Um de alta capacidade: Plataforma celular Microarray para Análise correlativa da diferenciação celular e forças de tração

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing virus-infected or transfected cells via EM are the low efficiencies of infection or transfection, hindering the examination of these cells. In order to overcome this difficulty, light microscopy (LM) can be performed first to allocate the subpopulation of infected or transfected cells. Thus, taking advantage of the use of fluorescent proteins (FPs) fused to viral proteins, LM is used here to record the positions of the "positive-transfected" cells, expressing a FP and growing on a support with an alphanumeric pattern. Subsequently, cells are further processed for EM via high pressure freezing (HPF), freeze substitution (FS) and resin embedding. The ultra-rapid freezing step ensures excellent membrane preservation of the selected cells that can then be analyzed at the ultrastructural level by transmission electron microscopy (TEM). Here, a step-by-step correlative light electron microscopy (CLEM) workflow is provided, describing sample preparation, imaging and correlation in detail. The experimental design can be also applied to address many cell biology questions.

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

A correlative light electron microscopy (CLEM) method is applied to image virus-induced intracellular structures via electron microscopy (EM) in cells that are previously selected by light microscopy (LM). LM and EM are combined as a hybrid imaging approach to achieve an integrated view of virus-host interactions.

Correlativo luz microscopia eletrônica de varredura (CLEM) para rastreamento e Imaging proteína Viral associado estruturas nas células Cryo-imobilizado

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low cell retention and poor survival within the target zone. However, during the in vitro construction process, a solution for maintaining stem cell bioactivity and increasing the cell amount within the cell sheet is urgently needed. Here, this protocol presents a method for constructing a multilayered cell sheet with favorable stem cell bioactivity and optimal operability. Decellularized porcine pericardium (DPP) is prepared by phospholipase A2 (PLA2) decellularization method as the cell sheet scaffold, and rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) are isolated and expanded as the seeded cells. The temporary multilayered cell sheet structure is constructed by using RAD16-I peptide hydrogel. Finally, the cell sheet is cultured with a dynamic perfusion system to stabilize the three-dimensional (3D) structure, and the cell sheet could be obtained following a 48-hour culture in vitro. This protocol provides an efficient and feasible method for constructing a multilayered stem cell sheet, and the cell sheet could be developed as a favorable stem cell therapy product in the future.

This article provides an efficient and feasible method for constructing multilayered stem cell sheets with favorable stem cell property.

Construção de uma folha de células-tronco mesenquimais em várias camadas com um sistema de cultura dinâmica 3D

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

Environmental Dynamic Mechanical Analysis to Predict the Softening Behavior of Neural Implants

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior of these materials. In the past, it has not been possible to satisfactorily measure the softening of thin films under conditions mimicking body environment without substantial effort. This publication presents a new and simple method that allows dynamic mechanical analysis (DMA) of polymers in solutions, such as phosphate buffered saline (PBS), at relevant temperatures. The use of environmental DMA allows measurement of the softening effects of polymers due to plasticization in various media and temperatures, which therefore allows a prediction of the materials behavior under in vivo conditions.

To allow reliable predictions of the softening of polymeric substrates for neural implants in an in vivo environment, it is important to have a reliable in vitro method. Here, the use of dynamic mechanical analysis in phosphate buffered saline at body temperature is presented.

Análise mecânica dinâmica ambiental para prever o comportamento de amaciamento de implantes neurais

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

Análise 3D de respostas multicelulares a gradientes Quimioatrativos

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in live-cell imaging and high-throughput microscopy techniques. This led to a constant increase in the amount and complexity of the microscopy data for a single experiment. Because manual analysis of microscopy data is very time consuming, subjective, and prohibits quantitative analyses, automation of bioimage analysis is becoming almost unavoidable. We built an informatics workflow called Substructure Analyzer to fully automate signal analysis in bioimages from fluorescent microscopy. This workflow is developed on the user-friendly open-source platform Icy and is completed by functionalities from ImageJ. It includes the pre-processing of images to improve the signal to noise ratio, the individual segmentation of cells (detection of cell boundaries) and the detection/quantification of cell bodies enriched in specific cell compartments. The main advantage of this workflow is to propose complex bio-imaging functionalities to users without image analysis expertise through a user-friendly interface. Moreover, it is highly modular and adapted to several issues from the characterization of nuclear/cytoplasmic translocation to the comparative analysis of different cell bodies in different cellular sub-structures. The functionality of this workflow is illustrated through the study of the Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) conditions. Data from fluorescence microscopy show that their integrity in human cells is impacted a few hours after the induction of OS. This effect is characterized by a decrease of coilin nucleation into characteristic Cajal Bodies, associated with a nucleoplasmic redistribution of coilin into an increased number of smaller foci. The central role of coilin in the exchange between CB components and the surrounding nucleoplasm suggests that OS induced redistribution of coilin could affect the composition and the functionality of Cajal Bodies.

We present a freely available workflow built for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in specific cell compartments in fluorescence microscopy images. This user-friendly workflow is designed on the open-source software Icy and also uses ImageJ functionalities. The pipeline is affordable without knowledge in image analysis.

Analisador de subestrutura: Um fluxo de trabalho fácil de usar para exploração rápida e análise precisa de corpos celulares em imagens de microscopia de fluorescência

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized in vitro stretching methods. Various available systems use 2D substrate-based stretchers, while the accessibility of 3D techniques to strain soft hydrogels, is more restricted. Here, we describe a method that allows external stretching of soft hydrogels from their circumference, using an elastic silicone strip as the sample carrier. The stretching system utilized in this protocol is constructed from 3D-printed parts and low-cost electronics, making it simple and easy to replicate in other labs. The experimental process begins with polymerizing thick (&#62;100 &#956;m) soft fibrin hydrogels (Elastic Modulus of ~100 Pa) in a cut-out at the center of a silicone strip. Silicone-gel constructs are then attached to the printed-stretching device and placed on the confocal microscope stage. Under live microscopy the stretching device is activated, and the gels are imaged at various stretch magnitudes. Image processing is then used to quantify the resulting gel deformations, demonstrating relatively homogenous strains and fiber alignment throughout the gel&#8217;s 3D thickness (Z-axis). Advantages of this method include the ability to strain extremely soft hydrogels in 3D while executing in situ microscopy, and the freedom to manipulate the geometry and size of the sample according to the user&#8217;s needs. Additionally, with proper adaptation, this method can be used to stretch other types of hydrogels (e.g., collagen, polyacrylamide or polyethylene glycol) and can allow for analysis of cells and tissue response to external forces under more biomimetic 3D conditions.

The presented method involves uniaxial stretching of 3D soft hydrogels embedded in silicone rubber while allowing live confocal microscopy. Characterization of the external and internal hydrogel strains as well as fiber alignment are demonstrated. The device and protocol developed can assess the response of cells to various strain regimes.

Tensão controlada de hidrogéis 3D sob imagem de microscopia ao vivo

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...