Este trabalho foi apoiado pelo Suporte Governo sob Grant No. EPS-0903795 concedidas pela Fundação Nacional de Ciência, NIH NIDCR R01-DE019355 (MJY PI), e Grant 8P20 GM103444 (YM PI).

1. Preparação de gelatina substrato contendo for Three-Dimensional bioprinting de hidrogéis de alginato <ol><li> Prepara-se o substrato de cálcio / gelatina seguindo o método do substrato de cálcio / gelatina descrita por Pataky et al 11 para evitar a viabilidade reduzida associada com alto teor. O método de substrato de cálcio / gelatina é listado abaixo. <ol><li> Combinar cloreto de cálcio di-hidratado (1,5% em peso), de cloreto de sódio (0,9% em peso), e gelatina porcina (2% em peso) em água destilada e ferver durante 2 minutos para criar uma solução de gelatina a 100 mM. </li></ol></li><li> Pour 5 ml da solução de gelatina / cálcio em 100 mm placas de petri padrão, agite a solução volta para ter um revestimento uniforme sobre a superfície, e o lugar sobre uma superfície plana no frigorífico de gel de O / N (permitir a gel, pelo menos, 8 hr antes de usar). </li><li> Para aumentar a opacidade da superfície do substrato, adicionar dióxido de titânio (0,3% em peso) para o / CaCl2 solução de gelatina. Agita-se durante 10 min. Autoclave a solução de gelatina / TiO 2 no ciclo de líquidos durante 30 min para esterilizá-lo. <ol><li> Adicionar 3 ml de o / TiO2 solução de gelatina para a superfície das placas de gelatina preparados anteriormente. Agite a mistura para garantir que ele é espalhado uniformemente por toda a superfície. Deixa-se em gel a 4 ° C frigorífico S / N (permitir a gel, pelo menos, 8 horas antes da utilização). Os substratos deve ser utilizado no prazo de 3 dias. </li></ol></li></ol> 2. O alginato Oxidação <ol><li> Oxidar o bioink alginato de sódio seguindo o método de alginato parcialmente oxidado por Bouhadir et al 30 descrito abaixo. <ol><li> Para fazer uma solução de alginato oxidado 5%, dissolve-se 1 g de alginato de sódio em 100 ml de água destilada. Adicionar uma solução aquosa de periodato de sódio (0,25 M, 0,25 mmol), o agente de oxidação, para produzir uma solução 5% de oxidação. Agita-se durante 19 horas à temperatura ambiente. Adicionar 40 ml de etileno-glicol à solução depois de 24 horas para acabar o Reaction. </li><li> Dissolve-se 2,5 g de cloreto de sódio na solução. Adicionar uma quantidade em excesso de álcool etílico (2: 1) para precipitar os alginatos oxidados. Centrifugar a solução a 1.000 x g para recolher os precipitados e re-dissolve-los em água destilada. Repita a lavagem de etanol. </li><li> Liofilizar as pelotas de alginato oxidados e armazenar a -20 ° C até estar pronto para utilização. </li></ol></li><li> Determinar o grau de oxidação através da medição da percentagem de periodato de sódio, antes de ser consumido terminada pela etileno glicol. <ol><li> Prepara-se uma solução de iodeto de potássio (20% w / v, tampão de fosfato pH 7,0 de sódio) e uma solução thyodene (10% w / v, tampão de fosfato de sódio pH 7,0). Misturar as duas soluções com o alginato oxidado à TA. </li><li> Cair gradualmente a solução de periodato de alginato de sódio e reagiu na mistura de soluções de iodeto de potássio e theodyne. Medir a absorvância da mistura a 426 nm espectrofotometricamente. Quando se atingiu ummáxima, registrar o volume utilizado de solução de periodato de alginato de sódio e como V 1. </li><li> A reacção é <img alt="Equação 1" fo:content-width="0.8in" src="/files/ftp_upload/53156/53156eq1.jpg" width="120" /> . A quantidade de periodato de sódio que não reagiu é <img alt="Equação 1.5" fo:content-width="1.2in" src="/files/ftp_upload/53156/53156eq1.5.jpg" width="150" /></li><li> Subtrair a quantidade de periodato de sódio que não reagiu a partir da concentração inicial para determinar a quantidade de periodato de sódio consumido. Usando a fórmula anterior, determinar o grau de oxidação final do alginato. </li></ol></li></ol> 3. O alginato Peptide Conjugação <ol><li> Ligandos conjugados com uma sequência de arginina-glicina-aspartato exposta (péptido) para dentro do alginato oxidado previamente preparado seguindo o método de conjugação de RGD por Alginato Rowley et al 31 descrito abaixo para promover a adesão e espalhamento. </li><li> Use carbod aquosaquímica iimide com G 4 RGDSPto conjugado 31. </li><li> Dissolve-se 1 g de 5% de alginato oxidado em um 0,1 M de 2- (N-morfolino) etanossulfónico (MES), pH = 4. Adicionar 1-etil- (dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC, 0,54 mmol) e N-hidroxissuccinimida ( NHS, 0,27 mmol) a 2: 1 para formar a amida intermediária. </li><li> Adicionar 0,28 mmol de péptido, para acoplamento a espinha dorsal do polímero através de alginato a amina terminal. Agita-se à temperatura ambiente O / N. </li><li> Parar a reacção de acoplamento por adição de cloreto de sódio a 2,5 g para a solução. Adicionar uma quantidade em excesso de álcool etílico (2: 1) para precipitar os alginatos oxidados. Centrifugar a mistura a 4000 xg durante 5 min para recolher os precipitados. Aspirar a mídia na capa de cultura de células e re-dissolver os precipitados em água destilada. Repita a lavagem de etanol. </li><li> Liofilizar os precipitados até que se torne completamente secas (aparecerá como uma substância em pó branca) e armazenar na temperatura de -20 ° C frigorífico para mais tardeusar. </li></ol> 4. adiposo humano estromais Tissue células de cultura celular (de hADSC) <ol><li> Culturas adiposo humano de células estromais de tecido (de hADSC) em 75 cm tratados frascos de cultura de células (frascos T75), coberto com 15 ml de baixo DMEM de glucose com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina, 1% de glutamina, e 1% antimicina. Alterar a mídia, na capa de cultura de células, a cada dois dias até que tenham atingido a confluência (80-90%). </li><li> Uma vez confluentes, as transferir para frascos T75 a capa de cultura de células e suspender o hADSC utilizando o método de digestão com enzimas de tripsina. <ol><li> Na capa, aspirar todo o meio de cultura de células fora das células. Lavar com 5 ml de fosfato de Dulbecco com Solução Salina Tamponada com cálcio e magnésio (DPBS ++). Aspirar o DPBS ++ fora das células. </li><li> Enquanto no capô, fazer uma solução de tripsina e DPBS ++ pela mistura de 1 ml de tripsina e 4 ml DPBS ++. Cada frasco de 5 ml de requer a solutde iões, assim que o volume apropriado para o número de frascos confluentes. Adicionar 5 ml de tripsina / ++ DPBS a cada frasco e colocá-los na incubadora durante 2 min. </li><li> Após 2 min, retire os frascos e bata levemente os lados deles para soltar as células a partir do fundo. Veja cada frasco sob um microscópio para garantir que as células são suspensas. Colocar os frascos de volta no capuz de cultura de células e adicionar 3 ml de meio de cultura celular adequado a cada frasco. Isto termina a reacção de tripsina. </li><li> Transfira a mídia celular carregado de cada frasco e colocar em um cônico de 50 ml. Centrifugar a 1.000 xg los durante 5 min. As células devem aparecer como um pequeno sedimento branco no fundo do cone. Transferência de volta para a capa de cultura de células e aspirar a mídia. Ressuspender as células em 2 ml de meio de cultura celular. </li><li> Contar as células utilizando um hemocitómetro sob o microscópio. Uma vez que as células foram contadas, na capa de cultura, a quantidade aliquota de meio contendo ~ 1,3 million células e transferência para um cônico de 15 ml. Centrifugar a cónico de 15 ml contendo as células mais uma vez durante 5 min a 1000 x g. </li><li> Na capa de cultura, propagar novamente as células restantes em vários frascos T-75, a adição de uma concentração de ~ 350.000 células de cada frasco. Adicionar 15 ml de meio DMEM e retornar à incubadora até confluente novamente. </li><li> Uma vez que o ciclo de centrifugação é completa, o regresso cónico de 15 ml para a cultura de células. Aspirar a mídia do pellet celular e resuspender as células em solução aquosa de alginato a uma concentração de 1,3 milhões de células por mililitro de bioink, terteriating a solução muitas vezes para que haja uma distribuição homogênea de células de todo o bioink. Coloque a solução de células-laden em um estéril seringa de 3 ml e impressora compatível com o parafuso na estéril 22 G ponta de plástico. </li></ol></li></ol> 5. Configuração bioprinter <ol><li> Ligue o bioprinter, cada um dos computadores de dispensador, e o recirculating banho de água. <ol><li> Definir manualmente a temperatura do banho de recirculação de água para para o mecanismo de gelificação. </li><li> Manualmente definir parâmetros de impressão para cada distribuidor no computador correlacionando distribuidor. Definir o volume de distribuição a 230 nl, número de backsteps a 0, e a taxa de distribuição de 10 ul -sec. </li></ol></li><li> Abra o software de projeto e do programa para a visualização de visor da câmera USB no computador. <ol><li> Usando o software, insira manualmente as coordenadas para uma matriz de 5 x 5 dot com 2,4 mm de espaçamento entre as quedas. </li><li> Defina os parâmetros de impressão a ser: distância entre a extremidade da ponta e da superfície do substrato = 0,1 mm; altura seringa é levantada entre as deposições = 20 mm; a quantidade de tempo por deposição = 1 seg. </li><li> Salve o programa e enviá-lo para o robô. </li></ol></li><li> Colocar a cápsula de gelatina / TiO2 molecular contendo Petri na etapa 4 ° C impressora. Feche e tranque a porta da câmara. </li><li> Use o PLC para initialize as fontes de luz ultravioleta, e esterilizar a câmara durante 90 seg. </li><li> Uma vez que a esterilização é completa, abrir a câmara e carregar a seringa contendo de hADSC suspenso em alginato em Gun 1. Feche e tranque a porta da câmara. </li><li> Use o PLC para ligar o sistema de ventilação, espere 30 segundos para a pressão interna equilíbrio. </li><li> No computador, execute o programa que contém os parâmetros de impressão via e geométricas. </li><li> Durante todo o processo de impressão, visualizar o visor da câmera USB no computador para confirmar a impressão precisa e uniforme. </li><li> Uma vez que a impressão terminar, deixe as construções de gel durante 40 min. </li></ol> Avaliação de Viabilidade 6. celular <ol><li> Cubra as construções que não estão indo a ser trabalhada imediatamente pós-impressão em DMEM e guarde na incubadora até à hora de imagem. </li><li> Para quantificar a viabilidade das construções, mancha-los utilizando um ensaio de viabilidade / citotoxicidade fluorescente à base, umaimagem nd usando microscopia confocal. <ol><li> Seguindo as instruções do kit, preparar uma solução de coloração contendo calceina AM e homodimero de etidio-1. Para fazer 10 ml de solução de coloração, adicionar 20 ul da etídio homodímero-1 e 5 ul de calceína am a 10 ml de solução estéril, tamponada com fosfato salino de cultura de tecidos de grau de Dulbecco (+ magnésio, + cálcio; DPBS ++). </li><li> Mergulhar os construtos bioprinted na solução de coloração, durante 15 minutos no escuro. </li><li> Imagem as construções coradas utilizando um sistema de microscópio confocal nos dias 0 e 8. Tire várias fotos de cada construção bioprinted, usando parâmetros Z-stack de 30 fatias ópticos sobre uma profundidade de 300 mm, e contar manualmente as células. Se as células aparecem amarelo ou contá-los como verde vivo, e se vermelho, contá-los como mortos. </li></ol></li><li> Calcula-se a percentagem de viabilidade celular, como o número de células vivas a dividir pelo número total de células na construção; Viabilidade celular = número decélulas vivas (verde + amarelo) / número de células totais (verde + amarelo + vermelho) x 100%. </li><li> Calcula-se a quantidade de proliferação de células para cada amostra como o número de células do dia 8, dividido pelo número de células no dia 0; Proliferação celular = contagem de células vivas no dia 8 / células vivas contar no dia 0 x 100%. </li></ol> 7. RGD Peptide Análise Conjugação <ol><li> Para analisar o sucesso de RGD peptídeo conjugação com o alginato, compare alginato RGD-conjugado e alginato não conjugado. Para fazer isso, as construções de imagem impressos utilizando (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole, dicloridrato) (DAPI) e faloidina manchas. <ol><li> Adicione os phalloidins solução de trabalho por diluição de 5 ul da solução-mãe metanólica com 200 mL de DPBS ++. Armazenar a -20 ° C até o uso. </li><li> Adicione uma solução de 300 uM de estoque a mancha DAPI seguinte equação: (0,10509 g / L) / (350,3 g / mol) = 3 × 10 -4 M = 0,0003 M = 0,300 mm = 300 uM. Faça the DAPI solução de trabalho por diluição da solução-mãe de 1: 100 em DPBS ++ para se obter 3 uM solução. Armazenar a -20 ° C até o uso. </li></ol></li><li> Completamente imersa a amostra em paraformaldeído a 4%. Incubar durante 1 h à TA. Lavar três vezes com DPBS ++, permitindo que a solução em repouso durante 5 min cada lavagem. Transfira a amostra em gel a partir do bem para uma lâmina de vidro, que lança sobre o gel no processo. Mergulha-se o gel em 0,1% de Triton X-100 (0,1 g / 100 ml) em DPBS ++ durante 10 min. Lavar três vezes com DPBS ++, permitindo 5 minutos para cada lavagem. </li><li> Corar as construções impressas com faloidina por imersão na solução de trabalho. Cubra com papel alumínio e incubar durante 4 horas. Remover a mancha faloidina e lavar três vezes com DPBS ++. A primeira lavagem deve ser rápido, o último lavagens deve sentar-se durante 5 minutos cada. </li><li> Corar as construções impressas com DAPI por imersão na solução de trabalho DAPI. Cubra com folha e incubar à TA durante 30 min. lavagemtrês vezes com DPBS ++, permitindo que cada lavagem para se sentar por 5 min. Observe e imagem das amostras em um sistema de microscópio confocal. </li></ol>

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V., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Bioprinting+of+Tissues+and+Organs.">3D Bioprinting of Tissues and Organs.</a> Nat Biotech. 32 (8), 773-785 (2014).</li><li>Jia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Alginate+as+Bioink+for+Bioprinting.">Engineering Alginate as Bioink for Bioprinting.</a> Acta Biomaterialia. 10 (10), 4323-4331 (2014).</li><li>Forty, R. A., Steinberg, M. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+Scaffolds+for+Tissue+Engineering:+Progress+and+Challenges.">Hydrogel Scaffolds for Tissue Engineering: Progress and Challenges.</a> Global Cardiology Science, &amp; Practice. 3 (38), 316-342 (2013).</li><li>Smith, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three&#8211;Dimensional+BioAssembly+Tool+for+Generating+Viable+Tissue-Engineered+Constructs.">Three&#8211;Dimensional BioAssembly Tool for Generating Viable Tissue-Engineered Constructs.</a> Tissue Engineering. 10 (9&#8211;10), 1566-1576 (2004).</li><li>Ozbolat, I. T., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+&#8216;Multi-arm+Bioprinter&#8217;+for+Hybrid+Fabrication+of+Tissue+Engineering+Constructs.">Development of a &#8216;Multi-arm Bioprinter&#8217; for Hybrid Fabrication of Tissue Engineering Constructs.</a> Robotics and Computer&#8211;Integrated Manufacturing. 30 (3), 295-304 (2014).</li><li>Kolesky, D. B., Truby, R. L., Gladman, A. S., Busbee, T. A., Homan, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Bioprinting+of+Vascularized,+Heterogeneous+Cell&#8211;Laden+Tissue+Constructs.+Adv+Mater.+X.">Three-Dimensional Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell&#8211;Laden Tissue Constructs. Adv Mater. X.</a> Adv Mater. X, x-y (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

O foco principal da engenharia de tecidos é fazer a ponte entre a escassez de órgãos e necessidades de transplante através do desenvolvimento de substitutos biológicos capazes de restaurar, manter ou melhorar a functio tecido nativo. Isto levou à fabricação directa de andaimes com um complexo, geometria externa anatomicamente correcto, e o controlo preciso sobre a geometr interna. Bioprinting tridimensional é um método utilizado para gerar as construções tridimensionais de vários tamanhos e formas a partir ...

A engenharia de tecidos utiliza os princípios da biologia e da engenharia, no desenvolvimento de substitutos funcionais para manter, restaurar ou melhorar tecido nativo e. A capacidade de gerar construtos biomiméticos tridimensionais na demanda facilitaria avanços científicos e tecnológicos na engenharia de tecidos, bem como em sensores baseados em celulares, drogas / triagem toxicidade, modelos de tecido ou tumor, e outros. A organização tridimensional das construções da engenharia de tecidos é um componente fundamental do método de fabrico, porque ele deve imitar de perto a interacção altamente organizado de células e matriz extracelular no tecido nativo. Andaimes tridimensionais biodegradável e formando-forma são factores críticos para a geração de novas construções de tecido porque as células migram para formar uma camada bidimensional de células, mas não têm a capacidade para crescer em favorecida tridimensional. O andaime serve como base temporária para celularadesão e proliferação, por isso deve ser construído a partir de materiais com porosidade controlada e biodegradabilidade, e integrit mecânica suficiente. Os materiais de andaime não deve ser citotóxico ou criar uma resposta adversa do anfitrião. Os hidrogeles têm sido vulgarmente utilizados nas técnicas de engenharia de tecidos, e devido à sua hidrofilicidade, os hidrogéis de permitir o intercâmbio de fluido e gás em toda a estruturação. Ao combinar diferentes hidrogéis, as propriedades do hidrogel sintetizado são modificáveis ​​para cumprir a exigência de aplicação distinta. A abordagem de engenharia de tecidos convencional envolve a criação de andaimes de sacrifício porosas acelular que são semeadas com células pós-fabricatio. Têm sido empregues várias técnicas, tais como colagem de fibras, moldagem com solvente, e derreter moldagem, mas provou ser bem sucedida minimamente para aplicações de engenharia de tecidos. Métodos de fibra de ligação permitem que as fibras sejam alinhadas em formatos específicos, mas eles só são capazes de pródução muito fina andaime. Métodos de evaporação de solvente produziu construções altamente porosos, no entanto, a maior membrana produzida foi de apenas 3 mm thic. Por conseguinte, a criação de estruturas tridimensionais não é possível utilizar estas técnicas. Técnicas de moldagem Melt foi bem sucedida na produção de suportes tridimensionais, mas tais temperaturas elevadas que são necessários materiais biológicos não pode ser incorporado durante o proces produção. Andaimes semeado pós-fabricação são limitados em sua capacidade de atender aos requisitos de engenharia de tecidos para produzir scaffolds tridimensionais com microestruturas pré-definidos ou controláveis ​​e. Outro grande problema com tecnologias andaime de semeadura sólidos é a deficiência de vascularização e pobres mecânica. Bioprinting foi estendida para três dimensões através da utilização de não-tóxicos e biodegradáveis, geles termo-reversíveis de superar as desvantagens do convencional. Alguns do sólido freeform fabricação techniques atualmente sendo empregadas são bioprinting e jato de tinta de impressão laser-assistida. Técnicas bioprinting assistida por laser pulsado utilizar uma fonte de laser, uma placa de destino, e um substrato de recepção para gerar tridimensional. No entanto, esta técnica é limitada devido à baixa taxa de transferência, a viabilidade celular baixa, e só pode produzir arranjos limitadas de estruturas fabricadas, porque apenas pré-polímeros foto-reticulável pode ser utilizado para formar um hidrogel reticulado. Impressão de jacto de tinta foi desenvolvido como um método não-contacto, que reproduz os dados de imagem digitais sobre um substrato por deposição de tinta picolitros. No entanto, a impressão a jacto de tinta não produzir uma construção de alta resolução, constrói experiência rápida desnaturação da proteína, e muitas das células são lisadas durante a deposição. Atualmente, têm sido desenvolvidos novos métodos de fabricação aditiva bioprinting. Nestes sistemas de células, proteínas, factores de crescimento, e os hidrogéis são tipicamente integrados biomiméticos para mater matrizIALS durante o processo de fabricação e simultaneamente depositados utilizando atuadores controlados por computador para gerar estruturas celulares carregados tridimensionais à base de andaime que imitam de perto a microarquitetura de natal. Os hidrogéis de células carregados de constituir o bioink, que pode ser heterogéneo, que consiste em vários tipos de células, ou homogénea. Aditivo sistemas de manufatura depósito bioink gota-a-gota ou camada por camada através de seringas descartáveis ​​e dicas para um palco controlado por computador capaz de se mover nas direções x, ye z. Através de um software de computador, a arquitectura de andaimes impressos pode ser facilmente manipulado, dependendo dos requisitos da aplicação. Ao contrário das técnicas convencionais, tecnologias médicas tridimensionais (ressonância magnética, tomografia computadorizada) podem ser incorporados aos desenhos, gerando construção específica para cada paciente. Estes métodos permitem também a possibilidade de produzir substituições vascularizados porque construções são produzidos com um elevado ldensidade celular ocal, permitindo interacções célula-célula e melhorar a probabilidade de pós-implantação surviva. A impressora Palmetto é um sistema multi-dispenser tridimensional personalizado construído que usa métodos de fabricação programáveis ​​robóticos para gerar construções de tecido heterogêneos tridimensionais (Figura 1). Ele permite a utilização de uma pluralidade de materiais em combinações únicas para produzir estruturas heterogéneas. A inicialização do bioprinter é um dos passos mais importantes na bioprinting porque permite que você para definir uma variedade de parâmetros para otimizar a capacidade de impressão das construções bioprinted. O bioprinter compreende um processo tipo de lote com sequências de arranque, operação e encerramento controlado por um controlador lógico programável (PLC), que o usuário opera por meio de um painel de controle de tela interativa sensível ao toque (Figura 1, A). Para evitar a contaminação dos biomateriais lógicos a bioprinter é encerrado em um poli-pressionados positivamente (metacrilato de metilo) (PMMA) com uma câmara de partículas arrestance de elevada eficiência (HEPA) filtrado por sistema de circulação de ar (Figura 1, B, C). O interior da impressora pode ser esterilizada utilizando as fontes de luz ultravioleta embutidos (Figura 1, D). O componente central do bioprinter é um posicionamento robô programável que pode totalmente reprodutível colocar uma ponta conta-gotas com uma precisão de 10 micrometros (Figura 1, E). Existem três distribuidores, os quais são capazes de depositar volumes tão pequenos como 230 nl, utilizando um parafuso rotativo (Figura 1, F). Eles são independentemente programável usando computadores diferentes que regem os parâmetros de impressão para cada distribuidor (figura 1, G). Rotativa de parafuso de distribuição utiliza a rotação de um parafuso motorizado para mover para baixo bioink uma seringa e para fora da ponta da seringa. Estes distribuidores são montados em um pneumáticoNest Ferramenta LY controlada (Figura 2A, B), permitindo que o robô para alternar distribuidor montada sobre o braço robótico do eixo Z sob controlo programado (Figura 1, H). O robô XYZ recebe instruções de impressão a partir de um computador que executa o software de desenho (Figura 1, I). Cada programa contém os locais de distribuição, rotinas e protocolos de calibração, dispensador de mudança. O desenho das construções gerados essencialmente consiste na coordenadas XYZ, onde cada dispensador vai depositar material. O bioprinter compreende dois sensores de luz ópticos (Figura 2C) que determinam a coordenadas XYZ da extremidade da ponta da seringa. Estes sensores enviam informações para coordenar o robô, que os utiliza para calcular as posições das extremidades ponta distribuidor. Há um laser de deslocamento adicional (Figura 2D) que projeta um diodo 633 nm feixe de laser vermelho de tamanho de ponto 30 x 100 micrômetros para medir a distância com um accuracy de 0,1 micrómetros. Quando o feixe está altamente focada o robô determina a distância Z da superfície de impressão. Esta medida, ea medida sensores de luz óptica da extremidade da ponta em Z, permite o cálculo de Z coordenadas precisas usada para colocar a ponta do aplicador em relação à superfície de impressão. As pontas do distribuidor mover-se lateralmente e verticalmente através do sensor de luz óptica X-eixo orientado para localizar os centros de Y e Z, e lateralmente por meio de um sensor do eixo Y para encontrar o centro do eixo-X. A superfície de impressão é mapeado utilizando a fórmula para uma superfície plana no espaço XYZ: ax + by + cz = d para determinar onde a superfície é em relação à posição da extremidade da ponta de distribuição. A fase de impressão (Figura 1, J) contém uma amostra de uma placa de Petri até 80 mm de diâmetro e utiliza um banho de água com recirculação para manter a temperatura definida (Figura 1, K). Temperatura estágio pode ser ajustado dentro de uma gama de -20 e permanece estável dentro. Há uma câmera USB montadopara o Z-braço robô para proporcionar uma vista ampliada da ponta de aplicação durante o processo de impressão (figura 1, G). Há uma segunda câmara montada na direcção do topo do interior da câmara, que fornece uma visão completa do bioprinter durante o processo de impressão (figura 1, G). Um software de desenho auxiliado por computador determina o padrão de deposição e permite ao usuário gerar gotículas espaçadas de forma incremental e estruturas complexas (Figura 3). Vias tridimensionais pode ser codificado manualmente no software de desenho de impressora compatível ou importados de um software separado auxiliado por computador desenho (Figura 4, Tabela 1). O software da impressora compatível permite variações de parâmetros de impressão, tais como o método de deposição (deposição ou deposição de gotícula única passagem contínua), a geometria tridimensional das vias, a taxa de deposição, distância entre a extremidade da ponta da seringa e substtaxa de superfície de impressão, a quantidade de tempo para depositar uma gota indivíduo, e a altura e acelerar a seringa é levantada entre a deposição das gotas. Cada programa contém XYZ locais de distribuição, rotinas de calibração ponta e protocolos de dispensador de mudança para proporcionar um ambiente estéril, sem intervenção do operador, durante a impressão. O controlador lógico programável (PLC) do robô recebe instruções do computador que executa o software de desenho e controla o tempo dos eventos dos controladores externos (por exemplo, os distribuidores). Para fazer isso, o PLC utiliza um mecanismo de loop para controlar os dispensadores , dispositivo de posicionamento robótico, e fatores ambientais. Tridimensional bioprinting e gravação directa utilizando um parafuso rotativo, sistema de distribuição de líquido permite que o processo de depósito de células para ser mais eficiente, precisa e mais fácil do que métodos anteriores. Este estudo mostra a bioprinter personalizado construído é capaz de gerar ceconstruções de hidrogel ll-carregado com alta viabilidade celular.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Positioning Robot (JR2000 XYZ)</td>
			<td>Janome&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispensers: SDAV Linear Drive SmartDispensers</td>
			<td>Fishman Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Light Sensors:&#160;</td>
			<td>Keyensce</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Displacement Laser: OD Mini</td>
			<td>SICK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recirculating Water Bath: Polystat</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-12122-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Cameras: Dino-Lite Premier 5MP</td>
			<td>AnMo Electrionics/YSC Technologies</td>
			<td>AD7013MT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Printer-Compatible Computer Design Software: JR-C Points</td>
			<td>Janome</td>
			<td></td>
			<td>Comes with purchase of Janome Robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer-Aided Design Drawing Software: Visual PathBuilder</td>
			<td>RatioServ</td>
			<td></td>
			<td>Can be downloaded at: www.ratioserv.com/index.php/downloads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Printer 3 cc Syringes:&#160;</td>
			<td>Fishman Corporation</td>
			<td>122051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 G Dispenser Tips</td>
			<td>Fishman Corporation</td>
			<td>Z520122&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9000-70-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium Dioxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13462-67-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protanal LF 20/40 Alginate (Sodium Alginate)</td>
			<td>FMC BioPolymer</td>
			<td>9005-38-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Glycol</td>
			<td>Mallinckrodt Baker, Inc</td>
			<td>9300-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Periodate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7790-28-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hADSC</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-5006</td>
			<td>Store in vials in liquid nitrogen until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5012</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>C3100MP</td>
			<td>Store in the dark at -80&#176;C until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Mammalian Viability Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>L-3224</td>
			<td>Store in the dark at -80&#176;C until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES Hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxysuccinimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>130672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-ethyl-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1769&#160;</td>
			<td>10 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline, +Calcium, +Magnesium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14040133</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline, -Calcium, -Magnesium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190144</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RGD Peptides</td>
			<td>International Peptides</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 Phalloidin Stain</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>A22283</td>
			<td>Store at -20&#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(4&#8217;, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) (DAPI) Stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>R37606</td>
			<td>Store at -20&#176;C until use</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

viability of bioprinted cellular constructs using a three dispenser cartesian printer

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.

Os resultados demonstram a bioprinter é capaz de depositar hidrogéis de células carregadas em localizações tridimensionais específicas com precisão e de forma consistente utilizando software auxiliado por computador. Estes softwares determinar a colocação de cada gotícula e controlar muitos dos parâmetros para a distribuição (Figura 3,4). A repetibilidade do bioprinter para depositar apropriadamente biomateriais é fundamental para o seu sucesso em aplicações de engenharia de tecidos. </p...

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Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.

Viabilidade de Bioprinted celulares Construções Usando uma impressora cartesiano Dispenser Três

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

viability-bioprinted-cellular-constructs-using-three-dispenser

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.9K visualizações.  Medical University of South Carolina. A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.

Vídeo: Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells behave differently when they are grown within a 3D extra-cellular matrix and also interact with other cells (1-5). Mouse models have been broadly utilized to study tissue morphogenesis in vivo. However mouse and human skin have significant differences in cellular architecture and physiology, which makes it difficult to extrapolate mouse studies to humans. Since melanocytes in mouse skin are mostly localized in hair follicles, they have distinct biological properties from those of humans, which locate primarily at the basal layer of the epidermis. The recent development of 3D human skin reconstruct models has enabled the field to investigate cell-matrix and cell-cell interactions between different cell types. The reconstructs consist of a "dermis" with fibroblasts embedded in a collagen I matrix, an "epidermis", which is comprised of stratified, differentiated keratinocytes and a functional basement membrane, which separates epidermis from dermis. Collagen provides scaffolding, nutrient delivery, and potential for cell-to-cell interaction. The 3D skin models incorporating melanocytic cells recapitulate natural features of melanocyte homeostasis and melanoma progression in human skin. As in vivo, melanocytes in reconstructed skin are localized at the basement membrane interspersed with basal layer keratinocytes. Melanoma cells exhibit the same characteristics reflecting the original tumor stage (RGP, VGP and metastatic melanoma cells) in vivo. Recently, dermal stem cells have been identified in the human dermis (6). These multi-potent stem cells can migrate to the epidermis and differentiate to melanocytes.

In this report, we describe the three-dimensional skin reconstruct model which mimics human skin in architecture and composition. Melanocyte physiology, melanoma progression and the fate of dermal stem cells have been investigated using the skin reconstruct model. The model is also useful as a preclinical tool for drug assessment.

A Pele Tridimensional Humanos Reconstruir Modelo: uma Ferramenta para o Estudo da Pele Normal e Progressão Melanoma

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Bioengenharia

Creating Transient Cell Membrane Pores Using a Standard Inkjet Printer

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor microfabrication.1-10 Recently, thermal inkjet printing has also been used for gene transfection.8,9 The thermal inkjet printing process was shown to temporarily disrupt the cell membranes without affecting cell viability. The transient pores in the membrane can be used to introduce molecules, which would otherwise be too large to pass through the membrane, into the cell cytoplasm.8,9,11
The application being demonstrated here is the use of thermal inkjet printing for the incorporation of fluorescently labeled g-actin monomers into cells. The advantage of using thermal ink-jet printing to inject molecules into cells is that the technique is relatively benign to cells.8, 12 Cell viability after printing has been shown to be similar to standard cell plating methods1,8. In addition, inkjet printing can process thousands of cells in minutes, which is much faster than manual microinjection. The pores created by printing have been shown to close within about two hours. However, there is a limit to the size of the pore created (~10 nm) with this printing technique, which limits the technique to injecting cells with small proteins and/or particles. 8,9,11
A standard HP DeskJet 500 printer was modified to allow for cell printing.3, 5, 8 The cover of the printer was removed and the paper feed mechanism was bypassed using a mechanical lever. A stage was created to allow for placement of microscope slides and coverslips directly under the print head. Ink cartridges were opened, the ink was removed and they were cleaned prior to use with cells. The printing pattern was created using standard drawing software, which then controlled the printer through a simple print command. 3T3 fibroblasts were grown to confluence, trypsinized, and then resuspended into phosphate buffered saline with soluble fluorescently labeled g-actin monomers. The cell suspension was pipetted into the ink cartridge and lines of cells were printed onto glass microscope cover slips. The live cells were imaged using fluorescence microscopy and actin was found throughout the cytoplasm. Incorporation of fluorescent actin into the cell allows for imaging of short-time cytoskeletal dynamics and is useful for a wide range of applications.13-15

A description of the methods used to convert an HP DeskJet 500 printer into a bioprinter. The printer is capable of processing living cells, which causes transient pores in the membrane. These pores can be utilized to incorporate small molecules, including fluorescent G-actin, into the printed cells.

Criando poros celulares transitórios membrana utilizando uma impressora jato de tinta padrão

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that MicroCT provides quantitative high-resolution three-dimensional (3D) anatomical data non-destructively and longitudinally. Most importantly, with the development of a novel preclinical iodinated contrast agent called eXIA160, functional and metabolic assessment of the heart became possible. However, prior to the advent of commercial MicroCT scanners equipped with X-ray flat-panel detector technology and easy-to-use cardio-respiratory gating, preclinical studies of cardiovascular disease (CVD) in small animals required a MicroCT technologist with advanced skills, and thus were impractical for widespread implementation. The goal of this work is to provide a practical guide to the use of the high-speed Quantum FX MicroCT system for comprehensive determination of myocardial global and regional function along with assessment of myocardial perfusion, metabolism and viability in healthy mice and in a cardiac ischemia mouse model induced by permanent occlusion of the left anterior descending coronary artery (LAD).

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

This method outlines the use of Quantum Micro-Computed Tomography (MicroCT) to assess cardiac morphology, function, perfusion, metabolism and viability with iodinated contrast agent in mice with experimentally-induced myocardial ischemia. The technique can be applied for non-destructive high-throughput longitudinal in vivo imaging of various animal models of human heart disease.

In Vivo quantitativa Avaliação da Estrutura do miocárdio, função, perfusão e viabilidade Usando Cardiac Micro-Tomografia Computadorizada

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.
Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues. 
Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

We describe a set of protocols that together provide a tissue-mimicking hydrogel bioink with which functional and viable 3-D tissue constructs can be bioprinted for use in in vitro screening applications.

Bioprinting celularizado Constrói Usando um específico do tecido Hidrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

Em camadas de alginato Constrói: Uma Plataforma para Co-cultura de populações de células heterogéneas

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Imaging Cell Viability on Non-transparent Scaffolds &#8212; Using the Example of a Novel Knitted Titanium Implant

Intervertebral disc degeneration and disc herniation is one of the major causes of lower back pain. Depletion of extracellular matrix, culminating in nucleus pulposus (NP) extrusion leads to intervertebral disc destruction. Currently available surgical treatments reduce the pain but do not restore the mechanical functionality of the spine. In order to preserve mechanical features of the spine, total disc or nucleus replacement thus became a wide interest. However, this arthroplasty era is still in an immature state, since none of the existing products have been clinically evaluated.
This study intends to test the biocompatibility of a novel nucleus implant made of knitted titanium wires. Despite all mechanical advantages, the material has its limits for conventional optical analysis as the resulting implant is non-transparent. Here we present a strategy that describes in vitro visualization, tracking and viability testing of osteochondro-progenitor cells on the scaffold. This protocol can be used to visualize the efficiency of the cleaning protocol as well as to investigate the biocompatibility of these and other non-transparent scaffolds. Furthermore, this protocol can be used to show adherence pattern of cells as well as cell viability and proliferation rates on/in the scaffold. This in vitro biocompatibility testing assay provides a propitious tool to analyze cell-material interaction in non-transparent and opaque scaffolds.

Imaging Cell Viability on Non-transparent Scaffolds &amp;#8212; Using the Example of a Novel Knitted Titanium Implant

Here we present a fluorophore based imaging technique to detect cell viability on a non-transparent titanium scaffold as well as to detect glimpses of the scaffold impurities. This protocol troubleshoots the drawback of imaging cell-cell or cell-metal interactions on non-transparent scaffolds.

Viabilidade imagens de células em Scaffolds não-transparentes - usando o exemplo de um Titanium Implant Novel malha

Intervertebral disc degeneration and disc herniation is one of the major causes of lower back pain. Depletion of extracellular matrix, culminating in ...

Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, and translation of findings is often poor. Thus, there is ample opportunity for alternative experimental approaches. Here we present an approach in which human cells are isolated from human anterior cruciate ligament tissue remnants, expanded in culture, and used to form engineered ligaments. Exercise alters the biochemical milieu in the blood such that the function of many tissues, organs and bodily processes are improved. In this experiment, ligament construct culture media was supplemented with experimental human serum that has been &#39;conditioned&#39; by exercise. Thus the intervention is more biologically relevant since an experimental tissue is exposed to the full endogenous biochemical milieu, including binding proteins and adjunct compounds that may be altered in tandem with the activity of an unknown agent of interest. After treatment, engineered ligaments can be analyzed for mechanical function, collagen content, morphology, and cellular biochemistry. Overall, there are four major advantages versus traditional monolayer culture and animal models, of the physiological model of ligament tissue that is presented here. First, ligament constructs are three-dimensional, allowing for mechanical properties (i.e., function) such as ultimate tensile stress, maximal tensile load, and modulus, to be quantified. Second, the enthesis, the interface between boney and sinew elements, can be examined in detail and within functional context. Third, preparing media with post-exercise serum allows for the effects of the exercise-induced biochemical milieu, which is responsible for the wide range of health benefits of exercise, to be investigated in an unbiased manner. Finally, this experimental model advances scientific research in a humane and ethical manner by replacing the use of animals, a core mandate of the National Institutes of Health, the Center for Disease Control, and the Food and Drug Administration.

We present a model of ligament tissue in which three-dimensional constructs are treated with the human exercise-conditioned serum and analyzed for collagen content, function, and cellular biochemistry.

Tratamento de Estruturas Ligamentares com Soro Condicionado por Exercício: Um Modelo Translacional de Engenharia de Tecidos

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

Fabricação de uma matriz de microambiente celular Artificial multiplexado

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic respiration. However, the extent to which both pathways contribute to the landscape of cellular energy production is consistently overlooked. Transformed cells cultured in saturating levels of glucose often show a decreased dependency on oxidative phosphorylation for ATP production, which is compensated by an increase in substrate-level phosphorylation. This shift in metabolic poise allows cells to proliferate despite the presence of mitochondrial toxins. In neglecting the altered metabolic poise of transformed cells, results from a pharmaceutical screening may be misinterpreted since the potentially mitotoxic effects may not be detected using model cell lines cultured in the presence of high glucose concentrations. This protocol describes the pairing of two powerful techniques, respirometry and calorimetry, which allows for the quantitative and noninvasive assessment of both aerobic and anaerobic contributions to cellular ATP production. Both aerobic and anaerobic respirations generate heat, which can be monitored via calorimetry. Meanwhile, measuring the rate of oxygen consumption can assess the extent of aerobic respiration. When both heat dissipation and oxygen consumption are measured simultaneously, the calorespirometric ratio can be determined. The experimentally obtained value can then be compared to the theoretical oxycaloric equivalent and the extent of the anaerobic respiration can be judged. Thus, calorespirometry provides a unique method to analyze a wide range of biological questions, including drug development, microbial growth, and fundamental bioenergetics under both normoxic and hypoxic conditions.

This protocol describes calorespirometry, the direct and simultaneous measurement of both heat dissipation and respiration, which provides a noninvasive approach to assess energy metabolism. This technique is used to assess the contribution of both aerobic and anaerobic pathways to energy utilization by monitoring the total cellular energy flow.

Calorespirometry: Uma abordagem poderosa, não-invasiva para investigar o metabolismo energético celular

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

Design of an Open-Source, Low-Cost Bioink and Food Melt Extrusion 3D Printer

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling costs. This increasing popularity is partly driven by falling barriers to entry such as system set-up costs and ease of operation. The following protocol presents the design and construction of an Additive Manufacturing Melt Extrusion (ADDME) 3D printer for the fabrication of custom parts and components. ADDME has been designed with a combination of 3D-printed, laser-cut, and online-sourced components. The protocol is arranged into easy-to-follow sections, with detailed diagrams and parts lists under the headings of framing, y-axis and bed, x-axis, extrusion, electronics, and software. The performance of ADDME is evaluated through extrusion testing and 3D printing of complex objects using viscous cream, chocolate, and Pluronic F-127 (a model for bioinks). The results indicate that ADDME is a capable platform for the fabrication of materials and constructs for use in a wide range of industries. The combination of detailed diagrams and video content facilitates access to low-cost, easy-to-operate equipment for individuals interested in 3D printing of complex objects from a wide range of materials.

The aim of this work is to design and construct a reservoir-based melt extrusion three-dimensional printer made from open-source and low-cost components for applications in the biomedical and food printing industries.

Design de uma impressora 3D de origem aberta, bioink de baixo custo e derretimento de alimentos

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling ...