Nosso protocolo permite que os pesquisadores gerem redes hierárquicas de vasos dentro de um retalho totalmente projetado e implantável, o que abriu caminho para novos estudos sobre o comportamento dos vasos sanguíneos sob integração in vivo. Esta técnica combinou a versatilidade de duas tecnologias de impressão 3D para criar e montar vasos na micro e mesoescala que podem ser diretamente anastomosados com vasos hospedeiros usando microcirurgia. Retalhos vascularizados totalmente projetados podem ser usados para tratar grandes defeitos teciduais, bem como para fornecer uma plataforma para estudar desenvolvimentos teciduais e integração.
Os métodos propostos podem ser estendidos para estudar a incorporação de células específicas do tecido, bem como avaliar o uso de diferentes materiais de bioink e suporte. Comece preenchendo o molde BVOH com 30 microliters da solução de polímero. Centrifugar o molde a 100 vezes g por 2 minutos e cubra o molde com mais 20 microliters da solução de polímero para garantir o enchimento completo.
Congele os moldes preenchidos a menos 80 graus Celsius por pelo menos 30 minutos para garantir que toda a solução de polímero congele. Remova o solvente dos moldes liofilizando-os durante a noite. Para remover o material de molde sacrificial, transfira os moldes após o processo de secagem congelante para um banho de água deionizado de 5 litros sob agitação suave.
Substitua a água no banho quando ficar nublado. Quando todo o BVOH se dissolver, seque os andaimes e armazene-os em uma câmara de vácuo até usar. Transfira aproximadamente 4 mililitros do material de suporte preparado e compactado em cada poço de uma placa de 12 poços usando uma pipeta de deslocamento positiva.
Toque na placa do poço em uma superfície dura para forçar o material de suporte a se espalhar uniformemente no poço. Prepare uma suspensão contendo 2 milhões de CÉLULAS-TRONCO HAMEC-ZsGreen e 6 milhões de células-tronco de polpa dentária em 10 mililitros de meio de células endoteliais. Centrifugar a suspensão celular a 200 vezes g por 4 minutos para obter uma pelota celular, em seguida, aspirar o meio supernante e resuspencar a pelota celular em 1 mililitro de bioink rhCollMA para obter um bioink com uma concentração celular total de 8 milhões de células por 1 mililitro de bioink.
Coloque uma agulha de diâmetro interno de 0,22 milímetros em um cartucho de impressão âmbar de 3 mililitros e coloque o cartucho em um tubo cônico de 50 mililitros. Transfira 1 mililitro da mistura célula-bioink para o cartucho de impressão preenchendo-o do topo usando uma pipeta de deslocamento positiva para reduzir bolhas. Instale o cartucho de impressão na ferramenta apropriada na bioimpressora.
Esboce um padrão 2D de um quadrado de 4 milímetros contendo um canal circular de 2 milímetros de diâmetro em seu centro. Extrude o esboço por 4 milímetros para obter um cubo de 4 milímetros com um canal central. Exporte este objeto como um arquivo STL.
Importe um modelo STL de placa de 12 poços na guia de modelagem sólida no software de corte de bioimpressora e coloque-o na área designada do leito de impressão virtual. Importe o arquivo STL da forma do cubo na guia de modelagem sólida no software de corte de bioimpressora. Clique na caixa de seleção de cortador externo de uso seguida de configuração de fatiador sob a seção propriedade do objeto.
Na janela pop-up, escolha um padrão retilílico para o padrão de preenchimento e digite 30% na densidade de preenchimento, clique em aceitar. Clique no cubo e mova-o usando o mouse para colocar uma cópia da forma do cubo em cada poço virtual desejado. Clique no botão adicionar material na guia de materiais do software de fatiamento de bioimpressora para criar novas configurações de material para bioink rhCollMA.
Escolha as configurações do material para impressão. Para pressão, tipo 2 psi, e para velocidade tipo 20 milímetros por segundo nas caixas correspondentes. Atribua os valores de largura e altura da linha à largura da linha a 0,24 milímetros e o valor de aceleração a 400 milímetros por segundo quadrado.
Na guia de modelagem sólida, clique no objeto cubo e clique no material rhCollMA da seção material para atribuí-lo à forma do cubo. Na guia biomontagem, clique no botão Enviar Trabalho de Impressão para enviar o trabalho de impressão para o bioimpressor. Carregue o cartucho de impressão carregado com o bioink celular na ferramenta pneumática pneumática ambiente 3 mililitro da bioimpressora à base de extrusão 3D.
Clique no botão Esfriar sob a guia Controle de aquecimento ou resfriamento na tela da interface bioimpressora para definir a temperatura da cama de impressão para 4 graus Celsius. Carregue a placa com o banho de suporte na cama da impressora. Na guia Imprimir na tela da interface bioimpressora, clique no trabalho de impressão e clique em Iniciar, seguido por GO para começar o trabalho de impressão.
Após a impressão, exponha a placa do poço a uma fonte de luz de 405 nanômetros com uma intensidade de 3 miliwatts por centímetro quadrado por 30 segundos para iniciar o crosslinking do bioink rhCollMA. Após a ligação cruzada, incubar a placa do poço a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por pelo menos 20 minutos até que todo o banho de suporte derreta. Aspire suavemente o banho de suporte liquefeito e substitua-o pelo meio da célula endotelial.
Incubar as construções a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Imediatamente após a remoção do material de suporte da rede microvascular bioimpressora, coloque um andaime vascular PLLA:PLGA revestido de fibronectina ao lado da estrutura bioimpressora. Insira o andaime vascular no canal principal da estrutura bioimpressora.
Incubar as construções montadas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por dois dias. Prepare uma suspensão celular de células endoteliais que expressam tdTomato-expresse adiposas microvasculares microvasculares a uma concentração de 10 milhões de células por mililitro. Coloque uma gotícula de 20 microliter desta suspensão celular em uma superfície hidrofóbica.
Coloque suavemente os andaimes vasculares em cima da gota de tal forma que o lúmen do andaime de uma extremidade faça contato com a gotícula celular. Aspire a gota da extremidade oposta do andaime enchendo seu lúmen com a suspensão da célula. Coloque o andaime sentado em um tubo de micro centrífugas e coloque-o em uma rotadora dentro de uma incubadora umidificada por 60 minutos.
Por fim, transfira o andaime para uma placa de 12 poços e adicione 2 mililitros de meio de célula endotelial. A visão lateral de um retalho representativo projetado quatro dias após o revestimento endotelial do andaime vascular é mostrado aqui. A microvasculatura bioimpressora é mostrada em verde, enquanto o revestimento endotelial é mostrado em vermelho.
A imagem representativa mostra os anastomoses entre a vasculatura bioimpressora e o forro endotelial. Imunostaining para a actina muscular lisa, núcleos e células endoteliais após sete dias de incubação é mostrado aqui. A imagem representativa exibe anastomoses completas da aba projetada com artéria femoral de um rato antes da remoção do grampo e após a remoção do grampo.
Esta técnica pode ser usada para estudar o amadurecimento e integração da vasculatura impressa em 3D in vivo e monitorar a perfusão do implante no membro posterior para estabelecer o potencial e a segurança para seu uso para tratar defeitos teciduais.
