The authors would like to thank Dr Rita Shaknovich and members of Elemento lab, Melnick lab, and Tam lab for thoughtful discussions. We would also like to thank the Genomics Resources Core Facility at Weill Cornell Medical College for performing the VDJ-sequencing. YJ was supported by ASH Scholar Award. WT and OE are supported by Weill Cornell Cancer Center Pilot Grant. OE is supported by the NSF CAREER award, the Starr Cancer Consortium and the Hirschl Trust. We would also like to thank Katherine Benesch, JD, MPH for her generous support to this project.

1. VDJ Amplification 1.1) a extração de DNA a partir de amostras de tumores <ol><li> Extrair DNA de cortes finos (10-20 um) de PTU tecidos normais ou malignas embutidos congelados. <ol><li> Digerir 10-30 secções finas de tecido embebido corte por micrótomo criostato um em 4 ml de tampão de lise Nucleico (0,0075 M Tris-HCl, pH 8,2; NaCl 0,3 M; 0,002 M Na2EDTA) com proteinase K (0,5 mg / ml, concentração final ) e 0,625% de SDS num tubo de centrífuga de 15 ml num banho de água a 37 C ° durante a noite. </li><li> Adicionar 1 ml de solução saturada de NaCl (5 M) à mistura de digestão e agitar vigorosamente durante 15 segundos. </li><li> Centrifugar a 1.100 xg durante 15 min à temperatura ambiente. </li><li> Transferir o sobrenadante para um novo tubo de centrífuga de 15 ml e adicionar dois volumes de etanol a 100%. </li><li> Misture invertendo o tubo 6-8 vezes. Centrifugar a 5.000 xg durante 60 min a 4 ° C para recolher o precipitado de ADN. </li><li> Lava-se a pelete de ADN duas vezes com etanol a 70%. Centrifuge a 5000 xg durante 15 min de cada vez para recolher o sedimento. </li><li> Dissolve-se o ADN em tampão de TE 100-400 uL à temperatura ambiente durante a noite num agitador. O rendimento de DNA é de 5 a 200 ug (concentração final entre 50-500 ng / mL), dependendo do tamanho do tecido </li></ol></li><li> Extrair DNA de cortes finos (10-20 um) de, incorporado (FFPE) tecido normal ou maligno incluídas em parafina fixado em formalina. <ol><li> Incubar secções de parafina em 1 ml de xileno duas vezes à temperatura ambiente, durante 10 min de cada vez, em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml de de-paraffinize. Recolher as secções de tecido por centrifugação a 13000 xg durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Incubar secções em 1 ml de etanol a 100% à temperatura ambiente duas vezes, 10 min cada vez, para remover xilenos resíduos. Recolher as secções de tecido por centrifugação a 13000 xg durante 5 min à temperatura ambiente. A parafina é completamente dissolvido neste momento e apenas a secção de tecido é restante. </li><li> Secar as seções em te quartomperatura por 10-15 min. </li><li> Adicione uma solução / ml de Proteinase K a 0,5 mg, com tampão de PCR 1x (diluído a partir de tampão de PCR 10x com água livre de nuclease). Adicionar a solução de proteinase K para as amostras num volume final de 50-100 ul e incubar durante a noite a 37 ° C. </li><li> Aquecer as amostras a 95 ° C durante 10 min para inactivar proteinase K. Nota: Neste passo, o ADN da amostra é dissolvida num tampão de PCR e pode ser utilizado nos passos 1.2 e 1.3 directamente. O rendimento de ADN é de 0,5 a 20 ug (concentração final entre 10-200 ng / mL), dependendo do tamanho do tecido. </li></ol></li></ol> 1.2) Avaliação da Qualidade DNA <ol><li> Misture 0,25 ul DNA polimerase Taq com 45 ul de mistura principal do kit de escada comercial em um tubo de PCR. </li><li> Adicionar 5 uL de ADN preparado a partir 1.1.1.7 1.1.2.5 ou no tubo de PCR e misturar bem por pipetagem para cima e para baixo por, pelo menos, 5 vezes. </li><li> Use as seguintes condições para amplificar o ADN: 95 ° C durante7 min; seguido por 35 ciclos de 45 seg a 95 ° C, 45 s a 60 ° C, e 90 seg a 72 ° C; em seguida 72 ° C durante 10 minutos e mantenha a 15 ° C. </li><li> Preparar um gel de agarose a 2% em TBE (Tris / borato / EDTA). </li><li> Misturar 20 uL da reacção de PCR com corante de carga 6x 4 ul, e carrega-se num gel de agarose a 2%. </li><li> Corar o gel de agarose com 0,5 ug ml de brometo de etídio solução / e detectar os produtos de PCR com um sistema de gel de imaginar. Observação: as amostras que produzem produtos de PCR em 5 tamanhos de 100, 200, 300, 400, e 600 pb será continuado para gerar produtos de amplificação VDJ. CUIDADO: O brometo de etídio é um agente mutagênico potente. Por favor, manipular com muito cuidado através do uso de protetor de artes, isto é, luvas, e dispor em recipientes específicos por diretrizes da instituição. </li></ol> 1.3) VDJ PCR 1.3.1) Segmento Amplify recombinados IgH VDJ do Framework Região 1 (IgVHFR1) <ol><li> Misture master mix 45 ul da etiqueta do tuboEd como &quot;mistura de 2&quot; de uma célula somática IGH Hipermutação Ensaio para a Detecção de Gel kit comercial, 0,25 ul ADN-polimerase Taq, e 5 ul de amostra de ADN preparado a partir 1.1.1.7 1.1.2.5 ou em um tubo de PCR. </li><li> Use as seguintes condições para amplificar o ADN: 95 ° C durante 7 min; seguido por 35 ciclos de 45 seg a 95 ° C, 45 s a 60 ° C, e 90 seg a 72 ° C; em seguida 72 ° C durante 10 minutos e mantenha a 15 ° C. </li><li> Resolver o produto de PCR todo em um 2% de gel de agarose por electroforese. </li><li> Corar o gel de agarose com 0,5 ug ml de brometo de etídio solução / e detectar os produtos de PCR com um sistema de imagem em gel. Um anticorpo monoclonal é amplicão esperado com a gama de tamanhos de 310-380 pb. </li><li> Extirpar a parte de gel contendo o fragmento amplificado monoclonal entre 310-380 pb. </li><li> Purifica-se o ADN a partir de gel excisado utilizando um kit de extracção de Gel padrão de acordo com o protocolo do fabricante. Nota: para amostras que FR1 fragmentos poderiam ser obtidos, não há nenhuma necessidade de se amplamente IgVHFR2 e IgVHFR3. </li></ol> 1.3.2) Segmento Amplify recombinado de IgH de estrutura da região VDJ 2 (IgVHFR2) <ol><li> Misturar mistura principal 45 ul do tubo rotulado como &quot;Tubo B&quot; de um comercial IGH Gene clonalidade Ensaio para a Detecção de kit Gel, 0,25 ul ADN-polimerase Taq, e 5 ul de ADN da amostra preparada a partir 1.1.1.7 1.1.2.5 ou em um tubo de PCR . </li><li> Use as seguintes condições para amplificar o ADN: 95 ° C durante 7 min; seguido por 35 ciclos de 45 seg a 95 ° C, 45 s a 60 ° C, e 90 seg a 72 ° C; em seguida 72 ° C durante 10 minutos e deixar a 15 ° C. </li><li> Resolver o produto de PCR todo em um 2% de gel de agarose por electroforese. </li><li> Visualizar produto de PCR (s) por 0,5 ug ml de brometo de etídio de coloração /. Um amplicão monoclonal pode ser observada dentro da gama de tamanhos de 250-295 pb. </li><li> Extirpar a parte de gel contendo o fragmento amplificado monoclonal entre 250-295 pb. </li><li> Purifica-se o ADN a partir de gel excisado utilizando um extracto de gel padrãoKit de iões de acordo com o protocolo do fabricante. </li></ol> 1.4) Optimize VDJ PCR <ol><li> Use as seguintes condições de PCR modificados para amplificar IgVHFR1 e IgVHFR2 utilizando ADN sub-óptima: 95 ° C durante 7 min, 40 ciclos de 95 ° C durante 60 seg, 60 ° C durante 60 segundos, e 72 ° C durante 90 seg, extensão final a 72 ° C durante 10 min. </li></ol> 2. VDJ Amplicon Biblioteca Preparação e Sequencing 2.1) Preparação da biblioteca 2.1.1) Fim-de reparação <ol><li> Transfira produto PCR VDJ, de 1,3 em um tubo de PCR e adicionar Resuspension tampão de amostra de ADN Preparação Kit para abrir o volume para 60 mL. </li><li> Adicionar 40 ul de Reparação End Mix Kit de Preparação de Amostras de DNA e misture bem. </li><li> Incubar a reacção a 30 ° C durante 30 minutos num termociclador pré-aquecido (30 ° C) com uma tampa pré-aquecido a 100 ° C. </li><li> Misturar 136 ul de contas magnéticas e 24 ul de PCR grade água primeiro em um tubo de 1,5 ml, em seguida, transferir a reacção de toda extremidade de 2.1.1.3-reparação no tubo de 1,5 ml e misture bem com a solução de grânulos. </li><li> Colocar os tubos em um suporte magnético durante 2 min para permitir a separação das esferas da solução. Aspirar o sobrenadante e lavar as contas com 80% fresco preparado EtOH duas vezes enquanto o tubo está no suporte magnético. </li><li> Aspirar a solução de etanol completamente e permitir que as esferas secar ao ar durante 15 min à temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Tome tubo fora do carrinho e re-suspenda as esferas magnéticas em 17,5 ul Resuspension Buffer. </li><li> Tubos lugar de volta no suporte magnético por 2 min a esferas separadas do Resuspension buffer. Remover o tampão de ressuspensão (End-reparação produto é ressuspenso no tampão de ressuspensão agora) num tubo de PCR limpo. </li></ol> 2.1.2) A-tailing <ol><li> Adicionar 12,5 ul mix A-tailing para dentro do tubo de PCR contendo End-Conserto do produto e misture bem. </li&gt; <li> Incubar o tubo de PCR a 37 ° C durante 30 minutos num termociclador pré-aquecido (37 ° C) com uma tampa pré-aquecida a 100 ° C. </li></ol> 2.1.3) Adaptor Ligation <ol><li> Adicionar 2,5 mL Resuspension Buffer, 2,5 ul Ligation Mix, e 2,5 l DNA Index Adaptor na reacção seguindo-A. </li><li> Incubar a reacção a 30 ° C durante 30 MINL num termociclador pré-aquecido (30 ° C) com uma tampa pré-aquecido a 100 ° C. </li><li> Adicionar 5 mL Parar Ligation tampão em cada reação e misture bem. </li><li> Misture 42,5 esferas magnéticas ul bem misturadas para limpar a reação seguinte etapas 2.1.1.5 a 2.1.1.8. Adicionar 50 ul de tampão de ressuspensão para eluir o produto ligado-adaptador. </li><li> Limpar o produto ligado do adaptador por uma segunda vez, utilizando 50 ul bem misturada grânulos AMPure XP, e elui-se o produto em 25 ul de tampão de ressuspensão para um tubo de PCR limpo. </li></ol> 2.1.4) fragmentos de DNA Amplify <ol><li> Adicionar 5 mL PCR Primer Cocktail e 25 ul PCR Master Mix ao tubo de PCR contendo produto ligado adaptador e misture bem. </li><li> Efectue a amplificação num termociclador pré-programado com as seguintes condições: 98 ° C durante 30 seg; 10 ciclos de 98 ° C durante 10 seg, 60 ° C durante 30 seg e 72 ° C durante 30 seg; em seguida 72 ° C durante 5 min e manter a 10 ° C. </li><li> Limpar a reacção, usando 50 ul de contas magnéticas bem misturadas, e elui-se o produto final em 30 ul de tampão de ressuspensão. </li></ol> 2.1.5) Biblioteca de Validação <ol><li> Quantificar o produto final com um fluorómetro utilizando o protocolo do fabricante. Biblioteca concentração final situa-se entre 2,5 a 20 ng / ul. </li><li> Avaliar a qualidade do produto final por meio de um instrumento analítico com chip de ADN alta sensibilidade de acordo com o protocolo do fabricante. Esperar uma única banda com o tamanho esperado para qualquer IGVHFR1, IGVHFR2 ou IGVHFR3. Texpected tamanho da biblioteca de produto é igual ao tamanho do fragmento amplificado VDJ original mais o tamanho dos adaptadores (~ 125 pb). </li></ol> 2.2) VDJ-PCR Biblioteca Pooling e Sequencing <ol><li> Calcula-se a molaridade de cada fracção da biblioteca utilizando a seguinte fórmula: = nM [(ng / 1,000) / * 660 pb] x 9 10 em que ng é a concentração da biblioteca de VDJ-PCR medida no passo 2.1.5.1 e pb é o pico tamanho da biblioteca VDJ-PCR medida no passo 2.1.5.2. </li><li> Diluiu-se a biblioteca a 2 nM (10 ul total) com água sem ADNase. </li><li> Combinar os 10 ul da diluídos bibliotecas 2 nM em conjunto num tubo de 1,5 ml. </li><li> Adicionar um volume igual de controlo de pico phix-in para o tubo de 1,5 ml. </li><li> Carregue o piscina na concentração 7:00 em uma célula de fluxo. </li><li> Sequenciar as bibliotecas usando um sequenciador de ciclo combinado-end 150 de acordo com o protocolo do fabricante. </li></ol> Análise 3. Dados Nota: A summary dos scripts de bioinformática utilizados nesta secção podem ser encontrados como um Documento Suplementar código. 3.1) Alinhamento e QC <ol><li> Mapa emparelhados-end seqüenciamento lê contra um IGH humano V, D e banco de dados região J baixado do site da IMGT 11 utilizando um algoritmo explosão de nucleótidos adaptada com base em &#39;blastn&#39; disponível a partir de NCBI com gap open penalty de 2, lacuna extensão penalidade de 1, comprimento de palavra de 7, e de e-valor limiar de 10 -4. Descarte a-par ler não mapeia para tanto um IGH V e uma região J. </li><li> Contar as restantes pares de ler que têm IGH V e J mapeamentos para obter as frequências das correspondentes combinações VJ em todos ler pares obtidos a partir do sequenciamento corrida na amostra. Contagem de um par de leitura se está mapeado para um tanto CMI V e J do gene, e, em seguida, adicionar o seu alelo para a contagem correspondente para a combinação particular de VJ. </li><li> Posição as contagens para cada região recombinados VDJ obtido a partir 3.1.2 do altoEst para o menor. A região VDJ tem a maior contagem de lê é definido como importante concentração de rearranjo. </li><li> Descartar sequências alinhadas, que cobrem menos do que 35% do rearranjo importante domínio identificado em 3.1.3. </li></ol> 3.2) SHM perfil Identificação <ol><li> Contagem de todos os padrões de SHM em todo o lê a partir do passo 3.1.3. Definir cada padrão SHM como um subclone. </li><li> Contar o número de subclones que são correspondentes aos diferentes padrões únicos SHM, e o número de leituras que são mapeados para os subclones individuais. </li></ol> 3.3) representação gráfica dos resultados <ol><li> Realizar a análise filogenética nos subclones utilizando seus correspondentes padrões SHM usando um bairro método de pacote R &quot;macaco&quot; juntar de acordo com o protocolo do fabricante. Calcule uma matriz de distância dos alinhamentos distintos individuais para recriar a filogenia subclone enraizada para a sequência da linha germinativa do VJ combinação em questão para cada conjunto de amostras pareadas. </li><li> Utilizar a sequência de nucleótidos de cada subclone como vetor de caracteres e calcular a distância cadeia aproximada entre todos os subclones no grande rearranjo VJ tanto para o diagnóstico e amostras de recaída correspondentes, utilizando uma medida de distância Levenshtein onde matematicamente a distância entre dois alinhamentos é dado por d x, y (i, j), onde d x, y (i, j) = 1 se i ≠ j e 0 em contrário, e depois resumir esta função ao longo do comprimento da cadeia de caracteres correspondendo a sequências de nucleótidos que i e j. </li><li> Graficamente exibir a matriz resultante das distâncias subclone e suas contagens subclone correspondentes nas duas formas seguintes: <ol><li> Usar o pacote R &quot;em massa&quot; de acordo com o protocolo do fabricante para aplicar escalonamento multidimensional para a matriz de distância subclone e gerar um princípio bidimensional coordenadas do mapa, o qual é então marcados ao longo com o logaritmocontagens de subclonal como o raio do círculo. </li><li> Construir um grafo não direcionado com base na distância de Levenshtein, onde os vértices correspondem a cada subclone distinta resultante da grande rearranjo VJ. Nota: Se a distância entre dois clones distintos é igual a um, então existe uma aresta entre estes dois vértices. Se a distância é maior do que um, então não há nenhuma aresta ligando-os. </li><li> Traçar o gráfico de 3.3.3.2 utilizando a função tkplot no &quot;IGRAPH&quot; pacote de R com o layout Kamada Kawai de acordo com o protocolo do fabricante. O raio dos vértices é proporcional à raiz cubos de o número total de clones mapeado para ele e o sombreamento usa um intervalo de vermelho e azul para indicar a percentagem de clones que podem pertencer ao diagnóstico (azul) ou recaída (vermelho) amostras . </li></ol></li></ol> 3.4) A heterogeneidade Entropia) Medição ( <ol><li> Examine os números e contagem do subclonepadrões individuais de hipermutação somática que ocorrem na maior rearranjo VJ emparelhado para cada conjunto de amostras. </li><li> Calcular a entropia empírica e entropia empírica residual ajustada para o número de clones distintos em cada amostra, utilizando a estimativa do histograma de entropia com base padrão. </li></ol>

<ol>
	<li>Nowell, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clonal+evolution+of+tumor+cell+populations.">The clonal evolution of tumor cell populations.</a> Science. 194 (4260), 23-28 (1976).</li><li>Greaves, M., Maley, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+evolution+in+cancer.">Clonal evolution in cancer.</a> Nature. 481 (7381), 306-313 (2012).</li><li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+evolution+in+relapsed+acute+myeloid+leukaemia+revealed+by+whole-genome+sequencing.">Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing.</a> Nature. 481 (7382), 506-510 (2012).</li><li>Jiao, W., Vembu, S., Deshwar, A. G., Stein, L., Morris, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferring+clonal+evolution+of+tumors+from+single+nucleotide+somatic+mutations.">Inferring clonal evolution of tumors from single nucleotide somatic mutations.</a> BMC bioinformatics. 15, 35 (2014).</li><li>Schatz, D. G., Ji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination+centres+and+the+orchestration+of+V(D)J+recombination.">Recombination centres and the orchestration of V(D)J recombination.</a> Nature reviews immunology. 11 (4), 251-263 (2011).</li><li>Jacob, J., Kelsoe, G., Rajewsky, K., Weiss, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraclonal+generation+of+antibody+mutants+in+germinal+centres.">Intraclonal generation of antibody mutants in germinal centres.</a> Nature. 354 (6352), 389-392 (1991).</li><li>Coiffier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHOP+chemotherapy+plus+rituximab+compared+with+CHOP+alone+in+elderly+patients+with+diffuse+large-B-cell+lymphoma.">CHOP chemotherapy plus rituximab compared with CHOP alone in elderly patients with diffuse large-B-cell lymphoma.</a> N Engl J Med. 346 (4), 235-242 (2002).</li><li>Larouche, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoma+recurrence+5+years+or+later+following+diffuse+large+B-cell+lymphoma:+clinical+characteristics+and+outcome.">Lymphoma recurrence 5 years or later following diffuse large B-cell lymphoma: clinical characteristics and outcome.</a> J Clin Oncol. 28 (12), 2094-2100 (2010).</li><li>Friedberg, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relapsed/refractory+diffuse+large+B-cell+lymphoma.">Relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma.</a> Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2011, 498-505 (2011).</li><li>Gisselbrecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salvage+regimens+with+autologous+transplantation+for+relapsed+large+B-cell+lymphoma+in+the+rituximab+era.">Salvage regimens with autologous transplantation for relapsed large B-cell lymphoma in the rituximab era.</a> J Clin Oncol. 28 (27), 4184-4190 (2010).</li><li>Lefranc, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IMGT,+the+International+ImMunoGeneTics+Information+System+for+Immunoinformatics+:+methods+for+querying+IMGT+databases,+tools,+and+web+resources+in+the+context+of+immunoinformatics.">IMGT, the International ImMunoGeneTics Information System for Immunoinformatics : methods for querying IMGT databases, tools, and web resources in the context of immunoinformatics.</a> Molecular biotechnology. 40 (1), 101-111 (2008).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+sequencing+reveals+clonal+evolution+patterns+and+mutation+events+associated+with+relapse+in+B-cell+lymphomas.">Deep sequencing reveals clonal evolution patterns and mutation events associated with relapse in B-cell lymphomas.</a> Genome biology. 15 (8), 432 (2014).</li><li>Hanna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+terminally+differentiated+mature+B+lymphocytes+to+pluripotency.">Direct reprogramming of terminally differentiated mature B lymphocytes to pluripotency.</a> Cell. 133 (2), 250-264 (2008).</li></ol>

The authors have no conflicts of interest to disclose.

Devido ao número quase ilimitado de iterações de informação sobre a sequência codificada por VDJ rearranjo e SHM no locus IGH de células B humanas, exame de todo o repertório de CMI por high-throughput-sequenciação profunda provou ser uma maneira eficiente e abrangente para delinear clonal e populações sub-clonais de células-B. Além disso, esta estratégia pode ser usada para estudar o caminho do desenvolvimento evolução clonal de células B do tumor, remissão, e recaída comparando as arquitecturas clo...

O câncer é uma doença clonal. Desde há trinta anos atrás, quando Peter Nowell C. propôs o modelo de evolução clonal câncer 1, muitos estudos têm tentado dissecar populações clonais dentro de amostras de tumores e reconstruir expansão e evolução padrões clonais que fundamentam o processo de tumorigênese 2. Recentemente, todo o seqüenciamento do genoma permitiu que os investigadores tomar um profundo olhar para a heterogeneidade clonal e evolução 3,4. No entanto, devido à falta de marcadores tratáveis ​​em muitos tipos de células, é difícil deduzir a arquitectura clonal caminho preciso e evolutiva. Felizmente, existe um marcador clonality natural em células maduras B a partir do qual muitas doenças malignas linfóides, incluindo DLBCL, são originários. Em resposta a estimulação por antigénio, cada célula B pode formar uma única sequência de IgH VDJ produtiva juntando um H V (variável), um D (diversidade), e um J H (unir) segmento em conjunto a partir de um grande pool de estes segmentos. Durante este processo, pequenas porções da sequência original pode ser eliminado e nucleótidos não templated adicionais podem ser adicionados para criar um rearranjo VDJ única. Este rearranjo VDJ específica pode ser herdado em toda a descendência desta célula B, por conseguinte, a marcação de células B maduras individual e a sua prole 5. Além disso, SHM ocorre nas sequências de VDJ recombinados na reacção subsequente centro germinal (GC) para introduzir mutações adicionais para a expansão do conjunto de anticorpo e o aumento da afinidade do anticorpo 6. Portanto, comparando e contrastando padrões de amostras de linfoma que tenham sido submetidos a esses processos VDJ e SHM, heterogeneidade intra-tumoral pode ser delineada e caminho de evolução da doença clonal pode ser deduzida. Anteriormente, VDJ e rearranjo SHM puderam ser identificados por PCR amplificar as regiões recombinadas, clonagem dos produtos de PCR, e subsequentemente a sequenciação de Sanger para obter informação sobre a sequência. Esta abordagem is de baixo rendimento e baixo rendimento, recuperando apenas uma pequena parte de todo o repertório de VDJ recombinadas, e impedindo a caracterização da representação global da população clonal dentro de uma dada amostra. A abordagem modificada foi criado por meio da geração NGS indexados bibliotecas de seqüenciamento dos produtos de PCR VDJ e realizando PE 2x150 bp seqüenciamento obter mais de meio milhão de sequências VDJ recombinadas por amostra. Além disso, uma tubagem personalizada foi desenvolvido para realizar o controlo de qualidade (QC), alinhar, VDJ filtro sequenciação leituras para identificar rearranjos e SHMS de cada leitura, e realizar a análise filogenética na arquitectura clonal de cada amostra. Além disso, uma nova abordagem foi estabelecida para caracterizar adicionalmente os padrões de evolução clonal para amostras recolhidas em vários estádios da doença. Nós aplicamos essa técnica para amostras de pacientes LDGCB. DLBCL é uma forma agressiva de linfoma não-Hodgkin com recaídas freqüentes em até um thIRD dos pacientes 7. Recaídas LDGCB normalmente ocorrem no início, dentro de 2 a 3 anos do diagnóstico inicial, embora alguns ocorrem após 5 anos 8. O prognóstico para pacientes recidiva é pobre, com apenas 10% alcançar três anos sobrevida livre de progressão devido a opções de tratamento limitadas. Esta é a base para a necessidade urgente de novas abordagens para o tratamento de DLBCL recaída 9,10. No entanto, os mecanismos moleculares associados com DLBCL recaída são ainda desconhecidos. Em particular, o papel da heterogeneidade clonal no momento do diagnóstico e evolução clonal durante DLBCL desenvolvimento recaída são atualmente descaracterizado, o que torna difícil definir um biomarcador preciso e útil para predizer recaída. Para abordar essas questões, nós aplicamos nossa abordagem VDJ-sequenciação de múltiplos pares de pares combinados de amostra DLBCL diagnóstico de recidiva primária. Dois cenários evolutivos clonais distintos de recaída surgiu a partir da comparação dos arquiteturas clonais entre o diagnóstico e samp recaídales sugere que vários mecanismos moleculares podem estar envolvidos na DLBCL recaída.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="841">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">Ethanol</td>
			<td style="width:163px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">89125-170</td>
			<td style="width:197px;">200 proof, for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">TE buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12090-015</td>
			<td style="width:197px;">10 mM Tris&#183;Cl, pH 8.0; 10mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylenes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-XX0055-6</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Proteinase K&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Life Technonogies</td>
			<td>25530-015</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:123px;">U1515</td>
			<td style="width:197px;">10 mM each nucleotide</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10x PCR Buffer&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11699105001</td>
			<td>Without MgCl2</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:359px;">AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2</td>
			<td style="width:163px;">Life Technonogies</td>
			<td style="width:123px;">4311806</td>
			<td>50 &#181;l at 5 U/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Specimen Control Size Ladder</td>
			<td style="width:163px;">Invivoscribe Technologies&#160;</td>
			<td>2-096-0020</td>
			<td>33 reactions</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:359px;">IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 - Gel Detection</td>
			<td style="width:163px;">Invivoscribe Technologies&#160;</td>
			<td style="width:123px;">5-101-0030</td>
			<td style="width:197px;">33 reactions, Mix 2 for IGVHFR1 detection</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;">IGH Gene Clonality Assay - Gel Detection</td>
			<td style="width:163px;">Invivoscribe Technologies&#160;</td>
			<td>1-101-0020</td>
			<td style="width:197px;">33 reactions, Tube B for IGVHFR2 detection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GoTaq Flexi DNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:123px;">M8291</td>
			<td>20 &#181;l at 5 U/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10X Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer</td>
			<td>Corning (cellgro)</td>
			<td style="width:123px;">46-011-CM</td>
			<td style="width:197px;">6x1 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50X TAE BUFFER&#160;&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101414-298</td>
			<td style="width:197px;">1 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethidium bromide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1510</td>
			<td style="width:197px;">10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">25 bp DNA Ladder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10597011</td>
			<td style="width:197px;">1 &#181;g/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100 bp DNA Ladder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15628-019</td>
			<td style="width:197px;">1 &#181;g/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">UltraPure Agarose</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16500-500</td>
			<td style="width:197px;">500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">40% Acrylamide/Bis Solution</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1610144</td>
			<td style="width:197px;">500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td style="width:197px;">50 columns</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">Agencourt AMPure XP</td>
			<td style="width:163px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">A63881</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">Q32854</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:123px;">5067-4626</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">PhiX Control v3</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-110-3001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">MiSeq</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32872</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">Resuspension buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">DNA adaptor index (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Magnetic stand</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td align="right">4457858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:359px;">Gel imaging system</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>170-8370</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

vdj-seq: deep sequencing analysis of rearranged immunoglobulin heavy chain gene to reveal clonal evolution patterns of b cell lymphoma

Clonality tumor compreensão é fundamental para a compreensão dos mecanismos envolvidos na tumorigênese e progressão da doença. Além disso, a compreensão das alterações da composição clonais que ocorrem dentro de um tumor em resposta a certos micro-ambiente ou tratamentos podem levar à concepção de abordagens mais sofisticadas e eficazes para a erradicação de células de tumor. No entanto, o rastreamento tumorais clonais sub-populações tem sido um desafio devido à falta de marcadores distinguíveis. Para resolver este problema, um protocolo VDJ-seq foi criada para rastrear os padrões de evolução clonal de linfoma de grandes células B (LDGCB) recaída difusa, explorando VDJ recombinação e mutação somática (SHM), duas características únicas de linfomas de células B. Neste protocolo, Next-Generation seqüenciamento (NGS) bibliotecas com potencial de indexação foram construídos a partir de cadeia pesada de imunoglobulina rearranjados amplificado (IgH) região VDJ de pares de diagnóstico primário e recaída samp DLBCLles. Em média, mais de meio milhão de sequências VDJ por amostra foram obtidos após o seqüenciamento, que contêm tanto VDJ e rearranjo informações SHM. Além disso, condutas bioinformatics personalizados foram desenvolvidos para utilizar completamente a informação de sequência para a caracterização de IgH-VDJ repertório dentro destas amostras. Além disso, a tubagem permite a reconstrução e comparação da arquitectura clonal de tumores individuais, o que permite o exame da heterogeneidade clonal dentro dos tumores de diagnóstico e dedução de padrões de evolução clonal entre o diagnóstico de tumor e pares de recaída. Ao aplicar essa análise para vários pares diagnóstico de recidiva, nós descobriu a evidência chave que múltiplos padrões evolutivos tumorais distintivo poderia levar a DLBCL recaída. Além disso, esta abordagem pode ser alargada a outros aspectos clínicos, tais como a identificação de doença residual mínima, monitorar o progresso recaída e resposta ao tratamento e investigação do repertório imunees em contextos não-linfoma.

O procedimento geral de VDJ sequenciação (VDJ-SEQ), incluindo a extracção de ADN, amplificação da região VDJ recombinados e a purificação, a construção da biblioteca de sequenciação, lê-se o processamento e análise filogenética, é representado na Figura 1. Rotineiramente 5-200 ug de ADN pode ser recuperado a partir de secções de tecido congelado ou 0,5-20 ug de ADN de secções de tecido fixado em formol e embebidos em parafina. Dependendo da qualidade, padrão de rea...

Watch this Scientific Journal Video about VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma at JoVE.com

VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma

This protocol describes an approach to interrogate the recombined immunoglobulin heavy chain VDJ regions of lymphomas by deep-sequencing and retrieve VDJ rearrangement and somatic hypermutation status to delineate clonal architecture of individual tumor. Comparing clonal architecture between paired diagnosis and relapse samples reveals lymphoma relapse clonal evolution modes.

VDJ-Seq: Análise Sequenciamento profundo do Reorganizados Imunoglobulina Cadeia Pesada Gene para revelar padrões Clonal evolução do linfoma B celular

Understanding tumor clonality is critical to understanding the mechanisms involved in tumorigenesis and disease progression. In addition, understanding ...

vdj-seq-deep-sequencing-analysis-rearranged-immunoglobulin-heavy

Research

JoVE Journal

Medicine

26.5K visualizações.  Weill Cornell Medical College. This protocol describes an approach to interrogate the recombined immunoglobulin heavy chain VDJ regions of lymphomas by deep-sequencing and retrieve VDJ rearrangement and somatic hypermutation status to delineate clonal architecture of individual tumor. Comparing clonal architecture between paired diagnosis and relapse samples reveals lymphoma relapse clonal evolution modes. 

Vídeo: VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma

Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis

The vitreous is an optically clear, collagenous extracellular matrix that fills the inside of the eye and overlies the retina. 1,2 Abnormal interactions between vitreous substructures and the retina underlie several vitreoretinal diseases, including retinal tear and detachment, macular pucker, macular hole, age-related macular degeneration, vitreomacular traction, proliferative vitreoretinopathy, proliferative diabetic retinopathy, and inherited vitreoretinopathies. 1,2 The molecular composition of the vitreous substructures is not known. Since the vitreous body is transparent with limited surgical access, it has been difficult to study its substructures at the molecular level. We developed a method to separate and preserve these tissues for proteomic and biochemical analysis. The dissection technique in this experimental video shows how to isolate vitreous base, anterior hyaloid, vitreous core, and vitreous cortex from postmortem human eyes. One-dimensional SDS-PAGE analyses of each vitreous component showed that our dissection technique resulted in four unique protein profiles corresponding to each substructure of the human vitreous body. Identification of differentially compartmentalized proteins will reveal candidate molecules underlying various vitreoretinal diseases.

This video shows an effective technique for differentiating and dissecting the various semi-transparent structures of the human vitreous body in post mortem eyes.

Dissecção da Human Elements Corpo Vítreo para Análise Proteômica

The vitreous is an optically clear, collagenous extracellular matrix that fills the inside of the eye and overlies the retina. 1,2 Abnormal interactions ...

Medicina

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Estabelecimento e propagação de Tumores Humanos em Retinoblastoma Imune camundongos deficientes

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive molecules contain an oxygen and include H2O2 (hydrogen peroxide), NO (nitric oxide), O2- (oxide anion), peroxynitrite (ONOO-), hydrochlorous acid (HOCl), and hydroxyl radical (OH-).
Oxidative species are produced not only under pathological situations (cancers, ischemic/reperfusion, neurologic and cardiovascular pathologies, infectious diseases, inflammatory diseases 1, autoimmune diseases 2, etc&hellip;) but also during physiological (non-pathological) situations such as cellular metabolism 3, 4. Indeed, ROS play important roles in many cellular signaling pathways (proliferation, cell activation 5, 6, migration 7 etc..). ROS can be detrimental (it is then referred to as "oxidative and nitrosative stress") when produced in high amounts in the intracellular compartments and cells generally respond to ROS by upregulating antioxidants such as superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and glutathione (GSH) that protects them by converting dangerous free radicals to harmless molecules (i.e. water). Vitamins C and E have also been described as ROS scavengers (antioxidants).
Free radicals are beneficial in low amounts 3. Macrophage and neutrophils-mediated immune responses involve the production and release of NO, which inhibits viruses, pathogens and tumor proliferation 8. NO also reacts with other ROS and thus, also has a role as a detoxifier (ROS scavenger). Finally NO acts on vessels to regulate blood flow which is important for the adaptation of muscle to prolonged exercise 9, 10. Several publications have also demonstrated that ROS are involved in insulin sensitivity 11, 12.
Numerous methods to evaluate ROS production are available. In this article we propose several simple, fast, and affordable assays; these assays have been validated by many publications and are routinely used to detect ROS or its effects in mammalian cells. While some of these assays detect multiple ROS, others detect only a single ROS.

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Here we propose simple methods to test and evaluate the presence of reactive oxygen species in cells.

Produção e Detecção de Espécies Reativas de Oxigênio (ROS) em Câncer

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA (siRNA) in gene silencing1, RNAi has become a powerful research tool in gene function studies. Compared to genetic deletion, RNAi-mediated gene silencing possesses many advantages, such as the ease with which it is carried out and its suitability to most cell lines. Multiple studies have demonstrated the applications of RNAi technology in cancer research. In particular, the development of the DNA vector-based technology to produce small hairpin RNA (shRNA) driven by the U6 or H1 promoter has made long term and inducible gene silencing possible2,3. Its use in combination with genetically engineered viral vectors, such as lentivirus, facilitates high efficiencies of shRNA delivery and/or integration into genomic DNA for stable shRNA expression. 
We describe a detailed procedure using the DNA vector-based RNAi technology to determine gene function, including construction of lentiviral vectors expressing shRNA, lentivirus production and cell infection, and functional studies using a mouse xenograft model. 
Various strategies have been reported in generating shRNA constructs. The protocol described here employing PCR amplification and a 3-fragment ligation can be used to directly and efficiently generate shRNA-containing lentiviral constructs without leaving any extra nucleotide adjacent to a shRNA coding sequence. Since the shRNA-expression cassettes created by this strategy can be cut out by restriction enzymes, they can be easily moved to other vectors with different fluorescent or antibiotic markers. Most commercial transfection reagents can be used in lentivirus production. However, in this report, we provide an economic method using calcium phosphate precipitation that can achieve over 90% transfection efficiency in 293T cells. Compared to constitutive shRNA expression vectors, an inducible shRNA system is particularly suitable to knocking down a gene essential to cell proliferation. We demonstrate the gene silencing of Yin Yang 1 (YY1), a potential oncogene in breast cancer4,5, by a Tet-On inducible shRNA system and its effects on tumor formation. Research using lentivirus requires review and approval of a biosafety protocol by the Biosafety Committee of a researcher's institution. Research using animal models requires review and approval of an animal protocol by the Animal Care and Use Committee (ACUC) of a researcher's institution.

RNA interference (RNAi) possesses many advantages over gene knockout and has been broadly used as a tool in gene functional studies. The invention of DNA vector-based RNAi technology has made long term and inducible gene knockdown possible, and also increased the feasibility of gene silencing in vivo.

DNA Vector baseado em RNA de interferência para estudar a função Gênica em Câncer

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA ...

Deep Neuromuscular Blockade Leads to a Larger Intraabdominal Volume During Laparoscopy

Shoulder pain is a commonly reported symptom following laparoscopic procedures such as myomectomy or hysterectomy, and recent studies have shown that lowering the insufflation pressure during surgery may reduce the risk of post-operative pain. In this pilot study, a method is presented for measuring the intra-abdominal space available to the surgeon during laproscopy, in order to examine whether the relaxation produced by deep neuromuscular blockade can increase the working surgical space sufficiently to permit a reduction in the CO2 insufflation pressure. Using the laproscopic grasper, the distance from the promontory to the skin is measured at two different insufflation pressures: 8 mm Hg and 12 mm Hg. After the initial measurements, a neuromuscular blocking agent (rocuronium) is administered to the patient and the intra-abdominal volume is measured again. Pilot data collected from 15 patients shows that the intra-abdominal space at 8 mm Hg with blockade is comparable to the intra-abdominal space measured at 12 mm Hg without blockade. The impact of neuromuscular blockade was not correlated with patient height, weight, BMI, and age. Thus, using neuromuscular blockade to maintain a steady volume while reducing insufflation pressure may produce improved patient outcomes.

This article presents a method for measuring the working abdominal volume during laproscopic myomectomy using the surgical grasper, and applies this technique to obtain pilot data on whether deep neuromuscular blockade (NMB) can enable the use of lower insufflation pressure. Reduced insufflation pressure during laproscopic surgery has been shown to reduce post-operative pain, and thus the use of NMB during surgery may enable improved patient outcomes.

Bloqueio Neuromuscular profunda leva a um volume maior intra-abdominal durante a laparoscopia

Shoulder pain is a commonly reported symptom following laparoscopic procedures such as myomectomy or hysterectomy, and recent studies have shown that ...

Detection of Architectural Distortion in Prior Mammograms via Analysis of Oriented Patterns

We demonstrate methods for the detection of architectural distortion in prior mammograms of interval-cancer cases based on analysis of the orientation of breast tissue patterns in mammograms. We hypothesize that architectural distortion modifies the normal orientation of breast tissue patterns in mammographic images before the formation of masses or tumors. In the initial steps of our methods, the oriented structures in a given mammogram are analyzed using Gabor filters and phase portraits to detect node-like sites of radiating or intersecting tissue patterns. Each detected site is then characterized using the node value, fractal dimension, and a measure of angular dispersion specifically designed to represent spiculating patterns associated with architectural distortion.
Our methods were tested with a database of 106 prior mammograms of 56 interval-cancer cases and 52 mammograms of 13 normal cases using the features developed for the characterization of architectural distortion, pattern classification via quadratic discriminant analysis, and validation with the leave-one-patient out procedure. According to the results of free-response receiver operating characteristic analysis, our methods have demonstrated the capability to detect architectural distortion in prior mammograms, taken 15 months (on the average) before clinical diagnosis of breast cancer, with a sensitivity of 80% at about five false positives per patient.

Detection of Architectural Distortion in Prior Mammograms via Analysis of Oriented Patterns

We demonstrate methods for the detection of architectural distortion in prior mammograms. Oriented structures are analyzed using Gabor filters and phase portraits to detect sites of radiating tissue patterns. Each site is characterized and classified using measures to represent spiculating patterns. The methods should assist in the detection of breast cancer.

Detecção de distorção arquitetural em mamografias anteriores<em&gt; Via</em&gt; Análise de Padrões Orientada

We demonstrate methods for the detection of architectural distortion in prior mammograms of interval-cancer cases based on analysis of the orientation of ...

Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson's Disease

Lipoxygenase (LOX) activity has been implicated in neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s disease, but its effects in Parkinson&#39;s disease (PD) pathogenesis are less understood. Gene-environment interaction models have utility in unmasking the impact of specific cellular pathways in toxicity that may not be observed using a solely genetic or toxicant disease model alone.&#160;To evaluate if distinct LOX isozymes selectively contribute to PD-related neurodegeneration, transgenic (i.e. 5-LOX and 12/15-LOX deficient) mice can be challenged with a toxin that mimics cell injury and death in the disorder.&#160;Here we describe the use of a neurotoxin, 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP), which produces a nigrostriatal lesion to elucidate the distinct contributions of LOX isozymes to neurodegeneration related to PD. The use of MPTP in mouse, and nonhuman primate, is well-established to recapitulate the nigrostriatal damage in PD.&#160;The extent of MPTP-induced lesioning is measured by HPLC analysis of dopamine and its metabolites and semi-quantitative Western blot analysis of striatum for tyrosine hydroxylase (TH), the rate-limiting enzyme for the synthesis of dopamine. To assess inflammatory markers, which may demonstrate LOX isozyme-selective sensitivity, glial fibrillary acidic protein (GFAP) and Iba-1 immunohistochemistry are performed on brain sections containing substantia nigra, and GFAP Western blot analysis is performed on striatal homogenates.&#160;This experimental approach can provide novel insights into gene-environment interactions underlying nigrostriatal degeneration and PD.

Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson&#039;s Disease

Lipoxygenase (LOX) isozymes can generate products that may increase or decrease neuroinflammation and neurodegeneration.&#160;A gene-environment interaction study could identify LOX isozyme-specific effects. Using the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) model of nigrostriatal damage in two LOX isozyme-deficient transgenic lines allows for comparison of the contribution of LOX isozymes on dopaminergic integrity and inflammation.

Modelos de interação gene-ambiente para desmasca mecanismos de suscetibilidade na doença de Parkinson

Lipoxygenase (LOX) activity has been implicated in neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s disease, but its effects in Parkinson&#39;s disease ...

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals1. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)2. When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci1 that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.

The Focus Formation Assay provides a straightforward method to assess the transforming potential of a candidate oncogene.

Concentre Formação: Um Ensaio Celular para Determinar o Potencial oncogénica de um Gene

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from clinical and biological sources. The method is unbiased and universal; it uses random primers for cDNA synthesis and requires no prior knowledge of the viral sequence content. Before library construction, selective RNase H-based digestion is used to deplete unwanted RNA &#8212; including poly(rA) carrier and ribosomal RNA &#8212; from the viral RNA sample. Selective depletion improves both the data quality and the number of unique reads in viral RNA sequencing libraries. Moreover, a transposase-based &#39;tagmentation&#39; step is used in the protocol as it reduces overall library construction time. The protocol has enabled rapid deep sequencing of over 600 Lassa and Ebola virus samples-including collections from both blood and tissue isolates-and is broadly applicable to other microbial genomics studies.

This protocol describes a rapid and broadly applicable method for unbiased RNA-sequencing of viral samples from human clinical isolates.

Sequenciamento profundo imparcial de Vírus RNA de amostras clínicas

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from ...

Application of Biochip Microfluidic Technology to Detect Serum Allergen-specific Immunoglobulin E (sIgE)

Allergic disease is common in both adults and children. Identification of the causative allergens is significant in disease management and prevention. However, a specific immunoglobulin E (IgE) measurement system with a high price-performance ratio is lacking in mainland China, especially in the primary care hospitals. This paper describes the principle and operation procedures of using a microfluidic cartridge-based chemiluminescence system to detect allergen-specific IgE in serum. The results were compared with those from ImmunoCAP (System 1), the industrial standard, and the reproducibility of the system to detect patients sensitized to common allergens is evaluated. The results showed that in comparison with ImmunoCAP (System 1), the BioIC System (System 2) has good precision and sensitivity in detecting serum-specific IgE against various inhalant and food allergens but with a significantly lower cost. It can serve as a good alternative to System 1 in primary care hospitals in mainland China who have lower financial affordability.

Application of Biochip Microfluidic Technology to Detect Serum Allergen-specific Immunoglobulin E sIgE

This paper presents a protocol for detecting serum-specific immunoglobulin E with a microfluidic cartridge-based chemiluminescence system and the evaluation of its usefulness in allergy diagnoses.

Aplicação da tecnologia de Microfluidic Biochip para detectar soro alérgeno-específicas E de imunoglobulina (sIgE)

Allergic disease is common in both adults and children. Identification of the causative allergens is significant in disease management and prevention. ...