O financiamento foi fornecido pelo Fight for Sight. Tecidos foram obtidos do Banco de Olhos Lions Iowa.

1. A dissecção do segmento anterior. <ol><li> A córnea é removida por primeiro fazer uma incisão no limbo dentro da câmara anterior utilizando uma lâmina de 15 ° (Figura 1). Em seguida, uma lâmina curvada de córnea escleral-tesoura é inserida dentro da câmara anterior. Circunferencial cortes são feitos na córnea, apenas anterior ao limbo. </li><li> 0,12 Colibri pinças e tesoura Westcott são usados ​​para cortar a íris circunferencialmente anterior ao corpo ciliar. </li><li> O núcleo da lente foi removida com fórceps 0,12 Colibri ou uma lâmina de 15 ° (supersharp) e do córtex e da cápsula com uma pinça. </li></ol> 2. Aspiração Central vítreo. <ol><li> Uma agulha 23 gauge em uma seringa de 5 cc é inserido em meados da década de vítreo (Figura 1). </li><li> Aproximadamente 1 mL ou mais do núcleo vítreo é suavemente aspirado. </li><li> A amostra é então colocada em um tubo de microcentrífuga e depois em nitrogênio líquido. </li></ol> 3. Dissecação hialóide anterior. <ol><li> A hialóide anterior é visto como um anel semi-transparente, ajustando a luz incidente de um microscópio de luz ganso pescoço. Aspiração anteriores do núcleo vítreo se separa da hialóide anterior de outras estruturas para facilitar a identificação. </li><li> A folha de tecido elástico é cuidadosamente puxado para longe do corpo ciliar com Colibri ou fórceps vestir-se e cortou com uma tesoura Vannas. Esta manobra é repetida. </li><li> A amostra é então colocada em um tubo de microcentrífuga e depois em nitrogênio líquido. </li></ol> 4. Dissecção da Base vítreo. <ol><li> Usando 0,12 fórceps para estabilizar a taça do olho, uma tesoura Westcott são usados ​​para &quot;flor&quot; o olho fazendo quatro igualmente espaçados de aliviar o stress cortes do corpo ciliar em direção à cabeça do nervo óptico. </li><li> A pars plicata do corpo ciliar (Figura 2) é removida de cada um dos quadrantes usando uma tesoura Westcott. </li><li> A base vítrea é, então, agarrou em ambos os lados da ora serrata com uma pinça sobre o pars plana e retina (Figura 2). </li><li> Tração contínua sobre a base vítrea é aplicada com a pinça. Corte sequencial com tesoura Westcott extrai um tecido semi-transparente com um &quot;colar de pérolas&quot; aparência como é extirpado. </li><li> A amostra é então colocada em um tubo de microcentrífuga e depois em nitrogênio líquido. </li></ol> 5. Remoção Cortex vítreo. <ol><li> A pars plana é retirado de cada um dos quadrantes com tesoura Westcott cortando o folheto aproximadamente 3 mm posterior à ora serrata (Figura 2). </li><li> Entre os folhetos de tecido, o córtex do vítreo é visualizado como um filme semi transparente. </li><li> O filme elástico ou é apreendido com 0,12 forceps ou detidos pela adesão a uma esponja Weck-Cel cirúrgico. O córtex vítreo é, então, afastou-se da retina e retirado com tesoura Westcott (Figura 1). </li><li> A amostra é colocada em um tubo de microcentrífuga e depois em nitrogênio líquido. Todas as amostras são armazenadas a -80 ° C até utilizados para a experimentação. </li></ol> 6. Resultados representante Amostras de tecido pode ser processado por uma variedade de métodos para experimentos específicos. No nosso caso, as amostras foram submetidas a análise de proteínas por SDS-PAGE (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/2455/2455fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Transversal visão do olho humano representando subestruturas diferentes do corpo vítreo. O vítreo mais anterior é uma fina camada de colágeno chamado de hialóide anterior. O núcleo vítreo compreende toda a região central do corpo vítreo. Esta parte do vítreo é mais aquosa em contraste com a base vítrea, que é viscoso o suficiente para ser captado por uma pinça e está firmemente ligado ao corpo ciliar e retina subjacente. Abrangendo o núcleo vítreo é um shell muito finas de colágeno chamada córtex vítreo. <img src="/files/ftp_upload/2455/2455fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Anatomia base vítrea. A base do vítreo é uma infra-estrutura semi-transparente do corpo vítreo localizado junto à ora serrata (setas brancas), que é a linha divisória que separa o corpo ciliar e retina. A borda anterior da base do vítreo se estende sobre a pars plana (linha branca) do corpo ciliar. A borda posterior da base vítrea estende 2-3 mm posterior à ora serrata (traço branco). Para extirpar a base do vítreo, uma pinça são usados ​​para captar o tecido e puxe-o para longe do corpo ciliar e retina subjacente. Uma vez elevado, tesoura Westcott são usados ​​para cortar ao longo da base. <img src="/files/ftp_upload/2455/2455fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Unidimensional SDS-PAGE de elementos do corpo vítreo. Concentrações de proteína total para a hialóide anterior, base vítrea, vitreous núcleo e córtex vítreo foram 11,24, 20,1, 16,61, 14,24 mg / mL, respectivamente. Eletroforese em gel foi realizada em 200 kV por 45 minutos, corados com Flamingo (Bio-Rad), e visualizados através de um VersaDoc Imaging System (Bio-Rad). Os perfis para os diferentes tecidos mostrar várias bandas similares, indicando quer conservada ou cross-contaminação proteínas, bem como as bandas originais (asterisco), indicando proteínas diferencialmente localizada.

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	<li>Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+macromolecules+and+supramolecular+organisation+of+the+vitreous+gel.">Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel.</a> Prog Retin Eye Res. 19, 323-344 (2000).</li><li>Sebag, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+pharmacologic+vitreolysis.">Molecular biology of pharmacologic vitreolysis.</a> Trans Am Ophthalmol Soc. 103, 473-494 (2005).</li><li>Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+of+inflammatory+immune+mediators+in+vitreoretinal+diseases.">Comprehensive analysis of inflammatory immune mediators in vitreoretinal diseases.</a> PLoS One. 4, e8158-e8158 (2009).</li><li>Gao, B. B., Chen, X., Timothy, N., Aiello, L. P., Feener, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+vitreous+proteome+in+diabetes+without+diabetic+retinopathy+and+diabetes+with+proliferative+diabetic+retinopathy.">Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy.</a> J Proteome Res. 7, 2516-2525 (2008).</li><li>Izuta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+SOD+and+VEGF+are+increased+in+vitreous+bodies+from+proliferative+diabetic+retinopathy+patients.">Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients.</a> Mol Vis. 15, 2663-2672 (2009).</li><li>Azimzadeh, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+proteome+analysis+using+gel-free+and+gel-based+proteomics.">Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) proteome analysis using gel-free and gel-based proteomics.</a> J Proteome Res. 9, 4710-4720 (2010).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O corpo vítreo é um gel semi-transparente, cuja composição molecular é mal compreendida, especialmente no nível de suas subestruturas: a base do vítreo, núcleo, córtex, e hialóide anterior. O núcleo vítreo contém colágenos II, V, IX e XI, juntamente com proteoglicanos sulfato de condroitina, sulfato de heparan proteoglicanos, e. Hyaluronan 1,2 biomarcadores de proteína no núcleo vítreo têm sido associadas a doenças como a retinopatia diabética. 3-5 Como estas proteínas são diferencialmente expressos em cada uma das subestruturas, e em muitos casos, as identidades de proteínas específicas, não são conhecidos. Estas informações podem dar uma visão sobre a origem de proteínas associadas com certas doenças vítreo-retinianas e ajudar a futuras terapias-alvo. Embora o ideal intervalo post mortem para dissecção dos tecidos não foi determinado, a degradação de proteínas pode afetar experimentos a jusante. Por exemplo, imuno-histoquímica é afetado nos olhos de 12 horas pós-morte e algumas atividades de enzima específica pode ser reduzida dentro de algumas horas (observação não publicada). Todos os tecidos no presente estudo foram coletados entre 2 e 8 horas de morte, sem mudanças significativas na expressão da proteína ou da aptidão para analsyis proteômica. O método de congelamento de nitrogênio líquido de preservação é escolhido em detrimento de fixação para evitar pequenas mudanças na estrutura da proteína causada por fixador reticulação, que tem sido demonstrada em outros tecidos por LC-MS/MS. 6 estudos Proteômica dependerá da capacidade de precisão dissecar os diferentes compartimentos do vítreo, como demonstrado nesta experiência de vídeo. Temos validou a técnica de dissecção utilizando 1-dimensional SDS-PAGE. Como nossos resultados sugerem, existem proteínas diferencialmente expressos no corpo várias subestruturas vítreo. A identificação dessas proteínas irá fornecer uma compreensão mais detalhada de compartimentalização vítreo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> 0,12 forceps </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1502 </td></tr><tr><td> 5 cc-seringa </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 309603 </td></tr><tr><td> Pinça reta vestir Com serrilhas </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1400 </td></tr><tr><td> Agulha de calibre 23 </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 305145 </td></tr><tr><td> Colibri forceps </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> 2 / 132 </td></tr><tr><td> Castroviejo em ângulo tesoura de córnea </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E3223 </td></tr><tr><td> Vannas Curved Tesoura Capsulotomia </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E3387 </td></tr><tr><td> Weck-Cel cirúrgica lanças </td><td> Medtronic </td><td> 0008680 </td></tr><tr><td> Westcott Curved Tesoura Tenotomia </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E3320 </td></tr></tbody></table>

dissection of human vitreous body elements for proteomic analysis

O vítreo é uma opticamente clara, matriz extracelular de colágeno, que preenche o interior do olho e recobre a retina. 1,2 interações anormais entre subestruturas vítreo e da retina subjacentes várias doenças vítreo-retinianas, incluindo rasgaduras da retina e descolamento, pucker macular, buraco macular, idade degeneração macular relacionada à tração vítreo, Vitreorretinopatia proliferativa, retinopatia diabética proliferativa, e vitreoretinopathies herdada. 1,2 A composição molecular do vítreo subestruturas não é conhecido. Desde que o corpo vítreo é transparente com acesso cirúrgico limitado, tem sido difícil de estudar suas subestruturas no nível molecular. Desenvolvemos um método para separar e preservar estes tecidos para análise proteômica e bioquímica. A técnica de dissecção neste vídeo experimental mostra como isolar base vítrea, hialóide anterior, o núcleo vítreo, e no córtex vítreo dos olhos pós-morte humana. Unidimensional SDS-PAGE análises de cada componente do vítreo mostrou que a nossa técnica de dissecção resultou em quatro perfis de proteína única correspondente a cada subestrutura do corpo vítreo humano. Identificação de proteínas diferencialmente compartimentada irá revelar as moléculas candidato subjacente várias doenças vítreo-retinianas.

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Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis

Este vídeo mostra uma técnica eficaz para diferenciar e dissecando os vários semi-transparente das estruturas do corpo humano na pós vítreos olhos mortem.

Dissecção da Human Elements Corpo Vítreo para Análise Proteômica

The vitreous is an optically clear, collagenous extracellular matrix that fills the inside of the eye and overlies the retina. 1,2 Abnormal interactions ...

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