Células-tronco pluripotentes induzidas, como células-tronco embrionárias humanas, podem se diferenciar em quase qualquer célula do corpo e, portanto, manter grande promessa no campo da medicina regenerativa.

Células-tronco embrionárias humanas, ou hESCs, são obtidas a partir de embriões pré-implantação, enquanto células somáticas totalmente diferenciadas são usadas para gerar células-tronco pluripotentes induzidas, que também são referidas como iPSCs.

Neste vídeo, você vai aprender sobre os princípios básicos por trás da geração de iPSCs, um protocolo passo-a-passo para induzir pluripotência em células diferenciadas, e algumas das muitas aplicações a jusante e modificações deste protocolo.

Vamos começar discutindo os princípios por trás da geração de iPSCs a partir de tipos de células somáticas.

Células diferenciadas, como células da pele ou neurônios, são as cujo destino é decidido. Eles estão comprometidos em desempenhar uma determinada função. Por outro lado, células-tronco pluripotentes são as cujo destino é indeciso, e podem se diferenciar em qualquer tipo de célula.

O processo de mudança da identidade de uma célula já diferenciada para um estado pluripotente é denominado reprogramação celular. Isso envolve mudar o padrão de expressão genética na célula, pois o número e os tipos de proteínas produzidas por uma célula desempenham um papel importante na definição da identidade de uma célula.

Uma das formas de induzir a reprogramação celular é induzindo a expressão de certos fatores de transcrição. Fatores de transcrição são proteínas que se ligam a sequências regulatórias dentro de um gene. Algumas dessas sequências são chamadas de "promotoras", e, portanto, promovem a transcrição de um gene. Alguns fatores de transcrição podem influenciar a expressão de numerosos genes, o que tem um enorme impacto na identidade celular.

Os quatro fatores clássicos de transcrição que foram demonstrados para induzir pluripotência são Oct4, Sox2, cMyc e Klf4. Esses fatores também são conhecidos como fatores yamanaka, após o pesquisador que descobriu seus efeitos de reprogramação.

Múltiplos métodos podem ser usados para induzir a expressão desses fatores de transcrição. O método mais comum e eficiente é o uso de um vírus modificado para entregar os genes do fator de transcrição no núcleo, onde eles se integrarão ao genoma.

Neste método, os genes que codificam os quatro fatores Yamanaka são embalados individualmente em diferentes retrovírus e adicionados a células diferenciadas. Quando as células são expostas a vírus modificados, uma pequena fração de células diferenciadas são infectadas com todos os quatro vírus portadores de fatores de transcrição. Eles começam a se desdiferir até que grandes aglomerados esféricos de células-tronco pluripotentes sejam formados. A formação de cluster ajuda os iPSCs a criar um microambiente semelhante às células-tronco in vivo e, portanto, ajudá-los a manter sua pluripotência.

Uma vez que você agora entende os princípios básicos por trás da geração de iPSCs, vamos passar por um protocolo geral para induzir pluripotência em fibroblastos embrionários de camundongos, ou MEFs, usando um sistema de transdução viral.

Antes de iniciar este procedimento, observe que os vírus podem infectar as células do seu corpo, por isso seguir as diretrizes de segurança é extremamente importante.

Para iniciar o processo de transfecção, o meio de cultura é removido de uma placa contendo uma alta densidade de MEFs, e as células são lavadas com solução tampão. Em seguida, uma solução contendo uma enzima degradante de proteínas, como a trippsina, é adicionada para levantar as células do fundo do prato. O meio de cultura é então adicionado à placa, e as células separadas são transferidas para um tubo de centrífuga.

Após a centrifugação, a pelota é reinstrito no meio da cultura. Em seguida, as células são contadas e a concentração é ajustada para que um número ideal de células possa ser infectado com vírus no dia seguinte. Incubar as células durante a noite.

Depois que as células se instalam em seu novo prato, a mídia antiga é substituída por mídia fresca, e vírus projetados contendo os fatores de transcrição desejados são adicionados à placa. As células são então incubadas com os vírus por tempo suficiente para permitir que a infecção ocorra. Após a incubação, o meio contendo vírus livres é removido e substituído por um meio de célula-tronco embrionária fresco.

Durante 2-3 semanas após a transformação, as células devem ser cultivadas a 37° em uma incubadora, e os meios de cultura devem ser substituídos diariamente.

Após esse período, colônias iPSC que se parecem com colônias de células-tronco embrionárias devem se tornar grandes o suficiente para serem recolhidas. As colônias podem ser transferidas para uma placa fresca contendo meio com fatores de crescimento adequados, e podem crescer ainda mais. Para confirmar a pluripotência, uma parcela da população celular está manchada com marcadores de pluripotência.

Agora que você viu como gerar iPSCs a partir de células diferenciadas, vamos olhar para algumas aplicações a jusante e modificações deste método altamente útil.

Uma característica importante dos iPSCs é que eles podem ser usados para gerar quase qualquer célula do corpo. Este exemplo mostra a geração de células musculares cardíacas, chamadas cardiomiócitos, a partir de iPSCs. Para isso, os iPSCs são transferidos para placas não aderentes que lhes permitem formar corpos embrionários, que são agregados de células-tronco pluripotentes. Os corpos embrionários são cultivados em meio especializado contendo soro e ácido ascórbico, o que aumenta a diferenciação cardíaca. A diferenciação bem sucedida pode ser facilmente observada quando algumas células começam a bater.

Uma vez que os iPSCs podem potencialmente se diferenciar em qualquer tipo de célula, eles também podem formar um organismo inteiro, como um rato. Isso pode ser feito usando um ensaio chamado complementação tetraploide. Primeiro, um embrião tetraploide, um embrião contendo quatro conjuntos de cromossomos, é formado pela fusão de duas células de um embrião precoce usando um campo elétrico. O embrião tetraploide pode desenvolver-se para o estágio blastocisto. Os iPSCs são então injetados no blastocisto, que é então transplantado em uma fêmea receptora para a gestação. As células tetraploides só são capazes de formar estruturas extraembriônicas como a placenta, de modo que os animais resultantes deste método são derivados inteiramente de iPSCs.

Alguns pesquisadores modificam o procedimento de reprogramação para tornar o processo de identificação de células reprogramadas com sucesso mais eficiente. Por exemplo, neste experimento mefs com a capacidade de expressar proteína fluorescente verde sob a influência do promotor de Oct4 ajudaram os pesquisadores a identificar facilmente células que adquiriram pluripotência.

Você acabou de assistir o vídeo de JoVE sobre a geração de células-tronco pluripotentes induzidas. Este vídeo revisou os princípios por trás desse procedimento e um protocolo passo-a-passo para gerar iPSCs a partir de células diferenciadas. Também revisamos como esse método poderia ser aplicado ou modificado para experimentos em laboratório.

A descoberta de iPSCs teve um enorme impacto no campo da biologia das células-tronco, uma vez que tem um enorme potencial para o desenvolvimento de terapias que podem ser empregadas para tratar doenças degenerativas. Embora muito progresso tenha sido feito com os iPSCs, o obstáculo que ainda precisa ser cruzado é o risco associado de câncer. Os procedimentos de reprogramação atuais têm o potencial de resultar em crescimento celular não regulamentado que pode resultar em câncer. Portanto, mais pesquisas são necessárias para realmente usar iPSCs clinicamente. Como sempre, obrigado por assistir!