This work received the financial support of USDA-ARS CRIS project 6604-21000-004-00D, CRIS project 6604-42000-008-00D, and USAID Feed-the-Future program Agreement number 58-0210-3-012. We thank Valerie Orner, LaTanya Johnson, Joseph Powell and Kathy Gray for their technical assistance. Mention of trade names or commercial products in this article is solely for the purpose of providing specific information and does not imply recommendation or endorsement by the US Department of Agriculture.

1. Construir Molecular e amendoim Transformation <ol><li> Combinar fragmentos de DNA de A. cinco genes flavus, AFL2G_07223 (AFLs ou aflJ), AFL2G_07224 (AFLR), AFL2G_07228 (AFLC / pksA / pksL1), AFL2G_07731 (PES1) e AFL2G_05027 (bomba de efluxo aflatoxina, aflep). Para isso, use os seguintes iniciadores e ultramers: DIR-1, Short-Dir1-R, DIR-2-invertido, Short-Dir2-R, DirAll-NCO-Rv, e DirAll-BamEco-Fw, a Tabela 1. <ol><li> Adicione DIR-1 de cadeia dupla por 5 ciclos de PCR (reacção em 25 mL; 95 ° C 2 min, seguido de 5 ciclos de 94 ° C 45 seg, 55 ° C 30 seg, 68 ° C 15 seg) utilizando polimerase de ADN de acordo com o fabricante do instruções e iniciador Short-Dir1-R para deixar um CCCGT 3 &#39;overhang. Repita essas etapas para fazer DIR-2-invertida cadeia dupla utilizando o iniciador de curto Dir2-R para deixar um ACGGG 3 &#39;overhang complementar a DIR-1. </li><li> Ligadura da Fragme dois 199 pbnts com T4 DNA ligase como por instruções do fabricante. PCR amplificar o fragmento de 393 pb resultante como indicado em 1.1.1, utilizando iniciadores DirAll-CACC-FW e DirAll-NCO-RV (Tabela 1), e clonar o produto usando técnicas convencionais em pENTR1A fazer plasmídeo p2 + 4ENTR. </li><li> Reunir em p2 + 4ENTR em pCAPD 29 (Acesso NCBI: KC176455.1) usando clonase LR II de mistura de enzimas de acordo com as instruções do fabricante para fazer plasmídeo p5XCAPD, e transformá-la em Escherichia coli DH5a, utilizando técnicas convencionais seguidas por sequenciação parcial. Nota: A inserção de ARNi completa é mostrada na Tabela 1. </li></ol></li><li> Transformar Agrobacterium estirpe C58C1 30 com o plasmídeo p5XCAPD como relatado anteriormente 30, e utilizar a bactéria resultante para transformar plantas de amendoim da seguinte forma: <ol><li> Crescer a 30 ° C, a Agrobacterium abrigando p5XCAPD, usar-se para esta, 50 ml de caldo LB suplementado com 500ng ml -1 estreptomicina, 25 ug ml -1 gentamicina, 10 ug ml -1 canamicina e agitar a cultura a 250 rpm até atingir uma OD 260. </li><li> Colher as células de Agrobacterium por centrifugação (6000 x g) durante 10 minutos, ressuspender em 50 ml AB meio mínimo 31 com 100 acetosiringona mM durante 1 hora e lugar na suspensão bacteriana nos explantes de 10-14 dias da germinação Exp27-1516, corredor -tipo linhagem de amendoim. Secar os explantes em 3MM papel absorvente após 30 min, e colocá-los em meio shoot-indução (SIM) [MS sal de 32, 3% de sacarose, 20 mM benzilaminopurina (BAP), thidiazuron 10 mM (TDZ), pH 5,8, 0,3 % de goma de gel] sem antibióticos no escuro por três dias. </li><li> Faça a seleção e regeneração tecidual, como relatado anteriormente 33. Mova tecidos para o SIM (cefotaxima 500? M e 100 M canamicina) para a formação de filmagem, com transferências bi-semanais durante 2 meses. Então lugarexpansão brotos em meio shoot-alongamento (SEM) [5 mM BAP, giberelina 1 PM (GA 3)], bi-semanal por vários meses. </li><li> Coloque tiros individuais, 2 cm de tamanho, em meio-indução de raízes (RIM) [1/2 MS, 1,5% de sacarose, ácido α-5? M-naftaleno acético (ANA), 2,5 mM de ácido indolbutírico (IBA)], em seguida, se aclimatar as mudas e transferi-los para o efeito estufa. </li></ol></li></ol> 2. Identificação de plantas de amendoim abrigar RNAi para silenciar genes aflatoxina Síntese <ol><li> Uso planta mini-kit em uma estação de trabalho do robot com 200 eluição ul de acordo com as instruções do fabricante para extrair DNA a partir de folhas jovens de plantas de amendoim que eram sujeitas ao processo de transformação (conforme descrito anteriormente) com o RNAi construir p5XCAPD (Figura 1) que tem como espinha dorsal plasmídeo pCAPD 29 para o silenciamento do gene. </li><li> Tela as amostras de DNA de um único tubo de nested PCR (STN-PCR), como descrito PREVIously 34 para detectar o marcador selecionável NPTII e o RNAi inserir a partir p5XCAPD. Clonal propagar de cortes (3-4 nós) de PCR positivos plantas para produzir sementes suficientes para testes nesta primeira geração. <ol><li> Use quatro diluições de 2 vezes de ADN (50-100 ng mL -1 antes da diluição) em todas as reacções de PCR-STN. Para NPTII, utilizar os iniciadores externos PCAPD 5714F: 5&#39;- AGGCTATTCGGCTATGACTG-3 &#39;e 6446R PCAPD: 5&#39;-CGTCAAGAAGGCGATAGAAG-3&#39;, e os iniciadores internos PCAPD 5730F: 5&#39;- ACTGGGCACAACAGACAATC-3 &#39;e 6249R PCAPD: 5&#39;-ATATTCGGCAAGCAGGCATC- 3 &#39;. </li><li> Para a detecção de ARNi inserir em reacções de STN-PCR utilizam iniciadores externos 35S-PDSFw: 5&#39;-CCTAACAGAACTCGCCGTAA-3 &#39;e DirAll-NCO-RV: 5&#39;-ATGCCATGGGGTTATTGGGTGCAGAATGG-3&#39; iniciadores internos, e Probe_5027_Fw: 5&#39;-3-gtatttgtgaccatgtttctg &#39;e Probe_7228_Rv: 5&#39;-GGACGGATAGTAAACTGCGG-3&#39;. </li></ol></li><li> Colheita das vagens das plantas positivas STN-PCR e da con<html> trolo plantas cultivadas nas mesmas condições. Passo crítico: Certifique-se de que o controle de plantas são cultivadas nas mesmas condições e na mesma estação como as plantas RNAi. Explosão da água das vagens com uma lavadora de alta pressão em baixa intensidade ou raspar com a mão para remover exocarp, determinar a cor do mesocarpo, colocando as vagens em uma placa de maturidade e vagens separados em grupos (amarelo, laranja, marrom e preto) 35 (Figura 2). </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig2.jpg" /> Figura 2. Preparação de vagens de amendoim para análise. Esquerda: amendoim tamanhos diferentes encontrados na colheita como amendoim é uma planta de crescimento indeterminado; Center: colocação de amendoim na cesta do metal para a remoção de pressão de água de exocarp; Direita: grupos de maturação de cor mesocarpo em uma placa de perfil de amendoim (amarelo, laranja, marrom e preto).&quot;Target =&quot; _ blank 98fig2large.jpg &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 3. Setup Experimental <ol><li> Remover a casca, o processo de amarelo e castanho sementes separadamente. Calcule o número de sementes para uso no experimento de acordo com a Tabela 2. Note-se que, no mínimo, três pedaços de sementes (parte 1 semente = metade de cotilédones) por linha de amendoim e data de amostragem é necessário para realizar uma análise estatística e reduzir o erro padrão. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr height="33"><td height="33" style="height:33px;width:147px;"> Nome </td><td colspan="3" style="width:421px;"> Seqüência </td></tr><tr height="124"><td height="124" style="height:124px;"> DIR-1 </td><td colspan="3" style="width:421px;"> 5&#39;- GCCAGCTCAAAAGTGCGATGCACCAAGGAGAAACCGGCCTGTGCT CGGTGTATCGAACGTGGTCTTGCCTGTCAATACATGGTCGTATTTG TGACCATGTTTCTGGTGGCATTGGACCGTCTTGTCATCTCTACAGCC ATTCCCCAGATCACGGACGAATCCCCTGCATCTACGCGCACGCATC ACTTGGGGTACCCGT-3 &#39; </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;"> Curto-R-Dir1 </td><td colspan="3" style="width:421px;"> 5&#39;-Fosfato-TACCCCAAGTGATGCGTGCGCG-3 &#39; </td></tr><tr height="126"><td height="126" style="height:126px;"> DIR-2-invertida </td><td colspan="3" style="width:421px;"> 5&#39;- GGTTATTGGGTGCAGAATGGTAAACCACCCAACAGTACGCGAAATG TCAATTCCAGAGTCCCAAACCTCCCTACCGTGGCCTGGACGGATAG TAAACTGCGGAGCTTGGGAACAAAATCCGCTGTCTGATCGCCGAAG AGAAAGAGTTGCCTTGATTGAGCCGCATCGAGGACAGGTTGTGTTG CTGTTGATAGACGGG-3 &#39; </td></tr><tr height="29"><td height="29" style="height:29px;"> Curto-R-Dir2 </td><td colspan="3" style="width:421px;"> 5&#39;-Fosfato-CTATCAACAGCAACACAACC-3 &#39; </td></tr><tr height="30"><td height="30" style="height:30px;"> DirAll-CACC-FW </td><td colspan="3" style="width:421px;"> 5&#39;-CACCGCCAGCTCAAAAGTGCGATGC-3 &#39; </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;"> DirAll-NCO-Rv </td><td colspan="3"> 5&#39;-ATGCCATGGGGTTATTGGGTGCAGAATGG-3 &#39; </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;"> DirAll-BamEco-FW </td><td colspan="3" style="width:421px;"> 5&#39;-ATGGGATCCGAATTCGCCAGCTCAAAAGTGCGATGC-3 &#39; </td></tr><tr height="197"><td height="197" style="height:197px;"> Inserção RNAi completa </td><td colspan="3" style="width:421px;"> 5&#39;- GCCAGCTCAAAAGTGCGATGCACCAAGGAGAAACCGGCCTGTGCT CGGTGTATCGAACGTGGTCTTGCCTGTCAATACATGGTC / GTATTTG TGACCATGTTTCTGGTGGCATTGGACCGTCTTGTCATCTCTACAGCC ATTCCCCAGATCACGGACGAAT / CCCCTGCATCTACGCGCACGCAT CACTTGGGGTACCCGTCTATCAACAGCAACACAACCTGTCCTCGAT GCG / GCTCAATCAAGGCAACTCTTTCTCTTCGGCGATCAGACAGCG GATTTTGTTCCCAAGCTCCGCAGTTTACTATCCGTCCA / GGCCACGG TAGGGAGGTTTGGGACTCTGGAATTGACATTTCGCGTACTGTTGGG TGGTTTACCATTCTGCACCCAATAACC-3 &#39; </td&gt; </tr></tbody></table> . Tabela 1. Oligonucleotides e ultramers utilizados para construir o RNAi construir p5XCAPD Phos: fosforilada extremidade 5 &#39;; &quot;/&quot; Separa os fragmentos de genes cinco utilizado; Inserção completa RNAi: sequência utilizada como 2 repetições invertidas para formar p5XCAPD. <ol start="2"><li> Coloque sementes de amendoim inteiros em uma única camada de forma a cobrir a parte inferior de um copo estéril. Adicionar solução de 75% de etanol / água (v / v) para cobrir as sementes e, em seguida, adicionar um volume igual da mesma solução. Incubar à temperatura ambiente por 30 segundos e, em seguida, enxágüe com água deionizada estéril (ADE). </li><li> Adicionar 2% de hipoclorito para a proveta contendo as sementes de etanol tratada como se segue: adicionar suficiente solução de hipoclorito de 2% para cobrir as sementes, em seguida, adicionar um volume igual da mesma solução e incubar durante 5 min. Passo crítico: Lavar cuidadosamente três vezes com um volume de SDW equivalente a 5 vezes o volume de hipoclorito usado (Figura 3). </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig3.jpg" /> Figura 3. Instalação experimental. Top: Superfície de esterilização de sementes de amendoim antes e depois de hipoclorito, a remoção do tegumento (testa); Oriente: remoção de embrião e ver de perto embrião, em seguida, corte cotilédones ao meio; inferior: cotilédones meio em água destilada estéril, apagando no absorvente estéril papel, mossas em ágar água, e colocação dos cotilédones meio (corte lateral para cima) sobre a superfície do ágar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol start="4"><li> Permitir que as sementes esterilizadas de superfície para absorver submersa em SDW durante 2 horas. Coloque as sementes em uma placa de Petri estéril, remover os casacos de semente com uma pinça, separe os cotilédones, e com um bisturi remover os embriões. Nota:Os embriões podem ser descartados ou usados ​​para regenerar plantas novas. </li><li> Corte cada cotilédones ao meio usando um bisturi. Para evitar desidratação, manter as peças de sementes corte em água estéril até que todas as sementes são processadas. </li><li> Ter preparado placas de Petri contendo ágar água estéril (1,5% de agar / água; w / v), um para cada um de três pedaços de sementes. Faça pequenas amolgadelas no agar usando uma pinça, seque rapidamente o excesso de água dos pedaços de sementes em toalhas de papel estéreis, e em seguida, coloque os pedaços de sementes (corte rosto para cima) nas placas de agar de água /. </li><li> A partir de uma cultura fresca de aflatoxigênicos Aspergillus flavus NRRL 3357 num meio de agar de Czapek cultivadas a 25 ° C durante 10 dias, preparar uma suspensão de 50.000 esporos por mL SDW, contadas com um hemocitómetro. </li><li> Coloque 2 ml da suspensão de esporos sobre as superfícies de corte de cada peça semi-cotilédone evitando o escoamento nos lados, para garantir que os esporos se exposto ao tecido da semente que abriga RNAi (Figura 4). </li&gt; </ol><img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig4.jpg" /> Figura 4. Inoculação e incubação para a análise das aflatoxinas. Top: Metade cotilédones, a inoculação com suspensão de esporos, e Aspergillus flavus crescimento micelial em metade cotilédone após 24 horas de incubação inferior: esquerda:. Incubação de 48 h em 1,5% agar; Centro: incubação durante 72 horas em 1,5% agar; direita:. exemplo de configuração experimental incorreta, a incubação durante 72 horas em 0,5% agar <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol start="9"><li> Incubar as placas de Petri contendo os cotilédones inoculados meio e não inoculadas a 30 ° C no escuro até à colheita. </li></ol> 4. A amostragem para análise de aflatoxina e Expressão Gênica <ol><li> Coletar amostras emtriplicado, a 24, 48 e 72 h (96 h opcional) de incubação, tanto por RT-PCR e para a análise das aflatoxinas, cada replicar sendo uma peça (metade cotilédone). Escolha amostras aleatoriamente em diferentes placas em cada data de amostragem. Utilizando um tecido, suavemente remover esporos de fungos e excesso de ágar antes de colocar pedaços de sementes em frascos ou tubos de ensaio. </li><li> Para a análise das aflatoxinas, coloque cada repetição (uma peça) em um 4 ml parafuso tampa do frasco de vidro e armazenar a -80 ° C. Nota: Dada a estabilidade química de aflatoxinas, as amostras podem ser armazenados nesta condição durante vários meses (em experiências actuais normalmente 1-2 meses). </li><li> Para RT-PCR lugar cada repetição (uma peça) já preparada em 2 ml tubos contendo duas esferas de aço inoxidável (2,5 mm diam) e três esferas de zircônio (2 mm diam) moagem. </li><li> Congelar imediatamente (de preferência em azoto líquido) todas as amostras e mantê-las a -80 ° C até processamento. </li></ol> 5. Aflatoxina Análise Individual de Meio Cotyledon Pieces <ol><li> Use a A. flavus inoculadas amostras para esta análise. Trazer amostras à temperatura ambiente durante cerca de 30 min, adicionar quatro volumes (geralmente 2-3 ml; w / v) de metanol (manter registro para cálculos posteriores), feche as tampas, e incubar O / N (~ 16 horas) no escuro sem agitação. </li><li> Coloque uma frita numa minicoluna combinando 1,5 mL de propileno, adicionar 200 mg de base Al 2 O 3 e cap com outro filtro poroso 36 como descrito anteriormente; em seguida, coloque um Ultra-High Performance Liquid Chomatographer (UPLC) frasco autosampler sob a coluna de perto o suficiente para evitar possível evaporação do eluato. </li><li> Num tubo de ensaio de vidro descartável (não usar plástico), coloque 0,5 ml de extracto de metanol obtido no passo 4.1, adicionar 0,5 mL de acetonitrilo, mistura com uma pipeta e aplicar 0,5 ml da mistura para a coluna, preparada no passo 4.2. Permitir eluição no frasco amostrador automático por gravidade (não aplique pressão). Eluição normalmente leva 2-4 min, perto the frasco imediatamente usando um boné compatível UPLC com septos. Manter os frascos à temperatura ambiente e analisá-los no mesmo dia em um UPLC. </li><li> Para a separação de aflatoxinas, frascos lugar amostrador automático de amostras contendo eluatos e frascos de auto-amostragem com padrões de aflatoxinas (B 1 e B 2 quando se utiliza A. flavus) em um instrumento UPLC equipado com uma correspondência Gerente UPLC Quaternário solvente, UPLC Sample Manager, UPLC fluorescente Detector, e um 2.1 mm x 50 mm 18 C, de 1,7? m. <ol><li> Usar uma fase móvel isocrática constituída por água / MeOH / CH3CN (64:23:13, v / v / v) de mistura a uma taxa de fluxo de 0,30 ml min -1. Obter cromatogramas que assegurem uma separação da linha de base estabilizada para o cálculo preciso da concentração de aflatoxina, de acordo com as instruções do fabricante 37. </li><li> Confirmar a identidade de aflatoxinas através da obtenção de seus dados em massa espectral e comparando-os com os dados publicados 38. Use um ino espectrómetro de massa de armadilha equipado com uma interface de ESI e software correspondente de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol></li><li> Determinar as concentrações de aflatoxinas por referência a curvas de calibração obtidas por injecção de diferentes quantidades de correspondentes padrões comerciais de aflatoxinas B 1, B 2, G 1 e G 2, tal como sugerido pelo fabricante e UPLC determinado pelo software 37. </li><li> Coloque pedaços de sementes já extraída com metanol, em frascos de vidro individuais para O / N (~ 16 horas) liofilização para determinar o seu peso seco. Em seguida, calcular a concentração de aflatoxina em ng. G -1 de peso seco de parte da semente. </li><li> Para a análise dos dados, converter resultados de aflatoxinas para login (ng. G -1 +1), seguido pelo teste de Tukey para comparação média. </li></ol> 6. Gene Expression, Processamento de RT-PCR de amostras <ol><li> Pegue os 2 ml de moagem tubos contêming amostras do freezer -80 ° C, e imediatamente (sem descongelar) triturá-los num homogeneizador moinho de esferas em 3100 rpm durante 40 segundos, em seguida, proceder à extracção de ARN usando Trizol de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Preparar a partir de cada amostra de ADNc utilizando ARN de 1 ug e quantidades iguais de oligo dT e hexâmeros aleatórios, efectuar uma diluição de 1: 8 e o ADNc de usar 2 ul por reacção de RT-PCR (como descrito anteriormente 39). <ol><li> Para a detecção da expressão de ARNi usar INSERT iniciadores: RT_5X_1_105F: 5&#39;GGTGGCATTGGACCGTCTTG-3 &#39;, RT_5X_1_232R: 5&#39;-CGCATCGAGGACAGGTTGTG-3&#39;; e RT_5X_2_95F: 5&#39;-CCATGTTTCTGGTGGCATTG-3 &#39;, RT_5X_2_229R: 5&#39;-ATCGAGGACAGGTTGTGTTG-3&#39;. </li><li> Para a detecção de expressão do marcador seleccionável NPTII, utilizar iniciadores: RT_NPTII_1_6871F: 5&#39;-CTCGCTCGATGCGATGTTTC-3 &#39;, RT_NPTII_1_7004R: 5&#39;-GCAGGATCTCCTGTCATCTC-3&#39;. Use o gene de manutenção actina para a normalização, e primers: actina-Fw: CACATGCCATCCTTCGATTG; Actina-Rv: CCAAGGCAACATATGCAAGCT 40. </li></ol></li><li> Analisar os resultados por Delta-delta método C T 41 padronizado para a expressão de actina. Representam os resultados como vezes de aumento sobre o controlo. </li></ol>

The authors have nothing to disclose or any conflicts of interest.

Planta-hospedeiro RNAi mediada por silenciamento de genes em fungos patogénicos foi demonstrada 27,43, no entanto, não existem publicações que mostram a viabilidade do controlo de RNAi mediada por acumulação de micotoxinas em plantas. Um factor limitante para estes estudos em amendoim foi a falta de um método para avaliar um não-aflatoxina fenótipo acumulação em plantas individuais, como as folhas não apresentam sintomas após infecção fúngica das vagens subterrâneas. Além disso, o acúmulo de não-normalmente distribuídos de aflatoxinas, ea necessidade de grandes amostras para análise química 15,16 dificultaram a quantificação do potencial efeito RNAi em uma única planta. O método aqui apresentado consiste em 72 experiências de RH utilizando cinco sementes para executar três amostragens de 24 horas de intervalo, em triplicado (Tabela 1, Figura 7). Em comparação com a análise típica aflatoxina que requer não menos do que 100 g de sementes, o nosso método é particularmente adequado para individuaL eventos transgénicas de plantas de amendoim que inicialmente não produzem mais do que dois ou três vagens. Silenciamento mediado ARN-síntese de aflatoxina foi demonstrada por transformar geneticamente Aspergillus flavus e A. parasiticus. Desde AFLR é um regulador principal de produção de aflatoxinas em A. flavus e A. parasiticus 44,45, torna-se um alvo interessante para o silenciamento mediado ARN em plantas. No entanto, variações genéticas nos AFLR foram mostrados entre espécies Aspergillus 46, e essas variantes genéticas poderiam escapar silenciamento se não existe uma sequência perfeita correspondência com o sinal de ARNi produzido no hospedeiro planta. Assim, AFLR foi um dos alvos para silenciar no vetor p5XCAPD, mas não foi o único. Repetições invertidas do gene AFLR introduzidos A. flavus e A. parasiticus por transformação resultou em silenciar e mínimo ou nenhum produtoion de aflatoxinas 47 (McDonald et al., 2005b). Além disso, o silenciamento do gene Afld impedido a produção de aflatoxina em até 98% em A. flavus e A. parasiticus em transformação direta 48. Para aumentar a probabilidade de sucesso no nosso sistema, de amendoim foi transformada com fragmentos de repetição invertida de cinco genes envolvidos na produção de aflatoxinas em A. flavus. Aqui mostra-se que o uso de p5XCAPD que tem como alvo para silenciar vários genes na via de síntese de aflatoxina, 90% -100% de níveis mais baixos de aflatoxina B 1 e B 2 foram obtidos de acordo 288-72, e níveis mais baixos de 60-100% em acumulada A linha 288-74 em comparação com o controlo, quando cotilédones meio foram inoculados com A. flavus, as Figuras 4, 7. Mais importante ainda, este método detectou diferenças estatisticamente significativas na acumulação de aflatoxina por linhas 288-72, 288-74 contra o controle durante o experimento, aplicando statis paramétricotiques, a Figura 7. Dado o pequeno tamanho da amostra, é importante destacar a necessidade de usar um método poderoso para detectar aflatoxinas, estas experiências foram analisadas por UPLC que tem uma alta resolução, cinco vezes maior desempenho e três vezes maior sensibilidade do que HPLC 49. Expressão da RNAi inserção em 288-74 só foi detectada em cotilédones imaturos (amarelo) em 24 horas de incubação. A inserção RNAi não foi detectado por RT-PCR em cotilédones maduros de 288-74 às 24 horas, ou em qualquer grupo de maturação em 48 horas, a Figura 6. Este mesmo fenômeno foi observado em outras linhas de amendoim transgênicas de RNAi (Arias, RS, 2015 não publicado), onde normalmente transcritos de ARNi foram detectadas apenas em cotilédones imaturos às 24 h. As amostras de RNA foram tratadas com DNase antes da síntese de ADNc, os dados foram normalizados para o nível de expressão de actina e nenhuma evidência de contaminação do ADN foi observada. No caso de o ADN ter estado presente nas amostras, que deveriaforam detectados nas amostras de 48 h, bem como, de forma consistente, mas que não foi o caso. A expressão sob o controlo do promotor 35S-nem sempre é uniforme; ele pode ser afetada pelas condições ambientais 50, tipo de tecido e estágio de desenvolvimento 51,52. Ao mesmo tempo, na via de interferência de ARN, a taxa de decaimento do mRNA e a taxa de decaimento siARN pode variar significativamente 53. É possível que a rápida degradação do ARNm por o mecanismo de interferência de ARN poderia ter evitado a detecção de ARNm de 48 horas de incubação. Se a ausência de expressão em 48 horas foi devido a baixa 35S-promotor impulsionado transcrição, ou a degradação rápida de dsRNA por Dicer continua a ser respondida. Assim, a detecção de pequenos RNAs de alto rendimento de sequenciamento daria uma melhor visão sobre os processos que ocorrem por meio de RNAi 54 Nestas experiências. No entanto, desde RNA silenciamento espalha sistemicamente, principalmente através do floema de photosyntodeio fontes à sacarose pias (neste caso, amendoim sementes) 55, o silenciamento de aflatoxina-síntese pode ocorrer em sementes sem expressão local do RNAi inserção. Muita pesquisa ainda precisa ser feito para determinar o nível de limiar de pequenos RNAs de interferência (siRNAs) necessários para evitar a acumulação de aflatoxina em sementes. É importante ressaltar o fato de que ambos, a expressão do mRNA do RNAi construir (Figura 6), ea acumulação de aflatoxinas B 1 e B 2 (Figura 7) apresentaram resultados diferentes para imaturo (amarelo) vs. madura (marrom) cotilédones. Plantas de amendoim têm crescimento indeterminado, isto é, eles apresentam no momento da colheita de uma gama de vagens de maturidade, Figura 2. Além disso, as sementes a partir de diferentes grupos de maturação diferem na sua composição química, por ex., 2,4% de sacarose nas sementes imaturas, e 1,9% em sementes maduras, nas mesmas condições de campo 56,57. Assim, para entender a efic realy de controlo mediada por ARN-acumulação de aflatoxina, é importante analisar separadamente grupos de maturação. A defesa natural de sementes de amendoim é a produção de fitoalexinas, que varia na diversidade de compostos produzidos e suas quantidades relativas, dependendo da maturidade das sementes e das condições ambientais 58-61, e é particularmente maior em embriões em comparação com 62 cotilédones. Os embriões também têm concentrações significativamente maiores de ácidos nucleicos, tanto DNA e RNA do que os cotilédones (RS Arias, não publicados). Como sementes de amendoim amadurecer, mudanças em sua fisiologia e composição química ocorrer 63. Antioxidantes fenólicos em forma de amendoim testa taninos condensados ​​com atividade fungistática 64; este é também evidente na cor mesocarpo que reflete estágios de maturidade, amarelo para preto 35, como o seu teor de taninos e compostos fenólicos aumenta com a maturidade de 65. Assim, a presença de tESTA ou embriões no experimento, dadas as suas propriedades antimicrobianas, pode ter limitado o crescimento de fungos e, portanto, sobrestimada o efeito de silenciamento de RNAi, por conseguinte, eles foram removidos. Além disso, a remoção dos embriões Testa e ajuda a limitar as fontes de variação na análise, como a metade cotilédone que transporta o embrião terá mais fitoalexinas e mais conteúdo de RNA. Em adição à análise por grupos de maturação e remoção do tegumento e embrião nestas experiências, é importante salientar mais algumas observações: a) embora os resultados são mostrados por até 96 horas de incubação, é recomendado o uso de não mais do que 72 hr para obter resultados consistentes, como sementes se degradado por 96 horas; e b) Considerando cotilédones meia da mesma semente, embora selecionadas aleatoriamente, não constituem amostras perfeitamente independentes, RT-PCR e acumulação de aflatoxina dentro de eventos transgênicos mostrou pouca variação entre as sementes. Além disso, contar um esporo do fungo precisa, volume de inóculoS de 2 mL, e a aplicação de esporos sobre a superfície de corte dos cotilédones evitando gotejamento sobre os lados são importantes para assegurar que os esporos germinados são expostos para o tecido da planta. A água / agar nas placas deve ser de 1,5% (w / v), mais macio faz com que o escoamento de agar de esporos, como mostrado no último quadro da Figura 4 (em baixo). Deve disponibilidade semente transgénica a partir de um evento especial, ser limitado, a amostragem pode ser feita em duplicado em triplicado, em vez de se obterem resultados semelhantes (ou seja, Figura 7); no entanto, as amostras em triplicado vai ajudar a reduzir o erro padrão. A única limitação deste método é que ele exige um sistema altamente sensível (UPLC) para a detecção de aflatoxina / quantificação, mas, ao mesmo tempo que reduz a probabilidade de sobrestimar o efeito de RNAi deve aflatoxinas não ser detectado por meio de métodos menos sensíveis. Em conclusão, este método oferece pela primeira vez um método fiável para estudar oefeito de RNAi no controlo das aflatoxinas. Reduzindo o tempo para uma experiência de uma safra inteira para menos de uma semana, este método irá tremendamente acelerar a investigação sobre RNAi-amendoim / Aspergillus patossistema para a mitigação e / ou eliminação de aflatoxinas.

Cerca de 4,5 bilhões de pessoas estão cronicamente expostos a aflatoxinas 1, os agentes cancerígenos mais poderosas conhecidas na natureza 2. Estas micotoxinas contaminam 25% das culturas alimentares no mundo 3, incluindo milho, mandioca, arroz, nozes, cereais e especiarias. 4. As aflatoxinas causam raquitismo em crianças de 5, prejudicar o sistema imunológico 6, estão presentes em 58% dos carcinomas hepatocelulares-em biópsias humanos 7,8, e matar centenas de pessoas durante os surtos periódicos de aflatoxicosis 9,10. As aflatoxinas são micotoxinas derivadas de policï¿½ido normalmente produzidas por Aspergillus flavus e A. parasiticus; aflatoxinas B 1 e B 2 são produzidos por A. flavus, enquanto A. parasiticus também produz L 1 e L 2. A estrutura química destes compostos e um cromatograma que mostra a separação por UPLC são mostrados na Figura 1. </strong&gt; <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig1.jpg" /> Figura 1. As aflatoxinas e RNAi inserir Top:. Estrutura química (esquerda) e exemplo de cromatograma (à direita) dos quatro aflatoxinas derivados de policï¿½ido mais comuns: B 1, B 2, G 1 e G 2, produzida por Aspergillus parasiticus, A . flavus produz B 1 e B 2 inferior: Esquema de fragmentos de genes no RNAi construir p5XCAPD utilizado para transformação de amendoim, números sob setas são números de genes-fragmento de adesão no genoma Aspergillus flavus;. PIV2: intrão de batata; pares de bases;: pb RT_5X_1 e RT_5X_2:. Real-Time PCR locais iniciadores <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Sozinho perdas econômicas nas exportações devido a aflatoxinas em amendoim ultrapassar US $ 450 milhões de dólares norte-americanos, se calculado com base no 4 ng. G -1 limite de aflatoxina permitidos para consumo humano na União Europeia 11. As aflatoxinas são conhecidos há 60 anos 12; no entanto, embora muitas práticas agrícolas foram desenvolvidos para mitigar seus efeitos, incluindo a aplicação de outras cepas fúngicas 13,14, nenhum método coerente de controlo existe, e variedades de plantas resistentes não estão disponíveis. Teste de germoplasma de plantas para resistência a aflatoxinas é particularmente difícil, porque mesmo sob condições propícias para a invasão do patógeno, a acumulação de micotoxinas é imprevisível e não segue uma distribuição normal. Assim, as experiências geralmente requerem grandes áreas de plantação, centenas de sementes e várias amostras de 100-1,700 g para reduzir a variabilidade de dados a 15,16. Interferência de ARN foidescobriram em 1998 17; e os benefícios de &quot;silenciar&quot; estão actualmente a ser explorada em uma série de novas aplicações, por exemplo., em terapias humanas contra o câncer de mama metastático 18, câncer de fígado 19, leucemia mielóide 20, e na protecção das plantas contra insetos e nematóides 22 21. Nas plantas, sinais de interferência de RNA pode viajar uma célula para outra, com pequeno RNA de interferência (siRNA) e RNA de elevado peso molecular sendo responsável pelo pós-transcricional gene silenciamento sistêmica 23,24, mesmo dentro de fungos patogénicos que estão em contato próximo com planta hospedeira 25. A eficácia do RNAi na silenciamento mediado por planta de genes de fungos-patógeno foi descrito em alguns patossistemas de plantas, para estes, exame visual dos sintomas na parte aérea das plantas (folhas) permitiu a quantificação da doença, ou seja, oomiceto Bremia em alface 26 , no trigo Puccinia <sup&gt; 27 e Fusarium em 28 de banana. Muito mais difícil é para avaliar a eficácia de ARNi para controlar micotoxinas em plantas, particularmente as aflatoxinas em amendoins como as folhas não apresentam sintomas de infecção, os órgãos invadidos (sementes) estão sob várias polegadas de solo, a ocorrência de infecção é imprevisível, e apenas química análise pode determinar a presença de aflatoxinas. Além disso, cada evento transgênico no amendoim normalmente produz poucas sementes (4-6 por planta); Portanto, o teste tradicional para um não-acumulação de aflatoxina traço em grandes parcelas de terreno, com duração de safras inteiras, e usando centenas de sementes não é viável. É descrito um método para analisar aqui em menos de uma semana, de ARNi sementes de amendoim para a presença de transgene e para um não-aflatoxina acumulação traço, usando apenas poucas sementes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="597">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:256px;">Primers, oligonucleotides</td>
			<td style="width:127px;">DNA Technologies, Coralville, IA, USA</td>
			<td style="width:123px;">n/a</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Dneasy Plant Mini Kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen, Valencia, CA</td>
			<td style="width:123px;">69106</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:256px;">Czapek Dox agar medium</td>
			<td style="width:127px;">Oxoid, by Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:123px;">CM0095</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Agar</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:123px;">BP 1423</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Freezer -80&#176;C</td>
			<td style="width:127px;">n/a</td>
			<td style="width:123px;">n/a</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">Aluminum Oxide, Al2O3</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A941</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:256px;">SPE Reservoirs 1.5 mL</td>
			<td style="width:127px;">Grace Davison Discovery Scientific</td>
			<td style="width:123px;">210011</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Frits for 1.5 mL SPE reservoir</td>
			<td style="width:127px;">Grace Davison Discovery Scientific</td>
			<td style="width:123px;">211401</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Autosampler vials</td>
			<td style="width:127px;">Waters Corporation, Milford, MA</td>
			<td style="width:123px;">186005221</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="150">
			<td height="150" style="height:150px;width:256px;">Waters Acquity Ultra-Performance Liquid-Chromatography (UPLC) instrument; UPLC-H-Class Quaternary Solvent Manager; UPLC Sample Manager; UPLC Fluorescent detector (FLR); UPLC BEH C18 2.1mmx50mm, 1.7mm column</td>
			<td style="width:127px;">Waters Corporation, Milford, MA</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:256px;">Finnigan LCQ Advantage MAX ion trap mass spectrometer, with Xcalibur version 1.4 software</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Electron Corp., San Jose, CA</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Aflatoxin standards, B1, B2, G1 and G2</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:123px;">A6636; A9887; A0138; A0263</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Systat Software 12.2</td>
			<td style="width:127px;">SYSTAT Software Inc., Point Richmond, CA</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">Trizol reagent</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">15596-018</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">SuperScript III First Strand Synthesis Super Mix</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">11752-050</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:256px;">ABI 7500 Real-Time PCR</td>
			<td style="width:127px;">Lifetechnologies, Grand Island, NY</td>
			<td style="width:123px;">4406984</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">Luria Broth-Miller</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">R453642</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">pENTR1A</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">A10462</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">LR Clonase II enzyme mix</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">11791-020</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:127px;">NEB Biolabs</td>
			<td style="width:123px;">M0202L</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Gelrite</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:123px;">G1919</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:123px;">D134406</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:256px;">QIAcube robot workstation</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen, Valencia, CA</td>
			<td style="width:123px;">9001292</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:256px;">Antibiotics: kanamycin, cefotaxime, gentamicin; streptomycin</td>
			<td style="width:127px;">Goldbio, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:123px;">cef.: C-104-25; kan: K-120-5; gent.: G-400-1; strep.: S-150-50</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:256px;">Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">11304-029</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rnai-mediated control of aflatoxins in peanut: method to analyze mycotoxin production and transgene expression in the peanut/aspergillus pathosystem

A Organização para a Alimentação e Agricultura das Nações Unidas estima que 25% das lavouras de alimentos do mundo estão contaminados com aflatoxinas. Isso representa 100 milhões de toneladas de alimentos a ser destruídos ou desviados para consumo não humano a cada ano. As aflatoxinas são substâncias cancerígenas poderosos normalmente acumulados pelos fungos Aspergillus flavus e A. parasiticus em cereais, nozes, tubérculos e outros produtos agrícolas. O silenciamento de genes cinco aflatoxina-síntese através de interferência de RNA (RNAi) em plantas de amendoim foi usada para controlar a acumulação de aflatoxina a seguir à inoculação com A. flavus. Anteriormente, existia nenhum método para analisar a eficácia de RNAi em eventos transgênicos amendoim indivíduo, uma vez que estes geralmente produzem poucas sementes e os métodos tradicionais de grandes experimentos de campo em condições de aflatoxinas-propício não foram uma opção. No campo, a probabilidade de encontrar sementes naturalmente contaminadas é muitas vezes 1/100 a 1/1,000. Além disso, a contaminação por aflatoxinas não é uniformemente distribuída. O nosso método utiliza algumas sementes por modificação genética, com pequenos pedaços processados ​​para PCR em tempo real (RT-PCR) ou pequena sequenciação de ARN, e para a análise da acumulação de aflatoxinas por cromatografia líquida de ultra-desempenho (UPLC). Linhagens de amendoim expressando RNAi 288-72 e 288-74, mostrou redução de até 100% (p≤0.01) em aflatoxina B 1 e B 2 em comparação com o controle que acumulou até 14.000 ng. G -1 de aflatoxinas B 1, quando inoculadas com A. aflatoxigênicos flavus. Como referência, o total máximo de aflatoxinas permitidos para consumo humano nos Estados Unidos é de 20 ng g -1.. Este protocolo descreve a aplicação do controlo mediado por RNAi de aflatoxinas em sementes de amendoim transgénicos e métodos para a sua avaliação. Acreditamos que a sua aplicação no melhoramento de amendoim e outras culturas trará rápido avanço nesta importante área da ciência, Medicina e nutrição humana, e irá contribuir significativamente para o esforço internacional para controlar aflatoxinas e, potencialmente, outras micotoxinas nos principais culturas alimentares.

Plasmídeo p5XCAPD foi feito como um derivado do pCAPD 29, e é usado para transformar plantas de amendoim; este vector carrega repetições invertidas de cinco pequenos fragmentos, 70-80 pb cada, de genes aflatoxina-síntese de A. flavus separados por um intrão (Figura 1). Fragmentos de AFL2G_07224 (AFLR), AFL2G_07223 (AFLS ou aflJ), AFL2G_05027 (bomba de efluxo de aflatoxina, aflep), AFL2G_07228 (AFLC / pksA / pksL1), e AFL2G_07731 (PES1) foram utilizados para a construção, os números na Figura 1 corresponder a um . flavus genoma anotação no Broad Institute, Cambridge, MA, ea literatura 42. Um total de 99 linhas de amendoim foram regenerados depois de passar pelo processo de transformação, 50 foram PCR positivo para NPTII detectado pela STN-PCR, e 33 linhas foram PCR positivos e sementes produzidas. Apenas sete linhas positivas de PCR foram propagadas clonalmente e testado pela presenmétodo de t para a acumulação de aflatoxina, todos os sete apresentaram entre 60% e% menor acúmulo de aflatoxina 100 do que o controle. Aqui nós mostramos os resultados de duas destas sete linhas. Como os eventos transgênicos individuais geralmente produzem poucas sementes, foi desenvolvido um método para utilizar um número mínimo de sementes e ainda ser capaz de fazer análise estatística paramétrica. Um fluxograma da preparação da amostra e a configuração experimental é mostrado na Figura 5 e na Tabela 1. Embora a primeira geração de sementes transgénicas é tipicamente hemizigótico, espera-se que a célula-a-célula e circulação sistémica de ARN interferente pequeno (ARNsi) gerado através de interferência de RNA deve conferir aflatoxina-síntese silenciamento toda a planta. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig5.jpg" /> Figura 5. fluxograma esquemático do método para analisar a eficácia dos ARNi em silenciamento </strong&gt; Aspergillus genes aflatoxina-síntese em sementes de amendoim. Representação gráfica do fluxo de trabalho durante o processamento de amostras de amendoim para a expressão do gene ou a análise das aflatoxinas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> ARNi linhas 288-72 e 288-74 amendoim mostrou a presença do fabricante seleccionável NPTII quando testado pela STN-PCR, secções de gel são mostradas na Figura 6 (parte superior), as imagens originais estão disponíveis a partir dos autores, a pedido. O plasmídeo pCAPD não foi utilizada como um controlo de transformação, uma vez que codifica repetições invertidas de dois genes CMR (resistência ao cloranfenicol) e ccdB (toxina) de efeito desconhecido em plantas. PCR negativo 288-9 linha de amendoim e outros, que passaram pelo processo de regeneração e foi cultivada em condições idênticas às linhas de ARNi, foram usados ​​como con negativatrolo. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig6.jpg" /> . Figura 6. A detecção de transgênicos e de expressão Tempo real de RNAi inserção Top: Single-tubo, detecção de Nested PCR de linhas de amendoim transgênicas RNAi-288-72 e 288-74-RNAi, plantas positivos. Controles: W (água), PP (planta positivo), MM (mistura principal), p (plasmídeo p5XCAPD); As fracções 1/2 1/4 1/8 1/16 representam as diluições de 2 vezes do ADN de fundo:. Real-Time PCR detecção de expressão do ARNi inserir (conjuntos de iniciadores: RT_5X_1, RT_5X_2, como na Figura 1, em imatura ( amarelo) e maduro () cotilédones marrom de linhagens transgênicas em 24 e 48 h de incubação; linha cinza: C T = 1. Os histogramas representam os meios e barras de erro padrão (T) de três amostras biológicascom três repetições técnicas. A quantificação relativa de inserção RNAi foi normalizado em relação ao gene housekeeping actina como um controlo interno e de expressão dobra comparativa do transgene calculada conforme descrito no ponto 5.2.2 e 5.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Para testar a eficácia do controle potencial planta-hospedeiro RNAi mediada de acumulação de aflatoxina, conídios recém-colhida de Aspergillus flavus NRRL 3357 foram aplicadas na superfície de corte de cotilédones meio do qual os embriões e testa havia sido removido (Figuras 3, 4). A. flavus NRRL 3357, para o qual o genoma foi seqüenciado e foi a base para a concepção de p5XCAPD, foi gentilmente cedido pelo Dr. Horn em USDA-ARS-NPRL. A invasão de fungos resultante da metade cotilédone após 24, 48 e 72 horas a 30 ° C é mostrar<html> N na Figura 4. As amostras de cotilédones meio inoculadas foram colhidas às 24, 48, 72, 96 hr de incubação, e analisada para o principal quatro aflatoxinas B 1, B 2, G 1 e G 2, utilizando UPLC e confirmado por LC-MS ; os resultados estão apresentados na Figura 6. As concentrações de aflatoxina foram determinados usando um método publicado com modificações 36. Em 96 horas de incubação, cotilédones começam a desintegrar-se devido à infecção fúngica. Linha de RNAi 288-72 apresentaram níveis significativamente mais baixos de aflatoxinas do que o controle em todas as datas de amostragem em cotilédones imaturos e na maioria das datas de amostragem nas mais maduras. Linha de RNAi 288-74 apresentaram níveis significativamente mais baixos de aflatoxinas na maioria das datas de amostragem. Os níveis de significância de teste de Tukey são indicados com asteriscos no gráfico da Figura 7. <html> g7.jpg &quot;/&gt; . Figura 7. As aflatoxinas B 1 e B 2 em cotilédones meio de amendoim após incubação (24, 48, 72 e 96 h) com Aspergillus flavus Controle: 288-9 sementes de linha não-transgênico; RNAi: sementes de ARNi-288-72 e 288-74 RNAi, transgénicos para RNAi p5XCAPD para silenciar genes cinco aflatoxina-síntese. (A) A aflatoxina B 1 em sementes maduras (marrom); (B) A aflatoxina B 2 sementes maduras; (C) A aflatoxina B 1 em sementes imaturas (amarelo) e (D) Aflatoxina B 2 em sementes imaturas. Os valores médios com as correspondentes barras de erro padrão (T) de amostras biológicas duplicados são representados. Diferenças estatisticamente significativas de Tukey teste *: p ≤ 0,05, **: p ≤ 0,01, ***: p ≤ 0,001.s: //www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig7large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Em geral, RNAi-288-72 mostrou ao longo da experiência (24 horas de incubação a 96), uma redução de 94% -100% em aflatoxina B 2, e uma redução de 90% -100% em aflatoxina B 1 em comparação com o controlo. ARNi-288-74 mostrou uma redução de 63% -100% em aflatoxina B 2 e 60% ​​-100% de redução em aflatoxina B 1, Figura 7. Os iniciadores utilizados para a detecção de PCR em tempo real de expressão do inserto de RNAi são mostrados na Figura 1. Cotilédones amendoim-semente foram analisadas sem embriões, para remover as defesas naturais e ser capaz de detectar o efeito potencial de ARNi na área mais exposta ao invasão de fungos, os cotilédones. Expressão do ARNi inserção detectada em cotilédones imaturos (amarelo) de linha pelo conjunto de iniciadores 288-74 RT_5X_1 foi de quatro vezes em relação ao C T </sUB&gt; 1 = limiar do controlo negativo, e pelo conjunto de iniciadores foi RT_5X_2 19 vezes acima do limiar, todos em 24 horas de incubação. Pelo menos três dos cinco fragmentos de genes consecutivos utilizados na transformação de amendoim, 5027, 7223 e 7228 (aflep, AFLS / aflJ, e AFLC / pksA, respectivamente) foram detectados por RT-PCR (Figura 1, 6). Expressão de inserção RNAi não foi detectada em cotilédones maduros às 24 horas, ou no cotilédones maduras ou imaturas em 48 horas de incubação, a Figura 6 (parte inferior). <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr height="21"><td height="65" rowspan="3" style="height:65px;width:64px;"> Linha de amendoim </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> Tempo de amostragem </td><td colspan="3" style="width:192px;"> As amostras para RT-PCR </td><td colspan="3" rowspan="2" style="width:192px;"> As amostras para análise de aflatoxinas (inoculado) </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> Number de sementes </td></tr><tr height="22"><td colspan="3" height="22" style="height:22px;width:192px;"> (não inoculado) </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> Rep 1 </td><td style="width:64px;"> Rep 2 </td><td style="width:64px;"> Rep 3 </td><td style="width:64px;"> Rep 1 </td><td style="width:64px;"> Rep 2 </td><td style="width:64px;"> Rep 3 </td></tr><tr height="22"><td height="66" rowspan="3" style="height:66px;width:64px;"> RNAi (amarelo) </td><td style="width:64px;"> 24 hr </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> 4,5 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> 48 hr </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><tdstyle = &quot;width: 64px;&quot;&gt; 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> 72 hr </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> Ao controle </td><td style="width:64px;"> 24 hr </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> 4,5 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> (amarelo) </td><td style="width:64px;"> 48 hr </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td&gt; <td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 72 hr </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Exemplo de configuração pequena amostra para analisar a expressão gênica e acumulação de aflatoxina em RNAi amendoim sementes. Análise completa de expressão e de aflatoxinas para um grupo de maturação (ie., Amarelo), com três tempos de amostragem (24, 48 e 72 horas) , em triplicado, exigiria 4,5 sementes, cada número um na tabela representa metade cotilédones.

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RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

Nós demonstramos um método para a análise de aflatoxinas e a expressão do transgene em sementes de amendoim que contêm sinais de ARN de interferência para silenciar genes aflatoxina-síntese no fungo Aspergillus flavus. Controlo mediada por ARNi de micotoxinas em plantas não foi reportado anteriormente.

Controle mediado por RNAi de aflatoxinas em amendoim: método para analisar a produção de micotoxinas e Transgene Expression na Amendoim /<em&gt; Aspergillus</em&gt; Patossistema

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That ...

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RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

20.8K visualizações.  United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service.  Nós demonstramos um método para a análise de aflatoxinas e a expressão do transgene em sementes de amendoim que contêm sinais de ARN de interferência para silenciar genes aflatoxina-síntese no fungo Aspergillus flavus. Controlo mediada por ARNi de micotoxinas em plantas não foi reportado anteriormente. 

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Optimize Flue Gas Settings to Promote Microalgae Growth in Photobioreactors via Computer Simulations

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently than plants3, but also synthesize advanced biofuels2-4. Generally, atmospheric CO2 is not a sufficient source for supporting maximal algal growth5. On the other hand, the high concentrations of CO2 in industrial exhaust gases have adverse effects on algal physiology. Consequently, both cultivation conditions (such as nutrients and light) and the control of the flue gas flow into the photo-bioreactors are important to develop an efficient &ldquo;flue gas to algae&rdquo; system. Researchers have proposed different photobioreactor configurations4,6 and cultivation strategies7,8 with flue gas. Here, we present a protocol that demonstrates how to use models to predict the microalgal growth in response to flue gas settings. We perform both experimental illustration and model simulations to determine the favorable conditions for algal growth with flue gas. We develop a Monod-based model coupled with mass transfer and light intensity equations to simulate the microalgal growth in a homogenous photo-bioreactor. The model simulation compares algal growth and flue gas consumptions under different flue-gas settings. The model illustrates: 1) how algal growth is influenced by different volumetric mass transfer coefficients of CO2; 2) how we can find optimal CO2 concentration for algal growth via the dynamic optimization approach (DOA); 3) how we can design a rectangular on-off flue gas pulse to promote algal biomass growth and to reduce the usage of flue gas. On the experimental side, we present a protocol for growing Chlorella under the flue gas (generated by natural gas combustion). The experimental results qualitatively validate the model predictions that the high frequency flue gas pulses can significantly improve algal cultivation.

Flue gas from power plants is a cheap CO2 source for algal growth. We have built prototype &#34;flue gas to algal cultivation&#34; systems and described how to scale up the algal cultivation process. We have demonstrated the use of a mass-transfer bio-reaction model to simulate and to design the optimal operation of flue gas for the growth of Chlorella sp. in algal photo-bioreactors.

Otimizar Configurações de gases de combustão para promover o crescimento de microalgas em fotobiorreatores via simulações de computador

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently ...

Ambiente

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

Expressão Gênica transiente em tabaco usando Assembleia Gibson eo Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

A Gusseted Thermogradient Table to Control Soil Temperatures for Evaluating Plant Growth and Monitoring Soil Processes

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a series of incubators. A temperature gradient is passively established across the surface of the table between the heated and cooled ends and is lost quickly at distances above the surface. Since temperature is only controlled on the table surface, experiments are restricted to shallow containers, such as Petri dishes, placed on the table. Welding continuous aluminum vertical strips or gussets perpendicular to the surface of a table enables temperature control in depth via convective heat flow. Soil in the channels between gussets was maintained across a gradient of temperatures allowing a greater diversity of experimentation. The gusseted design was evaluated by germinating oat, lettuce, tomato, and melon seeds. Soil temperatures were monitored using individual, battery-powered dataloggers positioned across the table. LED lights installed in the lids or along the sides of the gradient table create a controlled temperature chamber where seedlings can be grown over a range of temperatures. The gusseted design enabled accurate determination of optimum temperatures for fastest germination rate and the highest percentage germination for each species. Germination information from gradient table experiments can help predict seed germination and seedling growth under the adverse soil conditions often encountered during field crop production. Temperature effects on seed germination, seedling growth, and soil ecology can be tested under controlled conditions in a laboratory using a gusseted thermogradient table.

Traditional thermogradient tables create a range of temperatures across the surface. Welding gussets perpendicular to the surface of a thermogradient table will control temperature in depth increasing possible research applications.

A Tabela Gusseted Thermogradient para controlar a temperatura do solo para avaliar o crescimento da planta e monitoramento de processos do solo

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a ...

Production and Measurement of Organic Particulate Matter in the Harvard Environmental Chamber

The production and the evolution of atmospheric organic particulate matter (PM) are insufficiently understood for accurate simulations of atmospheric chemistry and climate. The complex production mechanisms and reaction pathways make this a challenging research topic. To address these issues, an environmental chamber, providing enough residence time and close-to-ambient concentrations of precursors for secondary organic materials, is needed. The Harvard Environmental Chamber (HEC) was built to serve this need, simulating the production of gas and particle phase species from volatile organic compounds (VOCs). The HEC has a volume of 4.7 m3 and a mean residence time of 3.4 h under typical operating conditions. It is operated as a completely mixed flow reactor (CMFR), providing the possibility of indefinite steady-state operation across days for sample collection and data analysis. The operation procedures are described in detail in this article. Several types of instrumentation are used to characterize the produced gas and particles. A High-Resolution Time-of-Fight Aerosol Mass Spectrometer (HR-ToF-AMS) is used to characterize particles. A Proton-Transfer-Reaction Mass Spectrometer (PTR-MS) is used for gaseous analysis. Example results are presented to show the use of the environmental chamber in a wide variety of applications related to the physicochemical properties and reaction mechanisms of organic atmospheric particulate matter.

This paper describes operation procedures for the Harvard Environmental Chamber (HEC) and related instrumentation for measuring gaseous and particle species. The environmental chamber is used to produce and study secondary organic species produced from the organic precursors, especially related to atmospheric organic particulate matter.

Produção e medição de partículas orgânicas na câmara ambiental de Harvard

The production and the evolution of atmospheric organic particulate matter (PM) are insufficiently understood for accurate simulations of atmospheric ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current measures to combat such pathogens have proved too conservative and, thus, not sufficiently effective, and they can potentially pose environmental risks. Therefore, it is extremely necessary to identify host-resistance factors to assist in controlling plant diseases naturally through the identification of resistant germplasm, the isolation and characterization of resistance genes, and the molecular breeding of resistant cultivars. In this regard, there is need to establish an accurate, rapid, and large-scale inoculation method to breed and develop plant resistance genes. The rice blast fungal pathogen Magnaporthe grisea causes severe disease symptoms and yield losses. Recently, M. grisea has emerged as a model organism for studying the mechanisms of plant-fungal pathogen interactions. Hence, we report the development of a plant virulence test method that is specific for M. grisea. This method provides for both spray inoculation with a conidial suspension and wounding inoculation with mycelium cubes or droplets of conidial suspension. The key step of the wounding inoculation method for detached rice leaves is to make wounds on plant leaves, which avoids any interference caused by host penetration resistance. This spray/wounding protocol contributes to the rapid, accurate, and large-scale screening of the pathotypes of M. grisea isolates. This integrated and systematic plant infection method will serve as an excellent starting point for gaining a broad perspective of issues in plant pathology.

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Here, we present a protocol to test plant virulence with the plant pathogen Magnaporthe grisea. This report will contribute to the large-scale screening of the pathotypes of fungi isolates and serve as an excellent starting point for understanding the resistant mechanisms of plants during molecular breeding.

O teste de infecção da planta: Spray e inoculação mediada por ferimento com o de patógeno vegetal Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

Assessing the Particulate Matter Removal Abilities of Tree Leaves

Based on the conventional cleaning methods (water cleaning (WC) + brush cleaning (BC)), this study evaluated the influence of ultrasonic cleaning (UC) on collecting various sized particulate matter (PM) retained on leaf surfaces. We further characterized the retention efficiency of leaves to various sized PM, which will help to assess the abilities of urban trees to remove PM from ambient air quantitatively. 
Taking three broadleaf tree species (Ginkgo biloba, Sophora japonica, and Salix babylonica) and two needleleaf tree species (Pinus tabuliformis and Sabina chinensis) as the research objects, leaf samples were collected 4 days (short PM retention period) and 14 days (long PM retention period) after the latest rainfall. PM retained on the leaf surfaces was collected by means of WC, BC, and UC in sequence. Then, retention efficiencies of leaves (AEleaf) to three types of the various sized PM, including easily removable PM (ERP), difficult-to-remove PM (DRP), and totally removable PM (TRP), were calculated. Only around 23%-45% of the total PM retained on leaves could be cleaned off and collected by WC. When the leaves were cleaned through WC+BC, the underestimation of the PM retention capacity of different tree species was in the range of 29%-46% for various sized PM. Almost all PM retained on leaves could be removed if UC was supplemented to WC+BC. 
In conclusion, if the UC was complemented after the conventional cleaning methods, more PM on leaf surfaces could be eluted and collected. The procedure developed in this study can be used for assessing the PM removal abilities of different tree species.

The ultrasonic cleaning method was applied to elute the particulate matter (PM) retained on leaf surfaces after PM was eluted by the conventional cleaning methods (water cleaning only or water cleaning plus brush cleaning). The methodology can help to improve the estimation accuracy for PM retention capacity of leaves.

Avaliar as habilidades de remoção de partículas de árvore folhas

Based on the conventional cleaning methods (water cleaning (WC) + brush cleaning (BC)), this study evaluated the influence of ultrasonic cleaning (UC) on ...

Visualizing Efficacy of Pesticides Against Disease Vector Mosquitoes in the Field

Efficacy of public health pesticides targeting nuisance and disease-vector insects such as mosquitoes, sand flies, and filth-breeding flies is not uniform across ecological zones. To best protect public and veterinary health from these insects, the environmental limitations of pesticides need to be investigated to inform effective use of the most appropriate pesticide formulations and techniques. We have developed a research program to evaluate combinations of pesticides, pesticide application equipment, and application techniques in hot-arid desert, hot-humid tropical, warm and cool temperate, and urban locations to derive pesticide use guidelines specific to target insect and environment. To these ends we designed a system of protocols to support efficient, cost-effective, portable, and standardized evaluation of a diverse range of pesticides and equipment across multiple environments. At the core of these protocols is the use of an array of small cages with colony-reared sentinel mosquitoes (adults and immatures) and sand flies (adults), strategically arranged in natural habitats and exposed to pesticide spray. Spatial and temporal patterns of pesticide efficacy are derived from percent mortality in sentinel cages, then mapped and visualized in a geographic information system. Maps of sentinel mortality data may be statistically compared to evaluate relative efficacy of a pesticide across multiple environments, or to study multiple pesticides in a single environment. Protocols may be modified to accommodate a variety of scenarios, including, for example, the vertical orientation of sentinels in canopy habitats or simultaneous testing of ground and aerial application methods.

The efficacy of public health pesticides targeting nuisance and disease-vector insects is not uniform across different ecological zones. Here we present a system of techniques using captive vector insects as sentinels for pesticide efficacy to derive electronic maps supporting the standard evaluation of pesticides across multiple environments.

Visualizando a eficácia de pesticidas contra mosquitos vetores de doenças no campo

Efficacy of public health pesticides targeting nuisance and disease-vector insects such as mosquitoes, sand flies, and filth-breeding flies is not uniform ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, we described a protocol for multiple analyses of the biological compositions in environmental PM. Five experiments are presented: (1) PM number monitoring by using a laser particle counter; (2) PM collection by using a cyclonic aerosol sampler; (3) PM collection by using a high-volume air sampler with filters; (4) culturable microbes collection by the Andersen six-stage sampler; and (5) detection of biological composition of environmental PM by bacterial 16SrDNA and fungal ITS region sequencing. We selected hazy days and a livestock farm as two typical examples of the application in this protocol. In this study, these two sampling methods, cyclonic aerosol sampler and filter sampler, showed different sampling efficiency. The cyclonic aerosol sampler performed much better in terms of collecting bacteria, while these two methods showed the same efficiency in collecting fungi. Filter samplers can work under low temperature conditions while cyclonic aerosol samplers have a sampling limitation for temperature. A solid impacting sampler, such as an Andersen six-stage sampler, can be used to sample bioaerosols directly into the culture medium, which increases the survival rate of culturable microorganisms. However, this method mainly relies on culture while more than 99% of microbes cannot be cultured. DNA extracted from the culturable bacteria collected by the Andersen six-stage sampler and samples collected by cyclonic aerosol sampler and filter sampler were detected by bacterial 16S rDNA and fungal ITS region sequencing.All the methods above may have wide application in many fields of study, such as environmental monitoring and airborne pathogen detection. From these results, we can conclude that these methods can be used under different conditions and may help other researchers further explore the health impacts of environmental bioaerosols.

Understanding the biological composition of environmental particulate matter is important for the study of its significant impacts on human health and disease spread. Here, we used three types of bioaerosol sampling methods and a biological analysis of airborne microbes to better explore airborne microbial communities under different environmental conditions.

Composição e análise da distribuição de Bioaerossóis sob diferentes condições ambientais

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...

A Telemetric, Gravimetric Platform for Real-Time Physiological Phenotyping of Plant&ndash;Environment Interactions

Food security for the growing global population is a major concern. The data provided by genomic tools far exceeds the supply of phenotypic data, creating a knowledge gap. To meet the challenge of improving crops to feed the growing global population, this gap must be bridged.
Physiological traits are considered key functional traits in the context of responsiveness or sensitivity to environmental conditions. Many recently introduced high-throughput (HTP) phenotyping techniques are based on remote sensing or imaging and are capable of directly measuring morphological traits, but measure physiological parameters mainly indirectly.
This paper describes a method for direct physiological phenotyping that has several advantages for the functional phenotyping of plant&#8211;environment interactions. It helps users overcome the many challenges encountered in the use of load-cell gravimetric systems and pot experiments. The suggested techniques will enable users to distinguish between soil weight, plant weight and soil water content, providing a method for the continuous and simultaneous measurement of dynamic soil, plant and atmosphere conditions, alongside the measurement of key physiological traits. This method allows researchers to closely mimic field stress scenarios while taking into consideration the environment&#8217;s effects on the plants&#8217; physiology. This method also minimizes pot effects, which are one of the major problems in pre-field phenotyping. It includes a feed-back fertigation system that enables a truly randomized experimental design at a field-like plant density. This system detects the soil-water-content limiting threshold (&#952;) and allows for the translation of data into knowledge through the use of a real-time analytic tool and an online statistical resource. This method for the rapid and direct measurement of the physiological responses of multiple plants to a dynamic environment has great potential for use in screening for beneficial traits associated with responses to abiotic stress, in the context of pre-field breeding and crop improvement.

A Telemetric, Gravimetric Platform for Real-Time Physiological Phenotyping of Plant&amp;#8211;Environment Interactions

This high-throughput, telemetric, whole-plant water relations gravimetric phenotyping method enables direct and simultaneous real-time measurements, as well as the analysis of multiple yield-related physiological traits involved in dynamic plant&#8211;environment interactions.

Uma plataforma telemétrica e gravimétrica para fenotipagem fisiológica em tempo real de interações vegetais-ambientais

Food security for the growing global population is a major concern. The data provided by genomic tools far exceeds the supply of phenotypic data, creating ...

Mistletoe Eradicator - A Novel Tool for Simultaneous Mechanical and Chemical Control of Mistletoe

Some species of mistletoes, an aerial plant hemiparasites, play a Janus-like role in ecosystems by being rich biodiversity hotspots due to their trophic and topic associations with various organisms and at the same time acting as biological pirates, exhausting the host trees by stealing water and nutrients via the haustorium. Many crop and timber trees are attacked by mistletoes, for example, dwarf mistletoes parasitize conifers, representatives of genus Tapinanthus target guava, and Phoradendron mistletoe target pecans. Recently, an increasing infestation of the European mistletoe (Viscum album subsp. album L.) in monoculture stands of common walnuts (Juglans regia L.)&#160;was recorded for the first time during 2018 in different regions of Kashmir Valley, India. The common chemical approach based on the spraying of mistletoe exophytes with the growth regulators, ethephon and glyphosate, was not efficient since V. album resprouted in the next vegetation season. Hand pruning of mistletoe was time-consuming, and a polyethylene covering resulted in the localized rotting of host tissues. The most efficient approach to eradicate mistletoe was the use of a novel tool called Mistletoe Eradicator, which allows to use mechanical and chemical means of mistletoe control simultaneously. It consists of a manipulating pole with the terminal pruning saw having a container filled with the growth regulator, from which the liquid slowly drops onto the saw blade through the nozzle. It allows working both from the ground and in the tree canopy. After the targeted application of 5%-10% ethephon or glyphosate to the base of the just pruned V. album stems (stubs), exophyte resprouting was significantly reduced 9 months after the pruning as compared to the only pruned or sprayed exophytes. An alternative variant of Mistletoe Eradicator was constructed in Ukraine filled just with a food color additive to track the liquid dropping and was successfully tested.

The protocol describes an easy-to-handle tool called Mistletoe Eradicator which combines mechanical and chemical approaches and is efficient in the control of mistletoe infestation on the host trees. The manuscript uses the European mistletoe (Viscum album subsp. album L.) as an example.

Erradicador de Visco - Uma nova ferramenta para controle mecânico e químico simultâneo do Visco

Some species of mistletoes, an aerial plant hemiparasites, play a Janus-like role in ecosystems by being rich biodiversity hotspots due to their trophic ...