We thank Ms. Danae Sharp and Ms. Sheena Daignault for technical assistance. We thank Dr. Atsushi Miyawaki, RIKEN, Wako-city, Japan, for providing the FUCCI constructs, Dr. Meenhard Herlyn and Ms. Patricia Brafford, The Wistar Institute, Philadelphia, for providing cell lines, the Imaging and Flow Cytometry Facility at the Centenary Institute for outstanding technical support. We thank Mr. Chris Johnson and Dr. Andrew Barlow for Volocity software technical support. N.K.H. is a Cameron fellow of the Melanoma and Skin Cancer Research Institute, Australia. K.A.B. is a fellow of the Cancer Institute New South Wales (13/ECF/1-39). W.W. is a fellow of the Cancer Institute New South Wales (11/CDF/3-39). This work was supported by project grants RG 09-08 and RG 13-06 (Cancer Council New South Wales), 570778 and 1051996 (Priority-driven collaborative cancer research scheme/Cancer Australia/Cure Cancer Australia Foundation), 08/RFG/1-27 (Cancer Institute New South Wales), and APP1003637 and APP1084893 (National Health and Medical Research Council).

1. FUCCI Transdução e Cultura de Células <ol><li> Transdução FUCCI <ol><li> Criar linhas de células que expressam estavelmente o FUCCI constrói mKO2-hCdt1 (30-120) e MAG-hGem (1-100) 15 utilizando co-transdução de lentivírus, como descrito anteriormente 7. Nota: O sistema FUCCI já está disponível comercialmente. </li><li> Gerar sub-clones com fluorescência brilhante pela triagem de uma única célula. Ordenar as células individuais positivas tanto para AG e KO (amarelo) por fluorescência de células activadas por triagem em uma placa de 96 poços como anteriormente descrito 7,16. </li></ol></li><li> A cultura de células de melanoma <ol><li> Células de melanoma humano C8161 cultura como anteriormente descrito 7,17. </li></ol></li></ol> 2. Formação esferoidal 3D (como descrito anteriormente 3,9) <ol><li> Placa preparação de agarose <ol><li> Dissolve-se 1,5% de agarose (ou ágar nobre) em 100 ml de solução salina equilibrada de Hank (HBSS) ou fosfato Buffered salina (PBS) por ebulição no microondas por 3-5 min com agitação. Certifique-se a agarose é completamente dissolvido. </li><li> Dispensar imediatamente 100 uL da solução de agarose por poço para uma placa de 96 poços de cultura de tecidos de fundo plano, utilizando uma pipeta multi-canal. Nota: Agarose pode solidificar nas pontas após um curto período de tempo, para ultrapassar este problema pontas deve ser mudado entre as placas, se fazer mais do que uma placa de agarose. </li><li> Deixar placa de 96 poços sobre uma superfície plana de agarose a endurecer durante pelo menos 1 h. </li></ol></li><li> Preparação de Células e de sobreposição em agarose <ol><li> Cultivar células de aproximadamente 80% de confluência num frasco T75. Lava-se com 10 ml de HBSS. </li><li> Separe as células utilizando 1,5 ml de tripsina a 0,05% / ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e ressuspender em 10 ml de meio normal. </li><li> Contagem de células utilizando um hemocitómetro 18 ou outro método de contagem automatizada. </li><li> Ressuspender as células até uma concentração final de 25.000 células / ml em normamédio al. </li><li> Overlay poços de agarose com 200 ul da suspensão de células para um número final de 5.000 células por poço. </li><li> Placas de retorno para a incubadora de cultura celular (5% de CO 2 e 37 ° C) para formar esferóides durante aproximadamente 3 dias. Nota: O tempo necessário para formar um esferóide varia entre diferentes linhas celulares. Algumas linhas de células de não formar esferóides utilizando este método de todo. </li><li> Imagem esferóide morfologia com um microscópio invertido usando uma objetiva de 4X e um filtro de contraste de fase. Uma linha de células que forma com sucesso esferóides irá produzir agregados de células, aproximadamente esféricos compactos, e deve haver apenas um esferóide por poço. Nota: Opcional: Uma vez que os esferóides se terem formado, que podem ser transplantadas em colagénio ou outra matriz para análise de crescimento e invasão 3,7,17. Para remover esferóides de colagénio, trata-se com 500 ul de 2 mg / ml de colagenase, a 37 ° C até que o colagénio é dissolvido suficiente para o spheroids para vir livre no meio (cerca de 30 min). Remova cuidadosamente esferóides utilizando uma pipeta de 1 ml. </li><li> Para realizar o corte / imagiologia esferóides fix (quer isolados a partir de colagénio ou cultivadas durante 3-5 dias em agarose) em 10% de formalina tamponada neutra (CUIDADO: Formalina deve ser utilizado em uma câmara de exaustão) durante pelo menos 2 horas à temperatura ambiente (TA) , ou durante a noite (O / N) a 4 ° C. Os esferóides podem ser armazenados em HBSS a 4 ° C durante vários dias. </li></ol></li></ol> 3. Spheroid Vibratome Seccionamento <ol><li> Dissolve-se 5 g de agarose de baixo ponto de fusão em 100 ml de HBSS em uma garrafa de vidro de 500 ml num forno de microondas. Use uma configuração fogo médio com agitação. CUIDADO: Mantenha a tampa solta quando ferver a solução para que a pressão pode ser liberada. Use luvas heatproof de proteção para proteger as mãos de queimaduras ao manusear a garrafa de vidro quente. </li><li> Aguarde até que a agarose esfria um pouco - para que a garrafa pode ser tocado sem as mãos em chamas. </li><li> Despeje approximamadamente 2 ml de agarose para o fundo de um copo de contador de Coulter ou moldes de plástico semelhante. Imediatamente aspirar um esferóide fixo (ver secção 2.2.8) usando uma pipeta de 1 ml em o menor volume de líquido possível. Adicionar esferóide à agarose. Algumas esferóides (até 10) podem ser adicionados por chávena. </li><li> Cubra os esferóides com 2 ml mais de agarose. Fazê-lo rapidamente para evitar o endurecimento de agarose antes da segunda camada é adicionada. </li><li> Permitir que a agarose endureça à TA no escuro durante pelo menos 3 horas. Em vista disso, do ponto de copos pode ser armazenada por um curto período de tempo, a 4 ° C com 2-3 ml de HBSS sobrepostos para evitar a desidratação. </li><li> Remover agarose do copo. Apare a agarose contendo os esferóides para que ele se encaixa no bloco de metal vibratome, e esferóides estão perto do topo da agarose. Esferóides podem ser vistos como pequenos objetos brancos dentro da agarose. Super cola a agarose para o bloco. </li><li> Encha o vibratome com água destilada e montar o bloco no vibratome. Colocou ovibratome para cortar 100 mm seções usando velocidade baixa (definição 2) e vibração elevada (ajuste 8). Defina o ângulo de lâmina de corte de 16 °. Vire em vibratome, acender a luz vibratome e cortar seções do topo da agarose até 100 mm seções esferóides são cortadas. Coloque seções esferóides cortado em HBSS em uma placa de 24 poços. </li><li> Escolha seções do meio de análise de imagem. Seções de montagem em lâminas de transferência da seção plana para o slide usando uma pinça. Encha uma seringa de 10 ml com graxa de vácuo; adicionar uma linha fina de pasta de vácuo em torno das extremidades da secção, a fim de impedir que o meio de montagem de funcionar fora das extremidades da lâmina e ajudar a selar à secção sob a lamela. Cubra a seção com a montagem médio e uma lamela. Selar bordas da lamela com unha polonês. Loja desliza a 4 ° C antes de imagem. </li></ol> 4. confocal Image Acquisition <ol><li> Tome uma imagem z-slice de uma seção esferóide meio FUCCI usando um 10Xou objectiva 20X como descrito anteriormente 7. Certifique-se de qualquer sobreposição ou crosstalk ocorre entre o Kusabira Orange2 e Azami Green. Se comparando análise de imagem entre várias seções esferóide, mantenha potência do laser e outras definições da mesma entre as amostras. </li></ol> 5. Hoechst Dye Difusão Ensaio para Fluxo Seleção <ol><li> Transferir esferóides vivos (3-5 dias após a semeadura agarose) para um tubo de 15 ml. Vamos esferóides gravidade se depositam no fundo do tubo. Vários esferóides pode ser manchado por tubo. Aproximadamente 20 esferóides são necessários para obter números de células suficientes para citometria de fluxo. </li><li> Remover o excesso de meio e adicionar 1 ml de 10 mM a Hoechst diluídos em meio normal. Incubar esferóides a 37 ° C durante aproximadamente 1 hora. Use flicking suave para voltar a suspender as esferóides uma ou duas vezes durante a incubação. Nota: O tempo de incubação pode ser variado para alterar o modo como o corante Hoechst longe penetra nos esferóides. Isto irá variar com base naso tamanho do esferóide, densidade e linha celular. Para algumas esferóides grandes / densas, pode haver uma penetração máxima de corante que é inferior a 100%. </li><li> Lavar os esferóides suavemente com 5 mL de HBSS, utilizando a gravidade de sedimentação. <ol><li> Opcional: Para imagiologia de penetração do corante: Fix esferóides com 10% de formalina tamponada neutra para, pelo menos, 2 h à TA ou O / N a 4 ° C. Prepare vibratome seções, montar em slides e imagem no confocal, como descrito nas etapas 3 e 4 acima. </li></ol></li><li> Para preparar as células para citometria de fluxo, Trypsinize esferóides com 1 ml de tripsina a 0,05% / EDTA a 37 ° C durante aproximadamente 30 min, com sacudindo a cada 10 min para quebrar os esferóides separados. Nota: Os esferóides são difíceis de entrar em suspensão de célula única, as condições podem necessitar de ser optimizado. Viabilidade de C8161 4 dias de idade esferóides após este processo é de aproximadamente 95%. </li><li> Células mancha com um ao vivo near-infrared / mancha mortos de acordo com o protocolo do fabricante. Lavar com HBSS, em seguida, fixar com umml de 10% de formalina tamponada neutra por aproximadamente 30 min. As células podem ser armazenadas em HBSS a 4 ° C durante vários dias antes da análise de fluxo. </li></ol> 6. Citometria de Fluxo Análise de Hoechst manchados Fucci Spheroids <ol><li> Assegurar que as células não são aglutinados, passando-os através de um filtro de células. Ressuspender o Hoechst coradas esferóides FUCCI em gelo frio de lavagem de FACS (PBS com 5% de soro fetal de vitela) a uma concentração de 1-5 x 10 6 células / ml. Transferir 200 ul de amostra de 5 ml de fundo redondo tubos. </li><li> Prepare as seguintes amostras de controle de cores individuais, conforme descrito em 6.1: células de melanoma manchado de un; células de melanoma aderentes coradas com 10 mM Hoechst, durante 1 hora; Azami Verde só expressando células de melanoma; e Kusabira Laranja única expressando células de melanoma. Nota: os controlos de cor individuais podem ser fixadas em formalina e armazenado em FACS lava-se com 0,1% de azida de sódio a 4 ° C durante semanas ou mesmo meses. </li><li> Executar suspensões de células únicas de ofluxo na citometria analisador com lasers apropriados e única cor / controles não coradas como descrito anteriormente 7,16. </li><li> Use um software de citometria comercial, como FlowJo para analisar o interior vs. células esferóides exteriores da seguinte forma: <ol><li> Remover detritos por gating na população de células principal em luz dispersa (FSC) vs. Luz Side Espalhados (SSC). </li><li> Remover doublets por gating em células individuais usando FSC (Area) vs. FSC (Altura) </li><li> Portão de células vivas por gating na população de baixa ao vivo / morto. </li><li> Definir a Hoechst células gated elevados, com base no sinal positivo a partir das células aderentes corados com Hoechst, como células &quot;exteriores&quot;. </li><li> Definir Hoechst células baixas ou negativas, fechado com base no sinal de controlo coradas-un, como células &quot;internos&quot;. </li><li> Após as populações de gating para interior e exterior, as células podem ainda ser fechado para FUCCI vermelho (G1), amarelo (S precoce), verde (S / G2 / M) ou negativo (G1 precoce). Nota: Compensation utilizando os controlos de cor única pode não ser necessária para definir adequadamente as populações vermelho, amarelo, verde e negativos FUCCI. </li></ol></li><li> Uma vez que o teste foi otimizado e Hoechst penetração validado via microscopia confocal, as células correr sem fixar em um classificador de célula de fluxo, como descrito anteriormente 7,16 para posterior análise de sub-populações de células ao vivo. </li></ol> 7. Análise de Imagem de FUCCI Spheroid Secções <ol><li> Abrir software por exemplo. Volocity, escolha a única configuração quantificação. </li><li> Criar uma nova biblioteca. Importe o arquivo de imagem confocal FUCCI esferóide para o software arrastando o arquivo de dados brutos do confocal para a biblioteca. Como alternativa, use o Arquivo&gt; Importar comando. </li><li> Vá até a aba medições para construir um protocolo de análise de imagem. O Protocolo é construído, arrastando e soltando os comandos apropriados na ordem correta como se segue na janela de protocolo. </li><li> Encontre objECTS no canal verde: Arraste comando (encontrado em &#39;Finding&#39;) na janela do protocolo a encontrar objetos, selecione o canal correto nos objetos find protocol.Add um comando de abertura (que se encontra em «tratamento»), então um tocantes objetos separados comando (encontrado em &#39;Processamento&#39; - o que irá separar as células). Excluir objetos de tamanho &lt;50 mm (encontrado em &#39;Filtragem&#39; - isso irá excluir os pequenos objetos não celulares). Nota: As variáveis ​​tais como a encontrar objetos limiar, o número de iterações aberto, o tamanho dos objectos a serem separadas e o tamanho dos objectos a excluir deve ser optimizado manualmente até que as máscaras de objectos corresponder à imagem. </li><li> Encontre objetos no canal vermelho: Repetir a encontrar objetos como acima para o canal vermelho. Protocolos de verde e vermelho pode ter de ser ajustada separadamente. Nota: Devido a estar em núcleos G2, núcleos verdes são muitas vezes um pouco maior. </li><li> Confirme objetos encontrados são precisos: Confirmar vermelho e objetos verdes coincidir com onúcleos vermelho e verde na imagem, desligando e nos canais verde e vermelho (usando a ocultar ou mostrar comando canal) ao exibir as máscaras vermelhas e verdes encontrados pelo protocolo. Medições opções de realimentação (feedback)&gt; opções pode ser utilizada para modificar a aparência das máscaras de objectos. </li><li> Encontre objetos amarelos (células em fase S inicial): Para encontrar células amarelas, adicione uma interseção vermelho com células verdes de comando (encontrado em &#39;Combinando&#39;). Excluir objetos de tamanho (&lt;50 mm, encontrados em &#39;Filtragem&#39;) para excluir quaisquer objetos pequenos não celulares. </li><li> Encontre objetos exclusivamente vermelhos (células em fase G1): Para encontrar núcleos exclusivamente vermelhos, subtrair as células amarelas das células vermelhas (encontrados em &#39;Combinando&#39;). Excluir objetos de tamanho &lt;50 mm, (encontrado em &#39;Filtragem&#39;) para remover quaisquer pequenos objetos não celulares criados. </li><li> Encontre objetos exclusivamente verdes (células em fase S / G2 / M): Repita o procedimento para o canal verde para encontrar exclusivamente verde. Nãote: Se ainda houver objetos não celulares restantes, um comando população filtro pode ser adicionado ao exclusivo protocolos vermelho, verde ou exclusivas (encontrados em &#39;Filtragem&#39;) para reter apenas os objetos com um fator de forma maior do que 0,25. Isto irá remover objetos não-circulares. </li><li> Encontre o esboço esferóide: Encontre o contorno esferóide usando um achado de comando (encontrado em &#39;Finding&#39;) com o canal verde ou vermelho (o que tem mais células ao redor da borda do esferóide) objetos. Um limiar muito inferior (que se encontra na encontrar objetos variáveis) terá que ser usada para encontrar o contorno esferóide em comparação com as células individuais. <ol><li> Use um comando de fechamento para se juntar objetos (encontrados em «tratamento»), em seguida, preencher buracos em objetos (encontrados em «tratamento»), em seguida, usar um filtro fino (encontrado em &#39;Filtragem&#39;) para remover o ruído de objetos. Finalmente, excluir objetos por tamanho para remover objectos mais pequenos &lt;30.000 ^ m (dependendo do tamanho do esferóide). Nota: Este protocolo terá de ser otimizada manualmente até o contorno esferóide é preciso. Uma imagem de campo claro, também podem ser utilizadas - no entanto, este é geralmente menos preciso com uma secção esferóide, e um comando invertido (encontrada em &#39;Combinando&#39;) terá de ser utilizado. </li></ol></li><li> Medir distâncias dos núcleos de esferóide a delinear: Medir distâncias (encontrado no &quot;relativa a&quot;) a partir das populações de amarelo, verde e exclusivamente exclusivamente vermelhas do centróide célula para o bordo do esferóide outline.To visualizar as distâncias mínimas, que deve ser a partir da célula para o bordo esferóide mais próximo, ligue mostrar distâncias na guia relações de opções de retorno (Medidas&gt; Opções&gt; Relações Comentário). </li><li> Guardar o protocolo. Este protocolo pode ser reaplicado para outras imagens, usando as medidas&gt; Restaurar comando de protocolo. </li><li> Criar um item de medições (Medidas&gt; Faça Medição item). Os dados podem ser analisados ​​utilizando a análisefunções. <ol><li> Vá até a aba análise no item medições. Vá para o menu Análise (Analysis&gt; Analisar) e analisar a distância mínima entre o baricentro celular (vermelho, verde ou amarelo) para a borda esferóide, resumidos por contagem e organizado pela população. </li><li> Para contar o número de células encontradas a uma certa distância da borda criar um filtro (Análise&gt; Filtrar). O filtro para a distância mínima na Figura 2 é baseado em Hoechst penetração (por exemplo a distância mínima é inferior a 80 dá a população &quot;exterior&quot;). Alternativamente, a exportação de dados não processados ​​para uma planilha para análise posterior. </li></ol></li></ol>

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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+proliferation+in+multicellular+spheroids+is+mediated+through+differential+expression+of+cyclin-dependent+kinase+inhibitors.">Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors.</a> Cancer research. 64, 1621-1631 (2004).</li><li>Kyle, A. H., Huxham, L. A., Baker, J. H., Burston, H. E., Minchinton, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+distribution+of+bromodeoxyuridine-labeled+cells+is+strongly+dose+dependent.">Tumor distribution of bromodeoxyuridine-labeled cells is strongly dose dependent.</a> Cancer research. 63, 5707-5711 (2003).</li><li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+penetration+in+solid+tumours.">Drug penetration in solid tumours.</a> Nature reviews. Cancer. 6, 583-592 (2006).</li><li>Giesbrecht, J. L., Wilson, W. R., Hill, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiobiological+studies+of+cells+in+multicellular+spheroids+using+a+sequential+trypsinization+technique.">Radiobiological studies of cells in multicellular spheroids using a sequential trypsinization technique.</a> Radiation research. 86, 368-386 (1981).</li></ol>

PerkinElmer contributed to the costs of publication.

Análise de imagens semi-automatizado identificou a região G1 presos interior esferóide, proliferando e camadas exteriores. Este método pode ser usado em esferóides vivo usando uma secção óptica, ou em secções fixas esferóides, para identificar mudanças na não só o ciclo celular, mas a expressão do marcador (por imunofluorescência), a morte celular, ou a morfologia das células nestas regiões diferentes. Motilidade celular dentro de diferentes regiões esferóides podem também ser quantificada - se as i...

Esferóides multicelulares 3D têm sido conhecida como um modelo de tumor durante décadas, no entanto, só recentemente é que eles tenham entrado em uso mais comuns, como um modelo in vitro para muitos cancros sólidos. Eles são cada vez mais utilizados em telas de alto rendimento de descoberta de drogas como um intermediário entre o complexo, caro e em modelos in vivo demorado e o simples, modelo de monocamada 2D baixo custo 1-6. Estudos em cultura 2D são muitas vezes incapazes de ser replicado in vivo. Modelos esferóides de muitos tipos de cancro são capazes de imitar as características de crescimento, de sensibilidade a drogas, a penetração da droga, as interacções célula-célula, a disponibilidade limitada de nutrientes e de oxigénio e de desenvolvimento de necrose que é visto in vivo em tumores sólidos 6-11. Os esferóides desenvolver um núcleo necrótico, uma região preso quiescente ou G1 que rodeia o núcleo, em proliferação e células na periferia do esferóide 7. O desenvolvimento destas regiõespode variar dependendo da densidade celular, a taxa de proliferação e do tamanho do esferóide 12. Postula-se que a heterogeneidade celular visto nestas sub-regiões diferentes podem contribuir para o câncer resistência terapêutica 13,14. Portanto, a capacidade de analisar as células nessas regiões é crucial para as respostas separadamente drogas compreensão tumorais. O sistema indicador de fluorescência ubiquitinação do ciclo celular (FUCCI) baseia-se no vermelho (Kusabira Laranja - KO) e verde (verde Azami - AG) a marcação fluorescente de CDT1 e geminin, que são degradados em diferentes fases do ciclo celular 15. Assim núcleos celulares aparecem em vermelho no G1, amarelo no início S e verde no S / G2 / M fase. Nós descrevemos aqui dois métodos complementares tanto utilizando FUCCI para identificar o ciclo celular, juntamente com o uso de software de imagem ou de um fluxo de difusão do corante citometria de ensaio para determinar se as células residem no centro da G1 preso ou o exterior proliferatinanel G, e a distância de células individuais a partir da borda do esferóide. Estes métodos foram desenvolvidos na nossa publicação anterior, onde foi demonstrado que as células de melanoma em regiões hipóxicas no centro do esferóide ou / e na presença de terapias específicas são capazes de permanecer em G1 prisão por longos períodos de tempo, e pode re- entrar no ciclo celular quando as condições mais favoráveis ​​surgem 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose low melting point</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16520-050</td>
			<td>For sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>noble agar&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5431</td>
			<td>For making spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose for spheroids</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1356-100</td>
			<td>For making spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin/EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14175-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% formalin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT5014-1CS</td>
			<td>CAUTION: Harmful, corrosive. Use Personal Protective Equipment, do &#160;not breath fumes (open in a fume cupboard).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>live/dead near IR</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L10119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibratome</td>
			<td>Technical Products International, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coulture cup</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>SIE936</td>
			<td>Mold for sectioning spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plate</td>
			<td>Invitro</td>
			<td>FAL353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5138&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer analyser</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>LSRFortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>volocity</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flowjo</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometry software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccuum grease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z273554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUCCI (commercial constructs)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36238</td>
			<td>Transient transfection only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 70 um</td>
			<td>In Vitro</td>
			<td>FAL352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom 5 mL tubes (sterile)</td>
			<td>In Vitro</td>
			<td>FAL352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom 5 mL tubes (non-sterile)</td>
			<td>In Vitro</td>
			<td>FAL352008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging- and flow cytometry-based analysis of cell position and the cell cycle in 3d melanoma spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to traditional two-dimensional (2D) cell culture. The spheroid model is able to mimic the effects of cell-cell interaction, hypoxia and nutrient deprivation, and drug penetration. One characteristic of this model is the development of a necrotic core, surrounded by a ring of G1 arrested cells, with proliferating cells on the outer layers of the spheroid. Of interest in the cancer field is how different regions of the spheroid respond to drug therapies as well as genetic or environmental manipulation. We describe here the use of the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) system along with cytometry and image analysis using commercial software to characterize the cell cycle status of cells with respect to their position inside melanoma spheroids. These methods may be used to track changes in cell cycle status, gene/protein expression or cell viability in different sub-regions of tumor spheroids over time and under different conditions.

Existem vários métodos de produção de esferóides tumorais, este protocolo utiliza o método de crescimento não-aderente, em que as células são cultivadas em agar ou agarose 3,7,9. A Figura 1 mostra um exemplo de um esferóide melanoma C8161 após 3 dias em agar. Esferóides C8161 formar esferóides de tamanho regular com um diâmetro de 500-600 mm (média = 565, SD = 19, n = 3) após 3 dias. Outras linhas de células de melanoma que irão formar esferóides incluem: WM793, WM983C, WM9...

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Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids.

Análise baseada em Citometria de Fluxo Imaging- e da Posição celular eo ciclo celular em 3D melanoma Spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

imaging-flow-cytometry-based-analysis-cell-position-cell-cycle-3d

Research

JoVE Journal

Medicine

12.9K visualizações.  The Centenary Institute. We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids. 

Vídeo: Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-fotão imagem de invasão das células tumorais em um modelo de camundongo ortotópico de carcinoma epidermóide oral

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Medicina

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy tissue is the root cause of disease and death. For other cancers (e.g. breast, lung, etc.), it is the process of metastasis, in which tumor cells move from a primary tumor mass, colonize distal sites and ultimately contribute to organ failure, that eventually leads to morbidity and mortality 3. It has been estimated that invasion and metastasis are responsible for 90&#37; of cancer deaths 4. As a result, there has been intense interest in identifying the molecular processes and critical protein mediators of invasion and metastasis for the purposes of improving diagnosis and treatment 5.
A challenge for cancer scientists is to develop invasion assays that sufficiently resemble the in vivo situation to enable accurate disease modeling 6. Two-dimensional cell motility assays are only informative about one aspect of invasion and do not take into account extracellular matrix (ECM) protein remodeling which is also a critical element. Recently, research has refined our understanding of tumor cell invasion and revealed that individual cells may move by elongated or rounded modes 7. In addition, there has been greater appreciation of the contribution of collective invasion, in which cells invade in strands, sheets and clusters, particularly in highly differentiated tumors that maintain epithelial characteristics, to the spread of cancer 8.
We present a refined method 9 for examining the contributions of candidate proteins to collective invasion 10. In particular, by engineering separate pools of cells to express different fluorescent proteins, it is possible to molecularly dissect the activities and proteins required in leading cells versus those required in following cells. The use of RNAi provides the molecular tool to experimentally disassemble the processes involved in individual cell invasion as well as in different positions of collective invasion. In this procedure, mixtures of fluorescently-labeled cells are plated on the bottom of a Transwell insert previously filled with Matrigel ECM protein, then allowed to invade "upwards" through the filter and into the Matrigel. Reconstruction of z-series image stacks, obtained by confocal imaging, into three-dimensional representations allows for visualization of collectively invading strands and analysis of the representation of fluorescently-labeled cells in leading versus following positions.

Models of tumor cell invasion into three-dimensional extracellular matrix better reflect the in vivo situation than two-dimensional motility assays. Using matrix invasion assays combined with confocal imaging of fluorescently-labeled cells, detailed information on invasion modes and the distinct contributions of leading versus following cells can be obtained.

Modelagem e imagem 3-Dimensional Invasion cela coletiva

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

Processamento de tecido primário do tumor cerebral para Ensaios de Células Tronco e Fluxo de Classificando

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Cultura de Células e Isolamento paciente Derivado de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Células-tronco de câncer putativos Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

High-throughput Citometria de Fluxo Ensaio Celular para detectar anticorpos em N-metil-D-aspartato ou dopamina-2 Receptor em Soro Humano

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the presence of circulating tumor cells (CTCs). These rare cells have been demonstrated to be of clinical significance in metastatic breast, prostate, and colorectal cancers. The current gold standard in clinical CTC detection and enumeration is the FDA-cleared CellSearch system (CSS). This manuscript outlines the standard protocol utilized by this platform as well as two&#160;additional adapted protocols that describe the detailed process of user-defined marker optimization for protein characterization of patient CTCs and a comparable protocol for CTC capture in very low volumes of blood, using standard CSS reagents, for studying in vivo preclinical mouse models of metastasis. In addition, differences in CTC quality between healthy donor blood spiked with cells from tissue culture versus patient blood samples are highlighted. Finally, several commonly discrepant items that can lead to CTC misclassification errors are outlined. Taken together, these protocols will provide a useful resource for users of this platform interested in preclinical and clinical research pertaining to metastasis and CTCs.

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Circulating tumor cells (CTCs) are prognostic in several metastatic cancers. This manuscript describes the gold standard CellSearch system (CSS) CTC enumeration platform and highlights common misclassification errors. In addition, two&#160;adapted protocols are described for user-defined marker characterization of CTCs and CTC enumeration in preclinical mouse models of metastasis using this technology.

Adaptação do Semi-Automática de circulação Tumor de Células (CTC) Ensaios para aplicações clínicas e pré-clínica de Pesquisa

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel. 
The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.

Rosa Bengala Fototrombose por imageamento óptico confocal<em&gt; In Vivo</em&gt;: Um Modelo de curso Veículo Individual

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment elevated myocardial infarction. However, reperfusion per se can result in further cardiomyocyte death, a phenomenon known as reperfusion injury. The opening of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP), with the decrease of the mitochondrial membrane potential (MMP), or mitochondrial depolarization, is universally recognized as the final step of reperfusion injury and is responsible for mitochondrial and cardiomyocyte death. JC-1 is a lipophilic cationic dye that accumulates in mitochondria depending on the value of MMP. The higher the MMP is, the more JC-1 accumulates in the mitochondria. The increasing amounts of JC-1 in mitochondria can be reflected by a fluorescence emission shift from green (~530 nm) to red (~590 nm). Therefore, the reduction of the red/green fluorescence intensity ratio can indicate the depolarization of mitochondria. Here, we take advantage of JC-1 to measure MMP, or the opening of mPTP in human cardiac myocytes after hypoxia/reoxygenation, detected by flow cytometry.

Here, we present a protocol that uses JC-1 dye to assess the mitochondrial membrane potential of cells after being exposed to hypoxia/reoxygenation with or without a protective agent.

Um ensaio de baseados em citometria de fluxo para medir o potencial de membrana mitocondrial em miócitos após hipóxia/reoxigenação

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent evidence indicates a potential inflammatory component of the disease, with both T-cells and monocytes/macrophages potentially associated with the pathogenesis of OA. Further studies postulated an important role for subsets of both inflammatory cell lineages, such as Th1, Th2, Th17, and T-regulatory lymphocytes, and M1, M2, and synovium-tissue-resident macrophages. However, the interaction between the local synovial and systemic inflammatory cellular response and the structural changes in the joint is unknown. To fully understand how T-cells and monocytes/macrophages contribute towards OA, it is important to be able to quantitively identify these cells and their subsets simultaneously in synovial tissue, secondary lymphatic organs and systemically (the spleen and bone marrow). Nowadays, the different inflammatory cell subsets can be identified by a combination of cell-surface markers making multi-color flow cytometry a powerful technique in investigating these cellular processes. In this protocol, we describe detailed steps regarding the harvest of synovial tissue and secondary lymphatic organs as well as generation of single cell suspensions. Furthermore, we present both an extracellular staining assay to identify monocytes/macrophages and their subsets as well as an extra- and intra-cellular staining assay to identify T-cells and their subsets within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue. Each step of this protocol was optimized and tested, resulting in a highly reproducible assay that can be utilized for other surgical and non-surgical OA mouse models.

Here, we describe a detailed and reproducible flow cytometry protocol to identify monocyte/macrophage and T-cell subsets using both extra- and intracellular staining assays within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue, utilizing an established surgical model of murine osteoarthritis.

Análise de Citometria de Fluxo de Subconjuntos de Células Imunes dentro do Baço de Murina, Medula Óssea, Linfonodos e Tecido Sinovial em um Modelo de Osteoartrite

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent ...

Imaging and Analysis of Oil Red O-Stained Whole Aorta Lesions in an Aneurysm Hyperlipidemia Mouse Model

Apolipoprotein E (Apoe)- or low density lipoprotein receptor (Ldlr)-deficient hyperlipidemic mice are the two most commonly used models for atherosclerosis research. They are used to study the impact of a various genetic factors and different cell types on atherosclerotic lesion formation and as well as test the development of new therapies. Isolation, excision of the whole aorta, and quantification of Oil Red O-stained atherosclerotic lesions are basic morphometric methods used to evaluate atherosclerotic burden. The goal of this protocol is to describe an optimized, step-by-step surgical method to dissect, perfuse-fix, isolate, stain, image and analyze atherosclerotic lesions in mouse aortas with Oil Red O. Because atherosclerotic lesions can form anywhere in the entire aortic tree, this whole aorta Oil Red O staining method has the advantage of evaluating lipid-laden plaques in the entire aorta and all branches in a single mouse. In addition to Oil Red O staining, fresh isolated whole aortas can be used for variety of in vitro and in vivo experiments and cell isolations.

This protocol provides a step-by-step procedure to analyze atherosclerotic burden in mice. Investigators can use this protocol to compare the abundance, location, and size of atherosclerotic lesions in different animals.