Name: a 3d organotypic melanoma spheroid skin model
Uploaded: 2018-05-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
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Os autores graças a Hanna Voersmann para estabelecer o melanoma-esferoide-pele-modelo 3D organotypic e proporcionando excelentes protocolos. Os autores também agradecer Silke Busch valioso suporte técnico. O trabalho foi apoiado pelo BMBF e: programa Med 031A423A "Sensibilidade de Melanoma".

Todo trabalho de tecido humano foi realizado usando protocolos institucionais aprovados.
1. separação de derme e epiderme da pele humana (prepúcio juvenil da circuncisão)
<ol><li>Coloque o prepúcio (geralmente 1-2 cm2) em um prato de cultura de células estéreis não-adesivas (Ø 10 cm) e cubra-o com 10-12 mL de tampão fosfato salino+ (PBS, 0.5 mM MgCl2, 0.9 mM CaCl2, pH 7,2 = PBS+). Retire todo excesso de tecido (tecido adiposo) usando pinças e bisturi estéril.</li>
	<li>Cortar a pele em pedaços de 3 x 5 mm, lave-os com PBS e transferi-los para um prato de cultura de pilha de estéril não adesivas (Ø 6 cm). Cubra os pedaços de tecido com 5-7 mL de solução de dispase (2 U/mL em PBS). Selar o prato de cultura celular com película de parafina e incubar durante 16 h a 4 ° C.</li>
	<li>Retrai o epidérmico da parte dérmica com duas pinças esterilizadas. Transfira os pedaços de tecido dissecado para pratos de cultura de células individuais não-adesivas (Ø 6 cm) e cubra cada um com PBS+.</li>
</ol>2. isolamento de primários queratinócitos da epiderme
<ol><li>Cuidadosamente remova a PBS+ o prato de cultura de células utilizando uma pipeta Pasteur e lave as peças de tecido epidérmico (ponto 1.3) com PBS. Corte a epiderme em pedaços menores (1 mm2) e cobrá-los em um tubo cónico de 50 mL. Adicionar 10 mL 1 x Trypsin-EDTA (pré-aquecido a 37 ° C) e incube por 5 min em um banho-maria a 37 ° C. Levar a suspensão de tecido cada 2 min.</li>
	<li>Pare a reação enzimática, adicionando 1 mL soro de vitela fetal (FCS). Ressuspender as células pipetando para cima e para baixo com uma pipeta de 10 mL de plástico de 4 min. Try para evitar bolhas e formação de espuma.</li>
	<li>Pipetar a suspensão de células em um coador de célula (poros tamanho 100 µm), colocado em cima de um tubo de cónico de 50 mL e lavar 3x com 5 mL de PBS. Centrifugar as células a 200 x g por 5 min. Ressuspender as células em 2-6 mL de meio de cultura contendo 1% (v/v) gentamicina. Determine o número de células manualmente pela contagem de células em um hemocytometer e semente de 6 x 105 células para um balão de cultura celular T75.</li>
</ol>3. cultivo de queratinócitos primários
<ol><li>Incube os queratinócitos principais isolados na etapa 2.3 em uma incubadora de célula em 37 ° C e 5% CO2 no queratinócito médio sem FCS, a confluência de 50-70%.</li>
	<li>A passagem os queratinócitos cuidadosamente remova o meio, adicionar 5 mL de PBS-EDTA e incube as celulas por 10 min a 37 ° C. Verificar se as células começaram a desapegar do frasco de cultura sob um microscópio (ampliação de 4x: células aparecerá arredondadas mas ainda estejam presos!). Caso contrário, substitua o velho PBS-EDTA com PBS-EDTA fresco e re-incubar durante mais 10 minutos a 37 ° C.</li>
	<li>Adicionar 5 mL 1 x Trypsin-EDTA para as células arredondadas ainda coberto com 10 mL de PBS-EDTA e re-incube-os 1-3 min a 37 ° C. Parar a reação enzimática, adicionando 1 mL FCS e coletar as células isoladas em um tubo cónico de 50 mL. Centrifugar as células a 200 x g por 5 min, resuspenda o pellet em queratinócitos médio e semente 6 x 105 células para um balão de cultura de células T75 fresco. Nota: Para gerar organotypic pele reconstrói, os queratinócitos principais devem ser usados não mais tarde do que a passagem de 3-4.</li>
</ol>4. isolamento de primários fibroblastos da derme
<ol><li>Corte o tecido cutâneo (ponto 1.3) em pedaços pequenos (1 mm2) e transferi-los para um tubo cónico de 50 mL. Adicionar 10 mL solução de colagenase (5 U/mL de PBS+) e incube por 45 min em um banho-maria a 37 ° C. Centrifugue a mistura de pedaços de tecidos e células a 200 x g por 5 min.</li>
	<li>Lave o centrifugado duas vezes com 10ml DMEM contendo glicose de 4,5 g/L e L-glutamina, mas sem L-piruvato. Finalmente Resuspenda os pedaços de tecido em 2 mL de DMEM contendo 1% (v/v) gentamicina e FCS de 10%. Transferi-los para um frasco de cultura celular T25 e incube-os em uma incubadora de célula em 37 ° C e 5% de CO2 durante a noite. Nota: O volume pequeno permite que os fibroblastos migrar fora os restos de tecido e obriga-os a anexar para o frasco de cultura.</li>
	<li>Na manhã seguinte, adicionar outra 6 mL DMEM/gentamicina/FCS e incubar durante 2-3 dias a 37 ° C, até que chegaram a confluência de 80-90% das células.</li>
</ol>5. cultivo de fibroblastos primários
<ol><li>Passagem os fibroblastos, remover o meio e lavar as células aderentes com PBS. Adicionar 5 mL 1 x Trypsin-EDTA e incubar durante 3 min a 37 ° C.</li>
	<li>Parar a reação enzimática pela adição de 5 mL DMEM/FCS e coletar as células isoladas em um tubo cónico de 50 mL. Centrifugar as células a 200 x g por 5 min, resuspenda o pellet em meio DMEM e semente 6 x 105 células para um balão de cultura de células T75 fresco. Nota: Para gerar organotypic pele reconstrói, os fibroblastos primários devem ser usados não mais tarde do que a passagem de 4-6.</li>
</ol>6. geração de Melanoma 3D esferoides através do método de soltar o enforcamento
<ol><li>Cultura melanoma células (por exemplo, 451-LU ou qualquer linha de células de melanoma de interesse) de acordo com protocolos gerais, utilizando RPMI contendo 10% FCS15.<ol>
<li>Para gerar esferoides de melanoma de tamanho e qualidade similares, lavar as células de melanoma em PBS, adicionar 5 mL de 1x Trypsin-EDTA em PBS para as células em um T175 frasco de cultura de células e incubar durante 3-5 min à temperatura ambiente (RT). Neutralize a tripsina pela adição de 5 mL RPMI/10% FCS. Colheita que as células por centrifugação a 200 x g durante 5 min. Ressuspender o sedimento celular em RPMI/FCS em uma concentração final de 10.000 células/mL, conforme determinado pela contagem em um hemocytometer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ponto 40 x 25 µ l (= 250 células) de suspensão de células para a superfície interna da tampa de um prato de cultura estéril não-adesivas celular (Ø 10 cm) usando uma pipeta eletrônica multi. Com um movimento rápido, mas suave, vire a tampa e coloque-o sobre o prato de cultura respectiva célula contendo 5 mL de PBS.<ol>
<li>Cultura "pendurado pratos gota" em uma incubadora de célula em 37 ° C e 5% de CO2 por 10-14 dias, dependendo do tipo de célula usada. Nota: As células da fase de crescimento MM normalmente crescem mais rápido e formam esferoides mais sólidas na gota pendurada em comparação com as células de melanoma derivadas do RGP ou VGP. Para avaliação individual, observe crescimento esferoide sob um par de binóculos ou sob um microscópio (ampliação de 4x). Geralmente, esferoides tornam-se detectáveis após 48 h, sob um par de binóculos ou sob um microscópio (ampliação de 4x). Depois de 10-14 dias, eles são visíveis sem qualquer dispositivo de ampliação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>5 dias depois de avistar a queda inicial, adicionar 10 µ l de meio fresco RPMI/10% FCS para cada gota. Posteriormente, troca de 10 µ l de meio todos os dias. O uso de um distribuidor de eletrônico é muito útil nesta etapa.</li>
	<li>Dependendo do tipo de célula, colheita os esferoides (ver secção 10 para detalhes) após 10-15 dias, enxaguando-os suavemente a tampa de prato de cultura celular com PBS. Pegá-los em um prato de cultura fresco não adesivas de célula. Nota: O período de cultivo varia de acordo com a fase de crescimento do tumor das células de melanoma quando eles foram inicialmente derivados, por exemplo, esferoides derivadas de células 451-LU crescem para cerca de 500 µm de diâmetro dentro de 12 dias de cultivo no enforcamento drop15 .</li>
</ol>7. geração do compartimento dérmica da pele Organotypic Full reconstrói
<ol><li>Gere modelos de pele usando células de 24 poços microporous membrana inserções (poros de tamanho 8 µm) colocadas em placas de 24 poços. Nota: Certifique-se não usar suspensão mas inserções, de pé, porque eles serão colocados em uma placa de 6 para o cultivo de ar-líquido numa fase posterior.</li>
	<li>Prepare o gel de neutralização solução (GNL)15, bem como os meios de cultura, conhecido como MM e crescimento endotelial meios (EGM)16,17. Para evitar a coagulação, loja do colágeno tipo I (geralmente de rabo de rato, 3.5-4 mg/mL em 0,02 N de ácido acético) no gelo até o uso, porque ele começa à RT</li>
	<li>Re-suspender 1 x 105 fibroblastos por inserir em GNL e misturar rapidamente a suspensão de células com colágeno na proporção de 1:3 em um volume final de 500 µ l/inserir. Reconstruir a mistura suavemente pipetando acima e para baixo para evitar a formação de bolhas, como bolhas podem afectar a qualidade da pele.</li>
	<li>Permitir que os geles dérmicos individuais resolver, mantendo-os sem médio em RT por 30 min em uma capa de estéril. Posteriormente, cobrir cada gel com DMEM contendo glicose de 4,5 g/L, 1% L-glutamina, 10% FCS e sem L-piruvato e incubar durante uma noite a 37 ° C.</li>
</ol>8. geração do compartimento epidérmica da pele Organotypic Full reconstrói
<ol><li>No dia seguinte Retire o meio os géis dérmicos e equilibrar os com EGM meios de comunicação social (FCS de 10%, 1% PenStrep, gentamicina 10 mg/mL) por 2 h a 37 ° C. Retirar o meio e cuidadosamente semente 1 x 105 queratinócitos resuspended em 100 µ l EGM do gel dérmica.</li>
	<li>Incube a reconstrói para 1,5 h a 37 ° C, para permitir que os queratinócitos a aderir ao compartimento dérmica. Nota: Durante este tempo de incubação, os géis começará a encolher devido à contração induzida por fibroblastos e assim, pelo menos parcialmente desapegar das paredes de inserção.</li>
	<li>Cobrir os equivalentes de pele com aproximadamente 800 µ l EGM e cuidadosamente, remover o gel residual da parede com uma ponta de pipeta (branca) pequena inserção. Cultura os equivalentes de pele submergidos na EGM para 7 dias em uma incubadora de célula a 37 ° C, 5% de CO2e mudar o meio de todos os outros dias. Nota: Durante este tempo os equivalentes de pele serão reduzido significativamente.</li>
</ol>9. ar-líquido cultivo de Organotypic Full pele reconstrói
<ol><li>No dia 8, a transferência cada inserir um bem individual de uma placa de 6. Só adicione 1,2-1,4 mL de meio MM para cada poço, assim, reconstruir a pele é fornecida com médio do fundo do poço, mas não é coberta com o meio. Nota: O cultivo na interface ar-líquido permite estratificação da parte epidérmica e estabelecimento de uma camada completa cornificada (estrato córneo).</li>
	<li>Durante os próximos dias 10-17, mude o meio, como indicado na secção 9,1 todos os dias. Durante este período, adicione drogas ou outros estímulos como necessário para o meio. Remova cuidadosamente a reconstruir pele cheia da inserção da membrana microporosa usando uma pinça curva para uma análise mais aprofundada, por exemplo, análise imuno-histoquímica (Figura 1).</li>
</ol>10. geração dos modelos de pele Organotypic Melanoma esferoide
<ol><li>Para integrar o compartimento dérmico do organotypic completo pele reconstrói os esferoides de melanoma, enxaguar cuidadosamente os esferoides (depois passo 6.4) a tampa do enforcamento placa de cultura de células de gota com PBS. Colete 10-20 esferoides/inserir em um prato de cultura estéril não-adesivas de célula. Remova com cuidado excessivo PBS com uma pipeta Pasteur.</li>
	<li>Aspire os esferoides no menor possível volume da EGM. Neste momento, observar e contar os esferoides a olho nu, sem qualquer outro dispositivo de ampliação. Tome esferoides de 10-20 por modelo de pele/gel, tal como indicado no passo 10.1.</li>
	<li>Transferi-los para o volume desejado de GNL contendo fibroblastos (durante a etapa de 7,3) e misture com o colágeno tipo eu. Desta etapa em prossiga conforme descrito nas seções 7.3-9.1. Nota: Esferoides Tumor tornar-se visível no gel dérmico como manchas brancas (Figura 2)</li>
</ol>

<ol>
	<li>Boulais, N., Misery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidermis:+a+sensory+tissue.">The epidermis: a sensory tissue.</a> Eur. J. Dermatol. 18 (2), 119-127 (2008).</li><li>Blanpain, C., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+homeostasis:+a+balancing+act+of+stem+cells+in+the+skin.">Epidermal homeostasis: a balancing act of stem cells in the skin.</a> Nat.Rev. Mol. Cell Biol. 10 (3), 207-217 (2009).</li><li>Shain, A. H., Bastian, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+melanocytes+to+melanomas.">From melanocytes to melanomas.</a> Nat. Rev. Cancer. 16 (6), 345-358 (2016).</li><li>Clark, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cutaneous+malignant+melanoma+as+a+model+for+cancer.">Human cutaneous malignant melanoma as a model for cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 10 (2), 83-88 (1991).</li><li>Hsu, M. Y., Meier, F., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+development+and+progression:+a+conspiracy+between+tumor+and+host.">Melanoma development and progression: a conspiracy between tumor and host.</a> Differentiation. 70 (9-10), 522-536 (2002).</li><li>Miller, A. J., Mihm, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma.">Melanoma.</a> N. Engl. J. Med. 355 (1), 51-65 (2006).</li><li>Balch, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Final+version+of+2009+AJCC+melanoma+staging+and+classification.">Final version of 2009 AJCC melanoma staging and classification.</a> J. Clin. Oncol. 27 (36), 6199-6206 (2009).</li><li>Eigentler, T. K., Caroli, U. M., Radny, P., Garbe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palliative+therapy+of+disseminated+malignant+melanoma:+a+systematic+review+of+41+randomised+clinical+trials.">Palliative therapy of disseminated malignant melanoma: a systematic review of 41 randomised clinical trials.</a> Lancet Oncol. 4 (12), 748-759 (2003).</li><li>Kim, T., Amaria, R. N., Spencer, C., Reuben, A., Cooper, Z. A., Wargo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+targeted+therapy+and+immune+checkpoint+inhibitors+in+the+treatment+of+metastatic+melanoma.">Combining targeted therapy and immune checkpoint inhibitors in the treatment of metastatic melanoma.</a> Cancer Biol. Med. 11 (4), 237-246 (2014).</li><li>Lawrence, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+heterogeneity+in+cancer+and+the+search+for+new+cancer-associated+genes.">Mutational heterogeneity in cancer and the search for new cancer-associated genes.</a> Nature. 499 (7457), 214-218 (2013).</li><li>Flaherty, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+mutated,+activated+BRAF+in+metastatic+melanoma.">Inhibition of mutated, activated BRAF in metastatic melanoma.</a> N. Engl. J. Med. 363 (9), 809-819 (2010).</li><li>Rauschenberg, R., Garzarolli, M., Dietrich, U., Beissert, S., Meier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+therapy+of+metastatic+melanoma.">Systemic therapy of metastatic melanoma.</a> J. Dtsch. Dermatol. Ges. 13 (12), 1223-1235 (2015).</li><li>Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+3-D+cultures+for+high-throughput+screening:+the+multicellular+spheroid+model.">The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model.</a> J. Biomol. Screen. 9 (4), 273-285 (2004).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).</li><li>Vorsmann, H., Groeber, F., Walles, H., Busch, S., Beissert, S., Walczak, H., Kulms, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+human+three-dimensional+organotypic+skin-melanoma+spheroid+model+for+in+vitro+drug+testing.">Development of a human three-dimensional organotypic skin-melanoma spheroid model for in vitro drug testing.</a> Cell Death. Dis. 4, e719 (2013).</li><li>Chen, C. S., Lavker, R. M., Rodeck, U., Risse, B., Jensen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+serum-free+epidermal+culture+model+to+show+deleterious+effects+of+epidermal+growth+factor+on+morphogenesis+and+differentiation.">Use of a serum-free epidermal culture model to show deleterious effects of epidermal growth factor on morphogenesis and differentiation.</a> J. Invest. Dermatol. 104 (1), 107-112 (1995).</li><li>Meier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoma+progression+in+skin+reconstructs+:+biological+significance+of+bFGF.">Human melanoma progression in skin reconstructs : biological significance of bFGF.</a> Am. J. Pathol. 156 (1), 193-200 (2000).</li><li>Sinnberg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+PI3K-AKT-mTOR+signaling+sensitizes+melanoma+cells+to+cisplatin+and+temozolomide.">Inhibition of PI3K-AKT-mTOR signaling sensitizes melanoma cells to cisplatin and temozolomide.</a> J. Invest. Dermatol. 29 (6), 1500-1515 (2009).</li><li>Niessner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+farnesyl+transferase+inhibitor+lonafarnib+inhibits+mTOR+signaling+and+enforces+sorafenib-induced+apoptosis+in+melanoma+cells.">The farnesyl transferase inhibitor lonafarnib inhibits mTOR signaling and enforces sorafenib-induced apoptosis in melanoma cells.</a> J. Invest. Dermatol. 131 (2), 468-479 (2011).</li><li>Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).</li><li>Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids:+an+underestimated+tool+is+catching+up+again.">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> J. Biotechnol. 148 (1), 3-15 (2010).</li><li>Lin, R. Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research.">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnol. J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li></ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

O modelo de pele esferoide de melanoma organotypic introduzido aqui garante novas perspectivas para uma compreensão mais profunda de intra-tumoral e interação de tumor-hospedeiro e pode fornecer uma plataforma de triagem avançados para estudar os mecanismos moleculares do desenvolvimento do tumor e resistência de terapia no futuro.
Para garantir o melhor fisiológica e na vivo simulando condições de pele reconstrói, a qualidade das células primárias é de extrema importância. Como dito acima, as células de pele juvenil ou pré-natal mostram o grau de diferenciação menor e são, portanto, melhor adequadas para gerar equivalentes de pele de espessura total. O primeiro controle de qualidade possível é a extensão da contração dérmica no 2º dia após a semeadura os queratinócitos e desenroscada do gel a EGM (seções de protocolo 8.2 e 8.3). Géis dérmicas vão encolher ao máximo com a melhor qualidade dos fibroblastos. Também, a integração de poucos ou muitos fibroblastos pode afectar dérmica contração e, consequentemente, a penhora de epidérmico ao compartimento dérmica. Isto por sua vez irá comprometer a diferenciação epidérmica, porque este processo requer uma extensa conversas cruzadas entre células dérmicas e epidérmicas.
A qualidade das células primárias também depende muito da confluência de célula, bem como a passagem das células. Se os queratinócitos são cultivados para ≥ 80% confluência eles imediatamente parem se proliferando e começarem a diferenciar. Portanto, é importante a cultura da confluência de 40-70% durante a passagem e usá-los não mais tarde do que passagem 3-4. Fibroblastos são menos sensíveis, mas não devem ser usados mais tarde do que a passagem de 4-6. Observe também que todas as células primárias e linhagens celulares utilizadas para gerar modelos de pele de esferoide de melanoma organotypic são cultivadas livres de antibióticos, e, portanto, o risco de contaminação é alto. No entanto, a adição de antibióticos altera a fisiologia das células individuais e, portanto, reduz a qualidade do equivalentes a pele.
Em geral, a formação de tumor esferoide é possível de quase todos os tipos de linhas de células de tumor e também de células tumorais recém isoladas de material paciente. O tempo de número e/ou cultivo de célula inicial para obter tamanhos de esferoide ideal pode variar dependendo do tipo de célula usado. Até um tamanho de 150-200 µm, todas as células incluídas em um esferoide ainda podem ser fornecidas suficientemente com nutrientes através de simples difusão. Esferoides só com tamanhos ≥500 µm mostram um alto grau de diferenciação celular e representam as características típicas de tumor avasculares tecido22.
O organotypic melanoma-esferoide-pele-modelo desenvolvido aqui é particularmente adequado para estudar interações do tumor-hospedeiro e por debaixo na vivode testes de drogas de melanoma-como condições15. Ainda assim, o ambiente do melanoma na vivo é ainda mais complexo, abrigando uma variedade de tipos de células de tumor associado, incluindo as células imunes e células endoteliais. Desde que a adição de células do sistema imune primárias adequadas enfrenta problemas com histocompatibilidade, esses modelos ainda não são capazes de monitorar adequadamente abordagens terapêuticas-imune.
Não obstante, esferoides de melanoma podem ser gerados a partir de material paciente recém isolada e uma vez incluídos em reconstruir a pele cheia, pode servir como droga individual triagem plataformas. Mesmo a integração de peças de metástase de melanoma na pele reconstrói é concebível para testar combinações de drogas em uma abordagem terapêutica sob medida. Incluindo o modelo de pele-melanoma 3D organotypic em testes pré-clínicos é susceptível de ajudar a garantir que somente os mais promissores novos conceitos terapêuticos são tidos para a frente em ensaios clínicos, reduzindo assim a taxa de abandono de potenciais novos tratamentos para este doença e aumentando a taxa de sucesso terapêutico em ensaios clínicos.

A pele humana é composta de dois compartimentos distintos que servem diferentes funções em proteger o corpo dos efeitos ambientais adversos1. O compartimento inferior dérmico consiste de um fibro-elástico do tecido conjuntivo. É composto por fibras de colágeno e elastina frouxamente ligadas sintetizadas pelos fibroblastos, servindo a uma função de barreira mecânica. A derme é separadoda da epiderme superior pela lâmina basal, que é produzida como uma matriz extracelular devido a uma comunicação constante entre os dois compartimentos de pele. Em contraste com a derme, a epiderme é um epitélio escamoso, que consiste principalmente de queratinócitos e pode ser diferenciada em quatro camadas. O estrato basale consiste de ceratinócitos basais indiferenciados que constantemente derivam de células progenitoras de pele estratificar através dos estágios do estrato granuloso e estrato spinosum no estrato córneo para proteger o corpo de infecções e desidratação2. Os melanócitos estão alinhados com a membrana basal e comunicam através de extensões dendríticas com vários queratinócitos. Que produzem a pigmento melanina para proteger o tecido da pele contra os efeitos nocivos da radiação UV, como o envelhecimento da pele, imunossupressão, inflamação e indução de câncer de pele não-melanoma. Contribuição de radiações UV para a transformação dos melanócitos de melanoma maligno, no entanto, ainda está em debate3.
Desenvolvimento de melanoma é diferenciado em fases de progressão do tumor diferente e caracterizado por certas mudanças genéticas, morfológicas e histológicas4. Eles se originam de qualquer de novo ou de um nevo inato ou adquirido devido a um local, aumento da proliferação de melanócitos causando neoplasia benigna. Esta lesão precursora pode converter em tecido displásico estruturalmente modificado, contendo células atypic, que podem continuar a primeira fase maligna, a fase de crescimento radial (RGP). Esta fase inicial de progressão de tumor é caracterizada por células proliferando radialmente dentro da epiderme, apresentando poucas células localmente invasivas dentro da derme papilar. Durante o melanoma de fase (VGP) subsequente crescimento vertical as células já apresentam um fenótipo invasivo e metastático através da lâmina basal para infiltrar as partes mais profundas da derme, bem como o tecido subcutâneo5da ruptura. Finalmente, o melanoma metastático (MM) representa o estágio de progressão mais agressivo com células metastáticas sistemicamente se espalhando em todo o sistema de sangue e da linfa para invadir a órgãos como o fígado, pulmão e cérebro6distalmente.
Até à data, diagnóstico precoce, seguido de cirurgia continua a ser a mais eficaz terapia de melanoma maligno. O prognóstico para pacientes com metástase à distância, no entanto, continua a ser particularmente pobre7, porque os regimes de quimioterapia clássica conferem apenas pequena sobrevivência benefício8,9. No entanto, depois de décadas de estagnação, avanços recentes em terapias alvo têm melhorado consideravelmente o prognóstico do melanoma maligno.
Hipotalâmica de duas vias principais mitógeno ativado, o RAS-RAF-MEK-ERK e as vias de sinalização de PI3K-AKT-PTEN, apresentam impulsores-chave de progressão do melanoma, especialmente quando constitutivamente ativando mutações pontuais de BRAFV600 os proto-oncogenes e ARN são presentes10. Nesse sentido, a invenção de inibidores da quinase alvo prometido benefício terapêutico para pacientes que sofrem de melanoma metastático. Uma infinidade de ensaios clínicos realizados a este ponto não tem alcançado significativo benefício para pacientes com melanoma metastático. Quase todas as respostas são parciais, com uma subpopulação de pacientes mostrando resistência primária. Além disso, observou-se a aquisição da resistência secundária, levando a recaída na maioria dos pacientes11,12.
Torna-se claro que a análise do estado de mutação sozinho não é suficiente para desenvolver a estratégia terapêutica mais potente. Novas ferramentas de diagnóstico rápidas e confiáveis são necessárias para sistematicamente registar e analisar a capacidade de resposta das células cancerosas individuais. A grande maioria dos dados disponíveis atualmente no melanoma humano foram Obtida de culturas de células de melanoma (2D) bidimensional. Células tumorais, no entanto, crescidas em 3D permitem intercelular crosstalk entre câncer diferenciado subpopulações de células, bem como entre as células cancerosas e o tecido do hospedeiro circundante não-transformadas. Portanto, seria melhor reconstruir o ambiente 3D, em que o melanoma desenvolvido, para ser usado como um rastreio pré-clínico modelo13,14.

<table><tbody><tr><td>fetal serum albumin (FCS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td>add 10 % to cell culture medium</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300054</td><td>1X dilute in PBS</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61870010</td><td>for cultivation of melanoma cell lines</td></tr><tr><td>DMEM&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41965062</td><td>for cultivation of primary fibroblasts</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco life technologies&amp;nbsp;</td><td>17105041</td><td>2U/ml, dissolve in PBS</td></tr><tr><td>Collagen type I</td><td>BD Biosciences</td><td>354249</td><td>usually from rat tail, concentration should be 3.5-4 mg/ml</td></tr><tr><td>24-well inserts Nunclon&amp;nbsp;</td><td>Nunc</td><td>140629</td><td>8 &amp;micro;m pore size; use standing, not hanging inserts!</td></tr><tr><td>cell strainer</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td>yellow</td></tr><tr><td>Gentamycine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15750060</td><td>dissolve in PBS</td></tr><tr><td>Keralife keratincyte medium</td><td>Cell Systems</td><td></td><td>do not add FCS or antibiotics</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>SERVA</td><td>17454</td><td>NB4 standard grade</td></tr><tr><td>juvenile human keratinocytes</td><td>Cell Systems</td><td>FC-0007</td><td>alternative to own preparation from juvenile foreskin</td></tr><tr><td>juvenile human fibroblasts</td><td>Cell Systems</td><td>FC-0001</td><td>alternative to own preparation from juvenile foreskin</td></tr><tr><td>DMEM&lt;br/&gt; [+] 4,5 g/l Glucose,&lt;br/&gt; [+] L- Glutamine,&lt;br/&gt; [-] L- Pyruvate</td><td>Gibco life technologies</td><td>41965</td><td>mix 1:1 with Ham&amp;acute;s F-12 for MM medium;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; mix 3:1 with Ham&amp;acute;s F-12 for EGM medium</td></tr><tr><td>Ham&amp;acute;s F-12 [+] L-Glutamine</td><td>Gibco life technologies</td><td>&amp;nbsp;21765-029</td><td>add to DMEM for the generation of EGM and MM medium (see lane 15)</td></tr><tr><td>EGF&amp;nbsp;</td><td>Gibco life technologies</td><td>&amp;nbsp;13247-051</td><td>add 10 ng/ml only for the generation of EGM medium</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Merck Chemicals</td><td>2381</td><td>add 1.9 mM for the generation of EGM and 3.8 mM for MM medium</td></tr><tr><td>Selenic acid</td><td>Alfa Aesar</td><td>18851</td><td>add 53 nM for the generation of EGM and MM medium</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Lilly</td><td>HI0219 Hum Pen 3ml 100 E.I./ml</td><td>add 5 &amp;micro;g/ml for the generation of EGM and MM medium</td></tr><tr><td>Ethanolamine</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>E-0135</td><td>add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium</td></tr><tr><td>P-Ethanolamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-0503</td><td>add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium</td></tr><tr><td>Holo-Transferrine</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>T-0665</td><td>add 5 &amp;micro;g/ml for the generation of EGM and MM medium</td></tr><tr><td>Triiodthyronine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-6397</td><td>add 20 pM for the generation of EGM and MM medium</td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-088816</td><td>add 0.4 &amp;micro;g/ml for the generation of EGM and MM medium</td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8783</td><td>add 10 nM only for the generation of EGM medium</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-3784</td><td>add 15 mM for the generation of EGM and MM medium</td></tr><tr><td>Serine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-4311</td><td>add 1 mM for the generation of EGM and MM medium</td></tr><tr><td>Cholinchloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>C-7017</td><td>add 0.64 mM for the generation of EGM and MM medium</td></tr><tr><td>dFCS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-0392 Lot 086K0361</td><td>add 2 % for the generation of EGM and MM medium</td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A-9795</td><td>add 0.18 mM for the generation of EGM and MM medium</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>PromoCell</td><td>C-42209</td><td>add 7.25 mM for the generation of EGM and MM medium</td></tr><tr><td>Strontiumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255521</td><td>add 1 mM for the generation of EGM and MM medium</td></tr><tr><td>anti cytokeratin 10 antibody</td><td>Dako</td><td>M7002</td><td>1:50</td></tr><tr><td>anti cytokeratin 14 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-53253</td><td>1:200</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;anti laminin 5 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-32794</td><td>1:50</td></tr><tr><td>anti filaggrin antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MA5-13440</td><td>1:50</td></tr><tr><td>anti involucrin antibody</td><td>Acris Antibodies</td><td>AM33368PU</td><td>1:50</td></tr><tr><td>secondary polyclonal goat anti-mouse IgG FITC labeled</td><td>LifeSpan Biosciences</td><td>LS-C153907</td><td>1:50</td></tr><tr><td>secondary polyclonal goat anti-mouse IgG Cy3 labeled</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>115-165-003</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10236276001</td><td>1:100</td></tr></tbody></table>

a 3d organotypic melanoma spheroid skin model

Transformação maligna dos melanócitos, as células de pigmento da pele humana, provoca a formação de melanoma, um câncer altamente agressivo com aumento potencial metastático. Recentemente, mono-quimioterapias continuam a melhorar por terapias de combinação específica de melanoma com inibidores da quinase específica. Ainda, melanoma metastático continua a ser uma doença fatal porque tumores exibem resistência primária ou desenvolvem resistência às terapias de romance, assim, recuperar a capacidade oncogenicidade. Para melhorar o sucesso terapêutico de melanoma maligno, a determinação dos mecanismos moleculares que confere resistência contra abordagens de tratamento convencional é necessária; no entanto, requer modelos inovadores celulares em vitro . Aqui, apresentamos um em vitro tridimensional (3D) organotypic melanoma esferoide modelo que pode retratar a arquitetura na vivo de melanoma maligno e pode justificar novos insights sobre intra-tumoral, bem como interações de tumor-hospedeiro. O modelo incorpora números definidos de esferoides melanoma maduras e diferenciadas em um modelo de reconstrução 3D da pele completo humano consistindo de células primárias da pele. O status de composição e de diferenciação celular de esferoides o melanoma incorporado é semelhante da metástase de melanoma cutâneo em vivo. Usar este modelo de esferoide de melanoma organotypic como uma plataforma de despistagem de drogas podem apoiar a identificação dos respondentes para selecionado terapias de combinação, poupando o fardo desnecessário tratamento de não-respondedores, aumentando assim o benefício de intervenções terapêuticas.

O sucesso do tratamento de metástase de melanoma pode ser influenciado pelo cross-talk entre as células do tumor, bem como entre o tumor e células não-transformadas. O objetivo de desenvolver modelos de organotypic do câncer em vitro é fornecer sistemas de testes pré-clínicos apropriado que recapitular a organização 3D e complexidade de melanoma humano in vivo. Isso permite que o estudo do impacto terapêutico do tumor dentro de um ambiente de organotypic e os efeitos adversos sobre o tecido circundante primário em paralelo.
Para desenvolver os melhores modelos de pele de organotypic, a qualidade das células primárias é crucial. É vantajoso usar juvenis primários fibroblastos e queratinócitos, porque normalmente são menos diferenciados em relação às células adultas cutâneo primário. Juvenil pele células podem tanto ser isolado do prepúcio juvenil conforme descrito nas seções de protocolo 1-5, mas também pode ser comprado de empresas como pré-natal primários fibroblastos e queratinócitos. Se compra, é necessário para as células de ordem de doadores diferentes para evitar resultados específicos do doador, por exemplo, para a sensibilidade de drogas. O protocolo é exibido como um esquema na Figura 3.
Controle de qualidade de 3D cheio-pele equivalentes requer análise imuno-histoquímica. Uma primeira impressão pode ser obtida pela hematoxilina-eosina (H & E) mancha de parafina incorporado seções (3 µm). Análise detalhada da qualidade da diferenciação epidérmica e formação da lâmina basal entre a derme e epiderme requerem análise imuno-histoquímica, utilizando anticorpos específicos contra um marcador de estratificação epidérmico. Isto permite distinguir entre células indiferenciadas, altamente proliferativas localizado perto da membrana basal e altamente diferenciadas e marginalizadas células do estrato córneo , através da formação de camadas epidérmicas distintas entre . Conforme mostrado pela coloração histológica-imune (Figura 4), diferenciação dos queratinócitos em toda a epiderme poderia ser alcançada semelhante à pele normal: principalmente as células indiferenciadas das camadas epidérmicas inferiores (estrato basale e estrato spinosum) mancha positiva para queratina 14, enquanto as células mais diferenciadas das camadas supra basal (estrato granuloso e estrato córneo) mancham positiva para queratina 10 e involucrin. Nesse sentido, filaggrin coloração poderia somente ser observada em células altamente diferenciadas do estrato córneo. Mais importante ainda, coloração de laminina 5 revela que uma lâmina basal foi gerada para se conectar a epidérmica fisiologicamente ao compartimento dérmica de reconstruir a pele artificial. Isto prova que um microambiente organotypic comunicação foi gerada de células de melanoma de host ou esferoides para análise de alterações fisiológica e fisiopatológicas.
Com a finalidade de triagem de drogas de melanoma, células de melanoma único também podem ser integradas dentro da derme de equivalentes de pele completo para permitir de novo melanoma ninho formação18,19. Portanto, as células de melanoma são combinadas com fibroblastos primários na proporção de 5:1, centrifugado juntos em 200 x g durante 5 min e resuspended em GNL antes da mistura com colágeno. Como resultado, os ninhos de células de melanoma formarão espontaneamente no compartimento dérmico. De acordo com nossa experiência, apenas células do crescimento metastático fase ninhos de forma adequada, em comparação com as células de melanoma do RGP ou VGP15. Uma grande desvantagem destes tipos de modelos é o fato de que o número e tamanho dos ninhos de melanoma formado não podem ser previstos e podem variar entre pele individual reconstrói, independentemente de qualquer tratamento. Por exemplo, 1.000 células semeadas no compartimento dérmico podem ganhar 10 ninhos consistindo de 100 células ou 100 ninhos consistindo de 10 células cada (Figura 5). Essas variáveis biológicas apresentam três deficiências: primeiro, o número e o tamanho do melanoma ninhos formados são imprevisíveis; em segundo lugar, as metástases no vivo são geralmente maiores que os ninhos de melanoma e apresentam uma diversidade intra-tumoral mais complexa; e em terceiro lugar, devido a limitada duração dos modelos de tumor-ninho, tratamento é iniciado mais cedo e consequentemente um pouco inibe a consequência do tumor em vez de causar regressão de ninhos de tumor existente.
Para superar estes modelos de pele de esferoide de melanoma organotypic limitações pode ser gerados. Por melanoma metastático 250 cultivo as células em um enforcamento cair para 14 dias20, esferoides reproducibly são gerados consistindo de melanoma viável células apresentando uma estrutura compacta com um diâmetro final de cerca de 500 µm imitando não vascularizadas tumor nós, micrometástase, ou inter capilar micro regiões de tumores sólidos21,22. Em geral, qualquer linha de células de melanoma é adequada para a geração de esferoides através do enforcamento cair método; no entanto, células derivadas de mais avançada forma de estágios do tumor metastático mais sólidas esferoides comparados com linhas de células derivadas de progressão estágios iniciais, por exemplo, a RGP.
Para algumas células, é vantajoso para a formação de esferoide adequada aumentar a viscosidade do enforcamento gota de meio de cultura. Isto pode ser conseguido pela adição de 10-50% de metil-celulose para o meio de cultura. Para a metil-celulose solução-mãe, autoclave 1,2 g de metil-celulose em conjunto com uma barra de agitação magnética em um frasco de vidro de 100 mL. Adicionar 100 mL de meio de pré-aquecido (60 ° C) e mexa por 20 min em temperatura ambiente e o outro 1-2 h a 4 ° C. Centrifugue a solução estoque para 2 h a 5.000 x g e armazenar o sobrenadante viscoso a 4 ° C até o uso.
Adequada validação de modelos de esferoide de melanoma de pele completo é fornecido pelo fato de que um número definido de melanoma esferoides pode - pelo menos estatisticamente - integráveis nos fibroblastos dérmico/colágeno eu andaime no dia 1 de construção do modelo da pele, permitindo que -los para co-desenvolver durante a diferenciação epidérmica mais dias 25-27. O rendimento de esferoides pode ser analisado diretamente após a semeadura, porque esferoides aparecem como manchas brancas dentro o transparente dérmicas do gel e podem ser vistas sem qualquer dispositivo de ampliação (Figura 2). Como resultado, um modelo 3D da pele é gerado que esferoides de melanoma maduro de portos, que tinham sido cultivadas em vitro para um total de cerca de 42 dias, mostrando o alto nível de intra-tumoral celular diferenciação15.
H & E mancha do modelo pele melanoma esferoide revela a aparência histológica e distribuição celular de esferoides melanoma ser muito semelhante de melanoma humano avasculares pele metástases na vivo15 (Figura 6 ). Duas subpopulações de células de melanoma são claramente distinguíveis sob estas condições: uma subpopulação de proliferação periférica e uma central subpopulação composta principalmente de encolhida, apoptose ou necróticas células, formando os chamados "necrótico" centro. Immunohistochemically viver e proliferando subpopulações pode ser detectado usando anticorpos contra o marcador de proliferação KI-67, Considerando que as células do centro necrótico podem ser visualizadas pelo TUNEL-coloração15. Esta distribuição particular de subpopulações de células de tumor se justifica pelo tamanho esferoide (≥500 µm), resultante da falta de nutrientes e oxigênio na parte central, onde acumula resíduos catabólicos. Seguindo o protocolo, desde que aqui vai permitir a geração de um organotypic confiável e reprodutível o modelo de pele humana da cheio-espessura com incorporado esferoides de melanoma humano que imitam a metástase de melanoma humano pele. Aplicações deste modelo incluem drogas testes, triagem de toxinas, a influência de compostos cosméticos ou laser terapia em consequência de melanoma e tratamento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig1.jpg"> Figura 1 : Cultivo de organotypic 3D pele reconstrói submersa com médio e na interface líquido-ar. No dia 0 queratinócitos primários são semeados no topo do compartimento dérmico consistindo de fibroblastos primários incorporado em um tipo de colágeno eu matriz. Pele 3D reconstrói fica cultivada submersos com EGM por 7 dias, desanexar da parede da inserção e começa a encolher. No dia 8 as inserções são transferidas para poços de 6 e cultivadas na interface ar-líquido para permitir estratificação epidérmica. <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig2.jpg"> Figura 2 : Esferoides melanoma incorporados no compartimento dérmico aparecem como manchas brancas. Enquanto prepara o compartimento dérmico do reconstruir pele 3D, um número definido de esferoides de melanoma pode ser adicionado para o tipo de colágeno dos fibroblastos que misturar. Uma vez que o gel dermal se estabeleceu, esferoides melanoma tornam-se visíveis como manchas brancas.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig3.jpg"> Figura 3 : Esquema de construção do modelo 3D organotypic pele. Remova o tecido adiposo a amostra de pele e corte em pedaços menores. Incubação com solução de dispase durante a noite a 4 ° C facilita a separação da epiderme da derme. Queratinócitos e fibroblastos primários isolados devem ser cultivados separadamente e usados entre passagem 4-6 e 3-4, respectivamente. Posteriormente, a geração do modelo 3D da pele pode proceder como descrito no protocolo. <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig4.jpg"> Figura 4 : 3D organotypic pele reconstrói mostra um nível de diferenciação semelhante à pele humana normal. Seções de equivalentes de pele de parafina (A) pele humana em relação ao normal (B) foram corados para a expressão de queratina 14 (vermelho: λex 554 nm; λem 568 nm) e 10, involucrin (verde: λex 490 nm; λem 525 nm ), filaggrin (verde: λex 490 nm; λem 525 nm) e laminina 5 (verde: λex 490 nm; λem 525 nm) e analisadas com um microscópio de fluorescência confocal. Núcleo de células foram visualizado por coloração DAPI (azul: λex 340 nm; λem 488 nm). Exame imuno-histoquímico da cheio-espessura 3D da pele equivalentes revelou adequada epidérmico estratificação formando camadas distintas da epiderme, como pode ser visto na pele humana normal. Enquanto as células das camadas epidérmicas inferiores manchados positivas para queratina 14, o mais diferenciado células da camada basal supra mostrou queratina 10 e coloração involucrin. Células altamente diferenciadas perto do estrato córneo expressaram filaggrin. Coloração de laminina 5 mostra que uma lâmina basal é gerada para fisiologicamente conectar epidérmico ao compartimento dérmica (painel inferior). Esta figura foi tirada de Voersmann et al . 15 com permissão. <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig5.jpg"> Figura 5 : O número e tamanho dos ninhos de melanoma espontaneamente formada não podem ser previstos. Formação de ninho de melanoma de novo no compartimento da pele completo equivalentes podem ser conseguidos através da mistura de um número definido de melanoma dérmico células com fibroblastos primários para incorporar ambos os tipos de células do tipo colágeno matriz. O número e tamanho dos ninhos de melanoma espontaneamente formado só podem ser analisados de uma pele madura 3D reconstruir após cerca de 21 dias. Como descrito de duas amostras (A) e (B), os números e os tamanhos dos ninhos melanoma podem variar entre reconstrói individuais da pele. Como consequência, é difícil validar esses modelos e para prever o impacto terapêutico. <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig6.jpg"> Figura 6 : Esferoides melanoma integrados em equivalentes de pele recapitular as características chaves de metástase de melanoma cutâneo humano. H & E manchado de cortes de parafina de tumor esferoides incorporados em equivalentes de pele revelaram esferoides para compartilhar recursos chaves com melanoma cutâneo humano avasculares metástases na vivo. Duas subpopulações de células são claramente discerníveis: uma subpopulação de vida periférica e central subpopulação composta principalmente de encolhida, apoptose ou necróticas células, formando o centro "necrótico". Esta distribuição de subpopulações de células de tumor é garantida pelo tamanho esferoide. Esta figura foi modificada de Voersmann et al . 15 com permissão. <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar um modelo de pele de esferoide melanoma de organotypic 3D que recapitula os dois a arquitetura e complexidade multicelular de um órgão/tumor na vivo , mas ao mesmo tempo acomoda sistemática experimental intervenção.

Um modelo de pele Melanoma de Organotypic 3D esferoide

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

a-3d-organotypic-melanoma-spheroid-skin-model

Research

JoVE Journal

Cancer Research

15.6K visualizações.  TU-Dresden. Aqui, apresentamos um protocolo para gerar um modelo de pele de esferoide melanoma de organotypic 3D que recapitula os dois a arquitetura e complexidade multicelular de um órgão/tumor na vivo , mas ao mesmo tempo acomoda sistemática experimental intervenção.

Vídeo: A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells behave differently when they are grown within a 3D extra-cellular matrix and also interact with other cells (1-5). Mouse models have been broadly utilized to study tissue morphogenesis in vivo. However mouse and human skin have significant differences in cellular architecture and physiology, which makes it difficult to extrapolate mouse studies to humans. Since melanocytes in mouse skin are mostly localized in hair follicles, they have distinct biological properties from those of humans, which locate primarily at the basal layer of the epidermis. The recent development of 3D human skin reconstruct models has enabled the field to investigate cell-matrix and cell-cell interactions between different cell types. The reconstructs consist of a "dermis" with fibroblasts embedded in a collagen I matrix, an "epidermis", which is comprised of stratified, differentiated keratinocytes and a functional basement membrane, which separates epidermis from dermis. Collagen provides scaffolding, nutrient delivery, and potential for cell-to-cell interaction. The 3D skin models incorporating melanocytic cells recapitulate natural features of melanocyte homeostasis and melanoma progression in human skin. As in vivo, melanocytes in reconstructed skin are localized at the basement membrane interspersed with basal layer keratinocytes. Melanoma cells exhibit the same characteristics reflecting the original tumor stage (RGP, VGP and metastatic melanoma cells) in vivo. Recently, dermal stem cells have been identified in the human dermis (6). These multi-potent stem cells can migrate to the epidermis and differentiate to melanocytes.

In this report, we describe the three-dimensional skin reconstruct model which mimics human skin in architecture and composition. Melanocyte physiology, melanoma progression and the fate of dermal stem cells have been investigated using the skin reconstruct model. The model is also useful as a preclinical tool for drug assessment.

A Pele Tridimensional Humanos Reconstruir Modelo: uma Ferramenta para o Estudo da Pele Normal e Progressão Melanoma

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Bioengenharia

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture vessels versus in vivo in human patients. This is due to the bottleneck selection of clonal populations of melanoma cells that can robustly grow in vitro in the absence of physiological conditions. Further, responses to therapy in two-dimensional tissue cultures overall do not faithfully reflect responses to therapy in melanoma patients, with the majority of clinical trials failing to show the efficacy of therapeutic combinations shown to be effective in vitro. Although xenografting of melanoma cells into mice provides the physiological in vivo context absent from two-dimensional tissue culture assays, the melanoma cells used for engraftment have already undergone bottleneck selection for cells that could grow under two-dimensional conditions when the cell line was established. The irreversible alterations that occur as a consequence of the bottleneck include changes in growth and invasion properties, as well as the loss of specific subpopulations. Therefore, models that better recapitulate the human condition in vivo may better predict therapeutic strategies that effectively increase the overall survival of patients with metastatic melanoma. The patient-derived xenograft (PDX) technique involves the direct implantation of tumor cells from the human patient to a mouse recipient. In this manner, tumor cells are consistently grown under physiological stresses in vivo and never undergo the two-dimensional bottleneck, which preserves the molecular and biological properties present when the tumor was in the human patient. Notable, PDX models derived from organ sites of metastases (i.e., brain) display similar metastatic capacity, while PDX models derived from therapy naive patients and patients with acquired resistance to therapy (i.e., BRAF/MEK inhibitor therapy) display similar sensitivity to therapy.

Patient-derived xenograft (PDX) models more robustly recapitulate melanoma molecular and biological features and are more predictive of therapy response compared to traditional plastic tissue culture-based assays. Here we describe our standard operating protocol for the establishment of new PDX models and the characterization/experimentation of existing PDX models.

Um modelo de Xenoenxerto derivado do paciente com melanoma

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

Pesquisa do câncer

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro model in the study of cancer stem/initiating cells, preclinical cancer research, and drug screening. The 3D spheroid models are superior to conventional tumor cell culture and reproduce some important characters of real solid tumors. However, conventional 3D tumor spheroids are made up exclusively of tumor cells. They lack the participation of tumor stromal cells and have insufficient extracellular matrix (ECM) deposition, thus only partially mimicking the in vivo conditions of tumor tissues. We established a new multicellular 3D spheroid model composed of tumor cells and stromal fibroblasts that better mimics the in vivo heterogeneous tumor microenvironment and its native desmoplasia. The formation of spheroids is strictly regulated by the tumor stromal fibroblasts and is determined by the activity of certain crucial intracellular signaling pathways (e.g., Notch signaling) in stromal fibroblasts. In this article, we present the techniques for coculture of tumor cells-stromal fibroblasts, time-lapse imaging to visualize cell-cell interactions, and confocal microscopy to display the 3D architectural features of the spheroids. We also show two examples of the practical application of this 3D spheroid model. This novel multicellular 3D spheroid model offers a useful platform for studying tumor-stroma interaction, elucidating how stromal fibroblasts regulate cancer stem/initiating cells, which determine tumor progression and aggressiveness, and exploring involvement of stromal reaction in cancer drug sensitivity and resistance. This platform can also be a pertinent in vitro model for drug discovery.

A novel three-dimensional spheroid model based on the heterotypic interaction of tumor cells and stromal fibroblasts is established. Here, we present coculture of tumor cells and stromal fibroblasts, time-lapse imaging, and confocal microscopy to visualize the formation of spheroids. This three-dimensional model offers a pertinent platform to study tumor-stroma interactions and test cancer therapeutics.

Um novo modelo esferoide de tumor 3D modulado por fibrosa estromal para estudar a interação tumoral-stroma e a descoberta de drogas

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its progression. Although the mechanisms involved in promoting breast cancer growth have been intensively studied using monocultures of breast cancer cells such as MCF-7 cells, the contribution of other cell types, such as vascular and lymphatic endothelial cells that are intimately involved in tumor growth, has not been investigated in depth. Cell-cell interaction plays a key role in tumor growth and progression. Neoangiogenesis, or the development of vessels, is essential for tumor growth, whereas the lymphatic system serves as a portal for cancer cell migration and subsequent metastasis. Recent studies provide evidence that vascular and lymphatic endothelial cells can significantly influence cancer cell growth. These observations imply a need for developing in vitro models that would more realistically reflect breast cancer growth processes in vivo. Moreover, restrictions in animal research require the development of ex vivo models to elucidate better the mechanisms involved.
This article describes the development of breast cancer spheroids composed of both breast cancer cells (estrogen receptor-positive MCF-7 cells) and vascular and/or lymphatic endothelial cells. The protocol describes a detailed step-by-step approach in creating dual-cell spheroids using two different approaches, hanging drop (gold standard and cheap) and 96-well U-bottom plates (expensive). In-depth instructions are provided for how to delicately pick up the formed spheroids to monitor growth by microscopic sizing and assessing viability using dead and live cell staining. Moreover, procedures to fix the spheroids for sectioning and staining with growth-specific antibodies to differentiate growth patterns in spheroids are delineated. Additionally, details for preparing spheroids with transfected cells and methods to extract RNA for molecular analysis are provided. In conclusion, this article provides in-depth instructions for preparing multi-cell spheroids for breast cancer research.

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Crosstalk between mammary epithelial cells and endothelial cells importantly contributes to breast cancer progression, tumor growth, and metastasis. In this study, spheroids have been made from breast cancer cells together with vascular and/or lymphatic endothelial cells and demonstrate their applicability as an in vitro system for breast cancer research.

Eferóides de células epiteliais e endoteliais como um modelo in vitro potencial funcional para pesquisa de câncer de mama

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

<meta charset="utf8"></head><body>Organoides de melanoma derivados de pacientes: uma fronteira na imunoterapia contra o câncer

Unveiling Therapeutic Opportunities with Melanoma Patient-derived Organoid Models

With the development of immunotherapy, there is an ongoing need to develop models that can recapitulate the tumor microenvironment of native tumors. While traditional two- and three-dimensional models can offer insights into cancer development and progression, these lack crucial aspects that hinder a faithful mimic of native tumors. An alternative model that has gained a lot of attention is the patient-derived organoid. The development of these organoids recapitulates the complex intercellular communication, tumor microenvironment, and histoarchitecture of tumors. This paper describes the protocol for establishing melanoma patient-derived organoid (MPDO) models. To validate these models, we assessed the immune cell composition, including the expression levels of T-cell activation markers, to confirm the cellular heterogeneity of the organoids. Additionally, to describe the potential utility of MPDOs in cellular therapies, we evaluated the cytotoxic capabilities of treating the organoids with &#947;&#948; T-cells. In conclusion, the MPDO models offer promising avenues for understanding tumor complexity, validating therapeutic strategies, and potentially advancing personalized treatment.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Recriando a complexidade do melanoma com organoides derivados de pacientes para avaliação de imunoterapia

Here, we present a protocol to generate melanoma patient-derived organoids by culturing disassociated cell suspensions from fresh melanoma tissues. These organoids faithfully recapitulate patient-specific tumors in vitro, offering an innovative approach to exploring tumor immunosuppressive mechanisms, drug screening, drug resistance mechanisms, and cancer surveillance approaches.

Revelando oportunidades terapêuticas com modelos organoides derivados de pacientes com melanoma

With the development of immunotherapy, there is an ongoing need to develop models that can recapitulate the tumor microenvironment of native tumors. While ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to traditional two-dimensional (2D) cell culture. The spheroid model is able to mimic the effects of cell-cell interaction, hypoxia and nutrient deprivation, and drug penetration. One characteristic of this model is the development of a necrotic core, surrounded by a ring of G1 arrested cells, with proliferating cells on the outer layers of the spheroid. Of interest in the cancer field is how different regions of the spheroid respond to drug therapies as well as genetic or environmental manipulation. We describe here the use of the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) system along with cytometry and image analysis using commercial software to characterize the cell cycle status of cells with respect to their position inside melanoma spheroids. These methods may be used to track changes in cell cycle status, gene/protein expression or cell viability in different sub-regions of tumor spheroids over time and under different conditions.

We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids.

Análise baseada em Citometria de Fluxo Imaging- e da Posição celular eo ciclo celular em 3D melanoma Spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Medicina

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

Cultivando uma Epiderme Humana Reconstruída Tridimensional em grande escala

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

<meta charset="utf8"></head><body>Modelos de pele 3D eficientes para aplicação de pesquisa flexível

Building Up Skin Models for Numerous Applications - from Two-Dimensional (2D) Monoculture to Three-Dimensional (3D) Multiculture

Due to the complex structure and important functions of the skin, it is an interesting research model for the cosmetic, pharmaceutical, and medical industries. In the European Union, there has been a total ban on testing cosmetic products and their ingredients on animals. In the case of medicine and pharmaceuticals, this possibility is also constantly limited. In accordance with the 3Rs principle, it is becoming more and more common to test individual compounds as well as entire formulations on artificially created models. The cheapest and most widely used are the 2D models, which consist of a cell monolayer but do not reflect the real interactions between the cells in the tissue. Although the commercially available 3D models provide a better representation of the tissue, they are not used on a large scale. This is because they are expensive, the waiting time is quite long, and the available models are frequently limited to only those typically used. 
In order to move the conducted research to a higher level, we have optimized the procedures of various 3D skin model preparations. The described procedures are cheap and simple to prepare as they can be applied in numerous laboratories and by researchers with different experiences in cell culture.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Aprimorando a diversidade de modelos de pele com modelos celulares 3D econômicos

Here, we present inexpensive and simple procedures to introduce various 3D skin models for routine research in a cell culture laboratory. Researchers can create models tailored to their needs without relying on commercially available models.

Construindo modelos de pele para inúmeras aplicações - da monocultura bidimensional (2D) à multicultura tridimensional (3D)

Due to the complex structure and important functions of the skin, it is an interesting research model for the cosmetic, pharmaceutical, and medical ...

Um modelo de pele Melanoma de Organotypic 3D esferoide

Resumo

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A Pele Tridimensional Humanos Reconstruir Modelo: uma Ferramenta para o Estudo da Pele Normal e Progressão Melanoma

Um modelo de Xenoenxerto derivado do paciente com melanoma

Um novo modelo esferoide de tumor 3D modulado por fibrosa estromal para estudar a interação tumoral-stroma e a descoberta de drogas

Eferóides de células epiteliais e endoteliais como um modelo in vitro potencial funcional para pesquisa de câncer de mama

Revelando oportunidades terapêuticas com modelos organoides derivados de pacientes com melanoma

Revelando oportunidades terapêuticas com modelos organoides derivados de pacientes com melanoma

Revelando oportunidades terapêuticas com modelos organoides derivados de pacientes com melanoma

Análise baseada em Citometria de Fluxo Imaging- e da Posição celular eo ciclo celular em 3D melanoma Spheroids

Cultivando uma Epiderme Humana Reconstruída Tridimensional em grande escala

Construindo modelos de pele para inúmeras aplicações - da monocultura bidimensional (2D) à multicultura tridimensional (3D)