O suporte para este trabalho e / ou publicação foi fornecido pelo Instituto de Ciências da Faculdade de Artes da Universidade de Fairfield e Ciências, Faculdade Research Grant da Universidade de Fairfield, um Prêmio de Ciência Cottrell Colégio da Corporação de Pesquisa para a Ciência Avanço da Faculdade de Artes e Ciências da Universidade de Fairfield e Química &amp; Bioquímica Departamento da Universidade de Fairfield. Agradecemos Jean Marie Wallace para a introspecção muito útil e aconselhamento no que diz respeito a esta área geral de pesquisa. Além disso, estendemos um agradecimento muito especial a todos passados, atuais e futuros pesquisadores de graduação da Harper-Leatherman Research Lab.

óculos de segurança ou óculos de protecção, bata de laboratório e luvas de laboratório deve ser usado em todos os momentos durante o procedimento. Nunca utilize o aparelho de ponto de secagem crítica sem óculos de segurança ou óculos de proteção. Todas as soluções contendo tetrametoxissilano, metanol, etanol, acetona, e amónia deve ser processado dentro de uma hotte. 1. Certifique-Tampão e Cit. C Solutions <ol><li> Para tornar ~ 750 ml de pH 7, tampão fosfato de potássio 40 mM, primeiro preparar 500 ml de 0,04 M de fosfato de potássio monobásico por pesagem de 2,72 g de fosfato monobásico de potássio e dissolução em água, utilizando um balão volumétrico de 500 ml. </li><li> Prepare a 500 ml de 0,04 M de fosfato de potássio dibásico por pesagem de 3,48 g de fosfato dibásico de potássio e dissolução em água, utilizando um balão volumétrico de 500 ml. </li><li> Verter a solução de sal dibásico numa proveta grande com uma barra de agitação e comece a agitar a solução sobre uma placa de agitação. </li><li> Lentamente, adicionar porções do sal monobásico sOlution para a solução de sal dibásico enquanto se monitorizava o pH com um eléctrodo de pH e medidor até o pH ser 7.00. será usada Aproximadamente 250-300 ml da solução de sal monobásico. </li><li> Pesar cerca de 0,023 g de cit. C e coloque no frasco de cintilação de vidro. Adicionar 2000 mL de tampão fosfato de potássio preparado utilizando uma micropipeta e, em seguida, agite suavemente a solução para misturar até todo o sólido cit, vermelho. C tenha dissolvido na solução e não de partículas mantém-se. </li><li> Tomar 20 ul da solução de citocromo C preparado. E adicionar a um 1 cm de comprimento de percurso cuvete de plástico. Adicionar 3 ml de tampão preparado. </li><li> Aqui UV-vis espectro 300-700 nm utilizando tampão na célula de referência. Utilizar a cit. C absorvância (A) a 409 nm, o coeficiente de extinção 31 (ε) de 106100 M-1 cm-1, o comprimento do percurso cuvete (L), e a lei de Beer-Lambert para determinar a concentração (C) da solução (a = εlc). </li><li> Voltar calcular a concentração da solução preparada originais. Os 2 ml preparado cit. Solução C é tipicamente entre 0,7 a 0,9 mM em concentração. </li><li> Dilui-se a solução original C preparado cit. Para 800 ul de 0,105 mM, por pipetagem de 117 ul de 0,72 mM preparado cit. Solução C num frasco de cintilação. Em seguida, adicione o equilíbrio das 800 ul (683 ul neste caso) de tampão preparado. Agite para misturar. Os volumes exactos podem variar, dependendo da concentração exacta do original é preparado cit. Solução C como o volume de cit. C a pipeta é calculado como (800 ul * 0,105 mM) / (cyt originais. C concentração em mM). </li><li> Armazenar cit preparada e diluída originais. Soluções c de 2-8 ° C no frigorífico até estar pronto para usar por até duas semanas. </li></ol> 2. Sintetizar Sílica (SiO2) Sol <ol><li> Rotular um descartável copo de 50 ml de polipropileno &#39;SejaAker A &#39;. Coloque copo no pan de uma balança analítica e usar uma pipeta Pasteur de vidro para adicionar 1,88 g tetrametoxissilano para o copo. Zero o equilíbrio e depois pipeta 2,88 g de metanol em &quot;Copo A &#39;. </li><li> Cover &#39;Copo A&#39; com Parafilm. </li><li> Rotular um descartável copo de 50 ml de polipropileno &#39;taça B&#39;. Adicionar uma barra de agitação magnética e coloque sobre a panela de uma balança analítica. Use uma pipeta de vidro para adicionar 0,75 g de água e 3,00 g de metanol. </li><li> Cover &#39;taça B&#39; com Parafilm. </li><li> Comece a agitação do conteúdo de &#39;taça B&#39; numa placa de agitação dentro de um extractor de fumo, em seguida, utilizar uma seringa para inserir 5 ul de uma solução de hidróxido de amónio 28,0-30,0% através do Parafilm cobrir na mistura, enquanto se agitava. </li><li> Assim que passo 2.5 estiver concluída, adicionar o conteúdo da &quot;Taça A &#39;a&#39; taça B &#39;. Agita-se a mistura durante 20 min, enquanto se coberto de Parafilm. </li></ol> 3. Prepare Gel Moldes Nota: Nãoé o tempo para preparar os moldes de gel enquanto a mistura de sol de sílica é de agitação no passo 2.6. <ol><li> Adquirir 8-9 frascos de polipropileno de cintilação (16 mm x 57 mm, dimensão de volume de 6,5 ml, com fundos cortada) e tampas correspondentes. Coloque filme plástico sobre a extremidade da tampa do frasco para criar uma superfície plana para o gel para formar sobre e coloque a tampa sobre ele certificando-se que o invólucro de plástico permanece intacta dentro da tampa. </li><li> Alinhar os frascos com tampa-end para baixo na bancada e abriu fundo voltado para cima. </li></ol> 4. Prepare Cit. C -silica Sol-gel <ol><li> Após a conclusão do Sol de mistura (passo 2.6), adicionar 3 ml da mistura de sol para uma proveta descartável de 50 ml de polipropileno limpo. </li><li> Usar uma pipeta de Pasteur de vidro para soltar-se lentamente 500 ul de 0,105 mM a diluída. Cit solução C (feito no passo 1.9) à mistura 3 ml de Sol ao longo de ~ 1 min. Certifique-se de homogeneizar suavemente a mistura ao adicionar o cit. C para evitar a formação de grandesaglomerados vermelhas. Assumindo que os volumes são aditivos, diluindo 500 ul de solução C a 0,105 mM cit. A 3500 ul, a concentração c cit. Agora no sol é, em teoria, 15 uM. </li><li> Pipeta de 0,5 ml da resultante cit. C sol de sílica em cada molde preparado. Também pipetar 0,5 ml de sol de sílica restante &quot;liso&quot; em um ou dois moldes para utilizar como amostras de controlo durante o processo de secagem supercrítico. </li><li> Cubra as aberturas viradas para cima dos moldes com Parafilm e coloque na geladeira (~ 2-8 ° C) durante a noite ou por pelo menos 12 horas para produzir sol-gel. </li><li> Tome os moldes fora da geladeira. Remover o Parafilm a partir do topo de um molde que contem um cit c sol-gel.; também remover a tampa e película de plástico a partir do fundo. </li><li> Após a adição de um pouco de etanol a partir de uma garrafa de lavagem para dentro do molde, utilizar a extremidade circular de disco de um êmbolo da seringa para empurrar cuidadosamente o gel para fora do molde e para dentro de 20 ml de cintilação de vidro cont frasco limpoaining aproximadamente 5 ml de etanol. </li><li> Repetir este procedimento de remoção de gel (passos 4,5 e 4,6) até que todo o cit. C géis são adicionados ao frasco e todos os geles de sílica são adicionados a um frasco separado. Se mais de uma concentração de gel c cit. Foi feito, não se esqueça de armazenar como géis juntos dentro frascos separados. Em seguida, encher os frascos até o topo com etanol, tampa e armazenar entre 2-8 ° C. </li><li> De quatro em quatro horas ao longo do dia, retirar os geles do frigorífico, decanta-se o etanol fora os géis e substituir com etanol fresco. </li><li> Durante um período adicional de três dias, submergir os géis Sol molhado em acetona, e adição de acetona decantação fresco três vezes por dia. </li></ol> 5. super-criticamente seco Cit. C -silica Sol-gel <ol><li> Arrefece-se uma aparelho de ponto crítico de secagem (ver Figura 1) a 10 ° C por ajuste da temperatura de um circulador ligado a 8 ° C. </li><li> Uma vez que o aparelho tem reached 10 ° C, realizar um ensaio de fugas sobre o aparelho de enchimento de um barco de transferência com acetona e selando-o no interior do aparelho. <ol><li> Abrir a válvula de enchimento do aparelho e adicionar o dióxido de carbono até que o aparelho é meio-cheio. </li><li> Feche a válvula de enchimento e ouvir atentamente para sibilando para as portas e válvulas, onde o-rings ou selos podem ser deterioradas. </li><li> Substitua quaisquer O-rings ou selos se um vazamento é encontrado. </li></ol></li><li> Depois de concluir o teste de vazamento, abra a válvula de drenagem para liberar a acetona e dióxido de carbono para a drenagem de um exaustor. Em seguida, retire o barco transferência do aparelho. </li><li> Depois de garantir que o aparelho está livre de vazamentos, despeje cuidadosamente o gel molhado dos frascos de cintilação, juntamente com a maior parte da acetona, em três seções longo do barco de transferência (cestas de amostra ou tampas de gaze não são necessárias). Delicadamente empurrar e mover os geles dentro do barco com uma pinça para assegurar que todos os géis são completamente submerso iN acetona. Adicionar mais acetona, se necessário antes de selar o barco interior do aparelho. </li><li> Abrir a válvula de enchimento do aparelho para adicionar dióxido de carbono, em seguida, abrir a válvula de descarga para libertar acetona durante cinco minutos, logo que a mistura de acetona com o dióxido de carbono é observada a afundar para o fundo do aparelho através da janela do aparelho. Esta infiltração da acetona para a parte inferior irá ocorrer antes do aparelho ser completamente cheio com dióxido de carbono, de modo que a válvula de enchimento deve permanecer aberto à medida do necessário durante o escoamento de modo a que o aparelho vai continuar a encher, mesmo quando a descarga está aberta. </li><li> Feche a válvula de drenagem. Mantenha a válvula de enchimento abriu ligeiramente. </li><li> Cinco minutos mais tarde, abrir a válvula de drenagem durante cinco minutos novamente e ajustar a válvula de enchimento para ser aberto suficiente para que o aparelho permanece cheio durante todo o tempo de drenagem. Feche a válvula de drenagem, mantenha a válvula de enchimento abriu, em seguida, repita este passo drenando mais uma vez de cincominutos depois. </li><li> Seguindo estes três primeiros passos de drenagem, abrir o dreno durante 5 minutos a uma hora aproximadamente a cada 40 min durante o período de pelo menos seis horas para garantir que a substituição completa da acetona por dióxido de carbono líquido no interior dos géis. Sempre ajustar a válvula de enchimento de ser suficientemente aberta durante cada drenagem de modo a que o nível do líquido no aparelho nunca cai abaixo do topo do barco durante a drenagem. </li><li> passos, uma vez que drenam estiverem concluídos, feche a válvula de enchimento e drenar o dióxido de carbono líquido para que o nível permanece visível logo acima dos dentes da embarcação, olhando através da janela do aparelho. </li><li> Ajustar a temperatura do aparelho ligado ao circulador de 40 ° C para assegurar que os aumentos de dióxido de carbono líquido acima da sua temperatura e pressão crítica (T C = 31 ° C; P C = 7,4 MPa). </li><li> Após aproximadamente 15 min, observar a transição do estado líquido para o fluido supercrítico através da janela do aparelho tal como o menisco líquido-nos acima dos pinos do barco desaparece. Permitir que pelo menos 15 min de tempo de equilíbrio, em seguida, abra a válvula de ventilação uma pequena quantia para começar a liberar o fluido supercrítico. </li><li> Ao longo de aproximadamente 45 min, continuar a abrir gradualmente a válvula de descarga maior e mais ampla de modo que um silvo estável, mas muito baixa do fluido libertando pode ser ouvido e o indicador de pressão é observado para diminuir lentamente a zero. </li><li> Depois de a pressão do aparelho passou a zero, abrir a porta do aparelho, remover o barco, e utilizar uma pinça para colocar os aerogéis recém secas em frascos de cintilação de vidro limpo. </li></ol> 6. Caracterizar Cit. C -silica Aerogels com UV-visível e Dicroísmo Circular (CD) Espectroscopia <ol><li> Prepare uma plataforma de papelão para manter os monólitos de aerogel no caminho do feixe do espectrofotômetro ou CD espectrômetro de UV-Visível. <ol><li> Corte um pedaço 2,5 centímetros x 2,5 centímetros de papelão leve (tal como o cartão de uma caixa de labotecido respiratória), dobre ao meio, corte a meio caminho na dobra, em seguida, dobre as duas abas, criadas por corte, para trás. </li><li> Cortar a 5 cm x 5 cm pedaço de papelão leve, com um 1,5 cm x 1,5 cm buraco quadrado no meio. Em seguida, use fita isolante preta para diminuir o tamanho do porão para 0,5 cm x 0,5 cm. </li><li> Tape as abas de papelão dobrado e corte de encontro a 5 cm x 5 cm pedaço de papelão para que uma pequena superfície curvada é criado para um monolito aerogel para sentar-se em frente do 0,5 cm x 0,5 cm furo (ver Figura 2) . Em seguida, tape a parte de trás de papelão para o espectrofotômetro UV-visível para o buraco está em linha com o caminho do feixe. </li></ol></li><li> Medir a espessura dos géis, os quais irão ser utilizados para os comprimentos de caminho, com um micrómetro. </li><li> Coloque um gel sobre a plataforma de papelão e medir um espectro 300-800 nm com ar no compartimento de referência do espectrofotómetro de UV-visível. </li><li> Encaixar um polinômio, A = a </em&gt; λ N, a região do comprimento de onda (λ), onde a absorvância (A) é principalmente devido ao espalhamento fundo, ~ 700-800 nm. O coeficiente é tipicamente em forma de um número entre 1 x 10 ~ 8 e 1 x 10 6 e o coeficiente n é tipicamente em forma de um número entre 2 e 3 ~. </li><li> Calcula-se a dispersão a outros comprimentos de onda, utilizando os coeficientes, um e n, obtido a partir do ajuste. </li><li> Subtrair esse absorção fundo dispersão calculada a partir do espectro bruto para obter uma dispersão corrigido espectro. </li><li> Montar o espectro de dispersão subtraído com uma curva de Gauss na região de 370-490 nm, utilizando software apropriado (GRAMAS / AI 8,0) para determinar a altura do pico, pico de centro, e a largura de pico a pico de Soret do aerogel. </li><li> Aplicar a Lei de Lambert-Beer utilizando a espessura medida do gel para o comprimento do percurso (L), o coeficiente de extinção 31 (ε) de 106,100 M-1cm-1 </sup&gt; e a altura do pico Soret (A) para calcular a concentração de (C) de cit. c no aerogel (A = εlc). </li><li> Comparar o cit calculado. C concentração para a concentração teoricamente no gel (15 uM) para determinar a viabilidade de cit. C dentro do aerogel. Por cento viabilidades típicas encontram-se perto de 100%, mas deve notar-se que estes viabilidades são apenas estimativas porque o cálculo é baseado no coeficiente de extinção de cit. C em solução 31, que se presume ser ligeiramente diferente do que o coeficiente de extinção de cit. c em que os aerogéis não é conhecido. </li><li> azoto executar no instrumento CD, pelo menos, 5 minutos antes de ligar a lâmpada. </li><li> Tape o titular do cartão para o CD espectrômetro de modo que o buraco está em linha com o caminho do feixe. </li><li> Medir um comprimento de onda do espectro em branco contínuo com nada no suporte de papelão 350-500 nm a 100 nm / min, tendo uma média de três scans. </li><li> Coloque um gel (espessura medido anteriormente no passo 6.2) na plataforma de papelão e medir um espectro 350-500 nm a 100 nm / min, tendo uma média de três varreduras. </li><li> Repita as medições de UV-Visível e CD para todos os monólitos de aerogel de interesse. </li></ol> 7. detectar a presença de óxido nítrico Gás (NO) com Cit. C -silica Aerogels CUIDADO: Trabalhando com NÃO é perigoso e todos NO gás deve ser tratado em um exaustor ou esgotados em uma coifa. a exposição contínua ao NO é tóxico para os tecidos, como o dióxido de azoto altamente venenosas e / ou tetróxido de azoto formam quando NÃO vem em contacto com o ar. De calor e fumos corrosivos são também produzidos quando NÃO vem em contacto com a água. <ol><li> Coloque um cilindro de 8 L de óxido nítrico (o óxido nítrico a 10%, 90% de azoto) numa hotte bem ventilada e ajustar a pressão a 4 psi. </li><li> Ligar a tubagem para tanto o cilindro de óxido nítrico e de um cilindro de azoto (pressão ajustada a 6 psi) e ligar as extremidades dos tubos a uma t-válvula (ver Figura 3a). </li><li> Escolha um monolito aerogel para o experimento e medir a espessura (ou comprimento do caminho) com um micrómetro. </li><li> Coloque o aerogel (~ 3 mm de espessura) em uma tina descartável com tampa de plástico e colocar a cuvete no espectrofotômetro. Corte o aerogel um pouco se necessário para caber na célula. </li><li> Inserir duas agulhas de seringa no interior da tampa de plástico da cuvete, uma ligada à saída do t-válvula, e uma ligada a um tubo para servir de escape para dentro da coifa (ver Figura 3b). Use Parafilm para selar as agulhas para a tubagem e a tampa da cuvete. </li><li> Coloque um cuvete descartável vazia na célula de referência. </li><li> Ajustar a posição cuvete aerogel para assegurar que o aerogel se encontra no caminho do raio antes de se iniciar o experimento. </li><li> Tomar um espectro inicial 800-300 nm. </li><li> Monitorar a diferença entre a absorvância a 414 nm e a absorvância a 408 nm, enquanto roda o t-válvula para alternar entre o azoto e a mistura de óxido de / azoto nítrico, a intervalos de tempo definidos certificando-se que em nenhum momento é a taxa de fluxo de azoto ou misturas de óxido de / azoto nítrico tão alta que aerogel se move em torno da cuba. </li><li> Tome um espectro final a partir de 800 a 300 nm, uma vez que os ciclos de exposição terminar. </li><li> Repetir o processo com três a quatro monólitos para obter uma resposta média de detecção. </li></ol>

<ol>
	<li>Pettigrew, G. W., Moore, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cytochromes c. Biological Aspects. , (1987).</li><li>Moore, G. R., Pettigrew, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cytochromes c. Evolutionary, Structural, and Physicochemical Aspects. , (1990).</li><li>Scott, R. A., Mauk, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cytochrome c: A Multidisciplinary Approach. , (1996).</li><li>Wallace, J. M., Rice, J. K., Pietron, J. J., Stroud, R. M., Long, J. W., Rolison, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silica+nanoarchitectures+incorporating+self-organized+protein+superstructures+with+gas-phase+bioactivity.">Silica nanoarchitectures incorporating self-organized protein superstructures with gas-phase bioactivity.</a> Nano Lett. 3 (10), 1463-1467 (2003).</li><li>Wallace, J. M., Dening, B. M., Eden, K. B., Stroud, R. M., Long, J. W., Rolison, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver-colloid-nucleated+cytochrome+c.+superstructures+encapsulated+in+silica+nanoarchitectures.">Silver-colloid-nucleated cytochrome c. superstructures encapsulated in silica nanoarchitectures.</a> Langmuir. 20 (21), 9276-9281 (2004).</li><li>Wallace, J. M., Stroud, R. M., Pietron, J. J., Long, J. W., Rolison, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+particle+size+and+protein+content+on+nanoparticle-gold-nucleated+cytochrome+c.+superstructures+encapsulated+in+silica+nanoarchitectures.">The effect of particle size and protein content on nanoparticle-gold-nucleated cytochrome c. superstructures encapsulated in silica nanoarchitectures.</a> J.Non-Cryst. Solids. 350, 31-38 (2004).</li><li>Rolison, D. R., Wallace, J. M., Pietron, J. J., Rice, J. K., Stroud, R. M. U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> US Patent. , (2007).</li><li>Harper-Leatherman, A. S., Wallace, J. M., Rolison, D. R., Minteer, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+c.+stabilization+and+immobilization+in+aerogels.">Cytochrome c. stabilization and immobilization in aerogels.</a> Enzyme Stabilization and Immobilization: Methods and Protocols. 679, 193-205 (2011).</li><li>Harper-Leatherman, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+procedure+for+encapsulating+cytochrome+c.+in+silica+aerogel+nanoarchitectures+while+retaining+gas-phase+bioactivity.">Simplified procedure for encapsulating cytochrome c. in silica aerogel nanoarchitectures while retaining gas-phase bioactivity.</a> Langmuir. 28 (41), 14756-14765 (2012).</li><li>Hitihami-Mudiyanselage, A., Senevirathne, K., Brock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+phosphide+nanocrystals+into+porous+networks:+Formation+of+InP+gels+and+aerogels.">Assembly of phosphide nanocrystals into porous networks: Formation of InP gels and aerogels.</a> ACS Nano. 7 (2), 1163-1170 (2013).</li><li>Fricke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Aerogels. , (1986).</li><li>H&#252;sing, N., Schubert, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerogels-airy+materials:+chemistry,+structure,+and+properties.">Aerogels-airy materials: chemistry, structure, and properties.</a> Angew. Chem. Int. Edit. 37 (1-2), 22-45 (1998).</li><li>Aegerter, A. M., Leventis, N., Koebel, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Aerogels Handbook. , (2011).</li><li>Kazuyoshi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+aerogel+science+and+technology.">Recent progress in aerogel science and technology.</a> Adv. Porous Mater. 1 (2), 147-163 (2013).</li><li>Leventis, N., Elder, I. A., Anderson, M. L., Rolison, D. R., Merzbacher, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Durable+modification+of+silica+aerogel+monoliths+with+fluorescent+2,7-diazapyrenium+moieties.+Sensing+oxygen+near+the+speed+of+open-air+diffusion.">Durable modification of silica aerogel monoliths with fluorescent 2,7-diazapyrenium moieties. Sensing oxygen near the speed of open-air diffusion.</a> Chem. Mater. 11 (10), 2837-2845 (1999).</li><li>Plata, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerogel-platform+optical+sensors+for+oxygen+gas.">Aerogel-platform optical sensors for oxygen gas.</a> J. Non-Cryst. Solids. 350, 326-335 (2004).</li><li>Rolison, D. R., Pietron, J. J., Long, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+sensitivity,+specificity,+and+time+signature+of+sensors+through+architectural+design+on+the+nanoscale.">Controlling the sensitivity, specificity, and time signature of sensors through architectural design on the nanoscale.</a> ECS Trans. 19 (6), 171-179 (2009).</li><li>Carroll, M. K., Anderson, A. M., Aegerter, A. M., Leventis, N., Koebel, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerogels+as+platforms+for+chemical+sensors.">Aerogels as platforms for chemical sensors.</a> Aerogels Handbook. , 637-650 (2011).</li><li>Rolison, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalytic+nanoarchitectures-The+importance+of+nothing+and+the+unimportance+of+periodicity.">Catalytic nanoarchitectures-The importance of nothing and the unimportance of periodicity.</a> Science. 299 (5613), 1698-1701 (2003).</li><li>Pietron, J. J., Stroud, R. M., Rolison, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+three+dimensions+in+catalytic+mesoporous+nanoarchitectures.">Using three dimensions in catalytic mesoporous nanoarchitectures.</a> Nano Lett. 2 (5), 545-549 (2002).</li><li>Anderson, M. L., Morris, C. A., Stroud, R. M., Merzbacher, C. I., Rolison, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colloidal+gold+aerogels:+Preparation,+properties,+and+characterization.">Colloidal gold aerogels: Preparation, properties, and characterization.</a> Langmuir. 15 (3), 674-681 (1999).</li><li>Anderson, M. L., Stroud, R. M., Rolison, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+activity+of+fuel-cell+reactions+by+designing+three-dimensional+nanostructured+architectures:+Catalyst-modified+carbon-silica+composite+aerogels.">Enhancing the activity of fuel-cell reactions by designing three-dimensional nanostructured architectures: Catalyst-modified carbon-silica composite aerogels.</a> Nano Lett. 3 (9), 1321 (2003).</li><li>Chervin, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+by+design:+vanadium-substituted+iron+oxide+nanoarchitectures+as+cation-insertion+hosts+for+electrochemical+charge+storage.">Defective by design: vanadium-substituted iron oxide nanoarchitectures as cation-insertion hosts for electrochemical charge storage.</a> J. Mater. Chem. A. 3 (22), 12059-12068 (2015).</li><li>Ellerby, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+proteins+in+transparent+porous+silicate-glasses+prepared+by+the+sol-gel+method.">Encapsulation of proteins in transparent porous silicate-glasses prepared by the sol-gel method.</a> Science. 255 (5048), 1113-1115 (1992).</li><li>Massari, A. M., Finkelstein, I. J., Fayer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+proteins+encapsulated+in+silica+sol-gel+glasses+studied+with+IR+vibrational+echo+spectroscopy.">Dynamics of proteins encapsulated in silica sol-gel glasses studied with IR vibrational echo spectroscopy.</a> J. Am. Chem. Soc. 128 (12), 3990-3997 (2006).</li><li>Ray, A., Feng, M., Tachikawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+electrochemistry+and+Raman+spectroscopy+of+sol-gel-encapsulated+myoglobin.">Direct electrochemistry and Raman spectroscopy of sol-gel-encapsulated myoglobin.</a> Langmuir. 21 (16), 7456-7460 (2005).</li><li>Blyth, D. J., Aylott, J. W., Richardson, D. J., Russell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sol-gel+encapsulation+of+metalloproteins+for+the+development+of+optical+biosensors+for+nitrogen-monoxide+and+carbon-monoxide.">Sol-gel encapsulation of metalloproteins for the development of optical biosensors for nitrogen-monoxide and carbon-monoxide.</a> Analyst. 120 (11), 2725-2730 (1995).</li><li>Lan, E. H., Dave, B. C., Fukuto, J. M., Dunn, B., Zink, J. I., Valentine, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+sol-gel+encapsulated+heme+proteins+with+chemical+sensing+properties.">Synthesis of sol-gel encapsulated heme proteins with chemical sensing properties.</a> J. Mater. Chem. 9 (1), 45-53 (1999).</li><li>Miller, J. M., Dunn, B., Valentine, J. S., Zink, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+conditions+for+encapsulating+cytochrome+c.+and+catalase+in+SiO2+sol-gel+materials.">Synthesis conditions for encapsulating cytochrome c. and catalase in SiO2 sol-gel materials.</a> J. Non-Cryst. Solids. 202 (3), 279-289 (1996).</li><li>Ronda, L., Bruno, S., Faggiano, S., Bettati, S., Mozzarelli, A., Poole, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+binding+to+heme+proteins+in+solution,+encapsulated+in+silica+gels,+and+in+the+crystalline+state.">Oxygen binding to heme proteins in solution, encapsulated in silica gels, and in the crystalline state.</a> Methods in Enzymology. 437, 311-328 (2008).</li><li>Margoliash, E., Frohwirt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrum+of+Horse-Heart+Cytochrome+c.">Spectrum of Horse-Heart Cytochrome c.</a> Biochem. J. 71 (3), 570-572 (1959).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Como descrito, este procedimento produziu consistentemente cit viável. C encapsulado dentro aerogels. A concentração de cit. C dentro dos aerogeles podem ser variou de 5 a 15 ^ M e a concentração da solução tampão c inicial cit. Encapsulado dentro dos aerogeles podem ser variadas entre 4,4 e 70 mM de fosfato sem graves efeitos prejudiciais na viabilidade proteína. No entanto, o centro de pico e largura do pico do cit característica. C Soret pico em aerogéis são mais próximo do que eles são para cit. C na solução quando cit. C é encapsulado em aerogéis de soluções de 40 mM tampão 9. A síntese do cit. C -SiO 2 aerogéis é afectada pela idade de alguns dos reagentes de partida. Metanol, tetrametoxissilano, e solução de hidróxido de amónio são higroscópicos e deve ser substituído cada mês de um-para-dois. O aumento da água que se acumula noestes reagentes ao longo do tempo afecta as características estruturais de gel e o tempo de transição sol-a-gel. Ao realizar a secagem supercrítica, barco transferência do aparelho de secagem ponto crítico do pode conter até dezoito 0,5 cm de espessura, 1 géis cm de diâmetro. Conforme descrito na seção de protocolo, um enchimento específica e procedimento de drenagem deve ser seguido para transferir dióxido de carbono em processo sol-gel. É importante notar que, no início do protocolo de drenagem, a mistura a drenagem do dióxido de carbono e acetona flui a uma taxa tão elevada que o tubo de drenagem congela rígida com a humidade de condensação de gelo no lado de fora. A mistura contém a drenagem para fora um pouco de água uma vez que a acetona não é anidro e esta água pode, ocasionalmente, congelar a um ponto em que o tubo de drenagem, na verdade, bloqueia. É necessário prestar atenção para essas obstruções e para ouvir uma interrupção do fluxo. A válvula de drenagem devem ser fechados por alguns minutos de forma a obstrução vai derreter se uma obstrução for detectado. Dentroo pior cenário, se a válvula de drenagem não está fechada, uma obstrução pode causar tanta pressão para construir que o tubo de drenagem com força aparece fora do aparelho. Após os primeiros períodos de drenagem, a maior parte da acetona terá sido lavado para fora do aparelho, e a ocorrência de pedaços de gelo molhado irá diminuir dramaticamente. A descarga será semelhante progressivamente gelo seco como o protocolo de drenagem continua com qualquer evidência residual da presença de acetona (como perfume) tornando-se indetectável no final do processo de drenagem. Depois de o dióxido de carbono no aparelho tem a transição do estado líquido para o fluido supercrítico e o processo de ventilação tiver começado, é necessário para libertar o fluido a uma taxa lenta durante pelo menos 45 min, tal como indicado no processo 9. Um aumento da taxa de libertação pode diminuir a viabilidade de cit. C (como mostrado na Figura 9) dentro dos aerogéis e os aerogéis podem-se realmente se separam como the fluido corre para escapar dos géis. Em geral, mesmo quando os aerogéis permanecer intacto depois de abrir a porta do aparelho, é importante para segurá-los cuidadosamente e suavemente como eles são quebradiços e podem romper facilmente. Os géis de controlo de sílica que se precipitam ao lado do citocromo c. -SiO 2 géis são utilizados após secagem super-critica para determinar se a transferência de dióxido de carbono nos géis foi bem-sucedida. Por vezes, a cit. C -SiO 2 géis podem aparecer turva e é importante para determinar se este é devido à transferência incompleta solvente ou se pode ter a ver com a concentração de a cit. C ou tampão encapsulado dentro dos geles. Se os géis de sílica, sem cit. C parecem ter uma aparência homogénea e translúcida todo, esta pode ser tomada como evidência de que a transferência de solvente ocorrido completamente, mesmo se o cit. C -SiO 2 géis têm alguma turvação a eles. Turvação nos geles de sílicasem cit. C, após secagem indica que um pouco de acetona permaneceu dentro dos geles durante a ventilação. Como indicado na seção de protocolo, as precauções de segurança importantes precisam ser tomadas quando se trabalha com o óxido nítrico (NO). Para detectar NÃO usando os aerogeles, é necessário vedar a cuvete muito bem e para descarregar o gás que flui ao longo dos aerogéis num exaustor de fumos. Em alternativa, todo o espectrofotómetro pode ser movido para um exaustor de fumos, juntamente com o cilindro de gás de NO como precaução adicional para limitar a exposição ao gás de. Em contato com o ar NO irá imediatamente produzir o dióxido de azoto, tetróxido de nitrogênio altamente venenosas ou ambos. NO também pode reagir com água para produzir calor e corrosivos fumos. Portanto, a exposição sustentada para o NO pode resultar em toxicidade direta dos tecidos. Quando se utiliza o cit. C -SiO 2 aerogéis para detectar a presença do óxido nítrico, a banda Soret será inicialmente em ~ 408 nm e vai deslocara ~ 414 nm na presença de óxido nítrico. Depois de voltar para azoto, a banda Soret deve reverter de volta a estar centrado em ~ 408 nm. Pode também ser possível usar o cit. C -SiO 2 aerogéis para detectar a presença de outros ligandos, tais como o monóxido de carbono 27. Diferentes processos publicados incluir um passo adicional de combinação de nanopartículas de ouro ou prata com cit. C em solução antes de se misturar com o Sol e super-criticamente a secagem para formar aerogeles 4-8. Comparando-se a espectroscopia de UV-visível de cit. C encapsulado em aerogeles com nanopartículas metálicas para que de cit. C encapsulado em aerogéis sem nanopartículas metálicas mostra que estes dois tipos de técnicas de encapsulação produzir cit. C de viabilidade semelhante dentro dos aerogéis (Figura 5) . No entanto, o cit. C encapsulado com nanopartículas metálicas é um pouco mais estável do que cit. C encapsulard sem nanopartículas metálicas dentro dos aerogéis 9. Os espectros de CD de ambos os tipos de citocromo c. Aerogéis também são semelhantes, embora ambos diferem do espectro de cit. C em tampão indicando algum desdobramento de cit. C dentro dos aerogéis (Figura 7). Os anteriores relatórios sobre cit. C encapsulados em aerogéis sugerem que a espectroscopia de dicroísmo circular é mais provável avaliar a camada mais externa da proteína, desdobrado em contacto com o gel de sílica, dentro de um ou outro metal cit várias camadas nanopartícula-nucleada. Estruturas c ou estruturas fracamente organizadas que formam quando não nanopartículas metálicas estão presentes em aerogéis de 4,9. A maioria do cit. C dentro de um ou outro tipo de estrutura de auto-organizados dentro dos aerogéis permanece dobrado, tal como medido por espectroscopia de UV-visível, embora. A vantagem do protocolo descrito aqui sans nanopartículas é que compra cara ou síntese demorado de metaisnanopartículas não é necessário. As proteínas não têm sido encapsulados com sucesso dentro de aerogeles, e de modo que este procedimento é importante na medida em que podem levar ao desenvolvimento de um método para a encapsulação de mais geral outras proteínas com significância no aerogéis potencial para futuros dispositivos bioanaliticas.

Citocromo C (cyt. C) é uma proteína de transferência de electrões chave envolvida em reacções de respiração celular do organismo. Tem sido demonstrado estar envolvida na apoptose, uma forma controlada de morte celular, e ele pode detectar pequenas moléculas tais como tóxicos de óxido nítrico e de monóxido de carbono 1-3. O óxido nítrico (NO) desempenha um papel numa variedade de processos fisiológicos que ocorrem nos sistemas nervosos, cardiovasculares e imunes. Enquanto cit. C normalmente requer um ambiente aquoso tamponado a valores de pH neutro para permanecer estruturalmente intacta e ativa, a pesquisa mostrou que cit. C pode manter a sua estrutura e função em materiais sólidos conhecidos como aerogels sob certas condições 4-9. Os aerogéis são materiais altamente porosos, muitas vezes formadas por óxidos metálicos sintetizar sol-gel (Enquanto os aerogéis de óxido de metal são muito comuns, o carbono e outros tipos de aerogel foram sintetizados. Um exemplo é InP aerogels) 10 e a secagem destas sol-gel, de tal forma que a matriz sólida porosa é deixado inalterado 11-14. Todos os poros aerogels sólidos resultar em muito aerogels disponíveis área de superfície tornando extremamente útil para todas as aplicações onde as reações de superfície são importantes. Quando química ou bioquímica funcionalidade é montado dentro do nanoarquitetura aerogel, demonstrou-se que a porosidade e área de superfície física melhorada dos aerogeles ajudar a melhorar sensores, bem como eléctrodos para baterias, células de combustível, e aplicações supercapacitores 11,15-23 . A fim de secar aerogéis de um modo que deixa a matriz sólida porosa inalterada, é típico para remover o solvente que permanece nos poros após a síntese de sol-gel através de extracção com solvente supercrítico. Qualquer colapso de poros que pode ser causado por forças de tensão superficial como um solvente se evapora a partir do gel são minimizadas por causa de secagem supercrítica, uma interface líquido-vapor nunca formas. c sendo encapsulada em sol-gel que foram mantidos molhados ou que foram secas ambientalmente 24-30. Relatórios de encapsular biomoléculas em sol-geles que são depois secos super-criticamente para formar aerogeles são mais raros devido ao processamento necessário que pode ser prejudicial para a estrutura de muitas proteínas. No caso de cit. C, certas condições tornam possível manter a capacidade de cit. C para detectar e responder a óxido nítrico na fase gasosa dentro de aerogéis. Uma vez estabilizado, no aerogel, a estrutura de poros de elevada qualidade do aerogel facilita a reacção entre cit. C 4,8,9 e óxido nítrico. Cit. C pode ser encapsulado dentro de aerogeles pela primeira associando-o em várias camadas à volta de nanopartículas de prata ou de ouro na solução de 4-8. Estes superestruturas de várias camadas servem para proteger a proteína na matriz de aerogel. No Approac mais recenteh que nós desenvolvemos, quando a concentração de proteína e tampão de força são controlados juntamente com outras condições sintéticas, cit. c mantém integridade dentro dos aerogéis mesmo sem metal de nanopartículas associação inicial 9. A síntese começa como muitas sínteses de aerogel começar pela mistura de precursores de sílica sol-gel por um determinado período de tempo. É depois de um tempo definido que cit. C é adicionado como uma solução tamponada na mistura de mistura. A gelificação ocorre, em seguida, de modo a formar uma estrutura de sílica sólido poroso em que os poros são cheios com água, metanol, restantes reagentes e subprodutos. Este líquido que preenche os poros podem ser enxaguadas com vários solventes através de uma série de intercâmbios de solventes, as últimas trocas com dióxido de carbono líquido que ocorre dentro de um aparelho de ponto crítico de secagem mantidos a baixa temperatura. Unindo os géis acima da temperatura crítica (31,1 ° C) do dióxido de carbono facilita a formação de quantoupercritical fluido pressurizado no interior do aparelho que pode ser ventilado de modo a formar, aerogéis altamente porosos secos. A temperatura relativamente baixa requerida para o dióxido de carbono para formar um fluido supercrítico é vantajosa em relação a outros solventes, pois mantém a proteína abaixo de uma temperatura à qual pode desnaturar. A nossa abordagem livre de nanopartículas de metal para encapsular cit. C em aerogéis é vantajoso, porque é um processo simples que pode levar ao desenvolvimento de um protocolo mais geralmente aplicável para a encapsulação de outras proteínas bem. Muitas proteínas podem não interagir com nanopartículas de metal, da mesma forma que CYT. C faz a síntese de metal e de nanopartículas ou compra acrescenta tempo e custos adicionais ao processo. Os poucos relatos sobre encapsular proteínas em aerogéis de tornar o desenvolvimento deste processo um passo significativo para a frente para encontrar um procedimento mais geral para encapsular outras proteínas no aerogels que podem ajudar in potenciais futuros dispositivos bioanalíticos. A seção de protocolo deste manuscrito descreve como sintetizar sol de sílica-gel, encapsular cit. C para estas sol-gel, secar estas sol-gel compostas para formar aerogeles, caracterizar estas bioaerogels usando espectroscopia UV-visível e circular dicroísmo e detectar a presença de óxido nítrico na fase gasosa com estes bioaerogels. Cit. C foi encapsulada com sucesso em aerogéis quando primeiro dissolvido em 4,4 a 70 mM de soluções aquosas de tampão de fosfato. No entanto, a estrutura da proteína optimizado em aerogéis foi encontrada para resultar quando da encapsulação de 40 mM de fosfato de soluções tamponadas de cit. Cit c produzindo aerogel carregado. C concentrações na gama de 5 a 15 ^ M 9. Portanto, o protocolo é dada a seguir para sintetizar os aerogéis utilizando soluções tamponadas de fosfato 40 mM de cit. C, resultando numa cit carregado. Concentração c nos aerogéis de 15 uM. &lt;/ P&gt;

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="661">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Potassium phosphate, monobasic</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P285-500</td>
			<td style="width:167px;">Certified ACS (also possible to use sodium phosphate monobasic)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:249px;">Potassium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P288-500</td>
			<td>Certified ACS (also possible to use sodium phosphate dibasic)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Water</td>
			<td style="width:127px;">Millipore Direct-Q</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>18 M&#937; cm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:249px;">pH meter and electrode</td>
			<td style="width:127px;">Denver Instrument</td>
			<td style="width:119px;">UB-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:249px;">Cytochrome c from equine heart</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>C7752-100MG&#160;</td>
			<td>&#8805;95% based on Mol. Wt. 12,384, used as received and stored at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Glass scintillation vials</td>
			<td style="width:127px;">Wheaton</td>
			<td>03-341-25J</td>
			<td>20 mL, O.D. x height (with cap):&#160; 28 mm x 61 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Disposable cuvette</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-126</td>
			<td>methacrylate, 10 mm x 10 mm x 45 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:249px;">Ultraviolet Visible Spectrophotometer</td>
			<td style="width:127px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:119px;">UV-1800</td>
			<td>Uses UVProbe v 2.33 software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:249px;">Circular dichroism spectrometer (or spectropolarimeter)</td>
			<td style="width:127px;">JASCO</td>
			<td style="width:119px;">J-810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Isotemp Laboratory Refrigerator</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Polypropylene disposable beakers</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">01-291-10</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:249px;">Tetramethylorthosilicate (also known as tetramethoxysilane, TMOS)</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">218472-500G</td>
			<td>98% purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Methanol</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A457-4</td>
			<td>GC Resolv grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Ammonium hydroxide solution</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">221228-25ML-A</td>
			<td>ACS reagent, 28.0-30.0%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:249px;">General purpose polypropylene scintillation vials</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z376825-1PAK</td>
			<td>16 mm x 57 mm, volume size 6.5 mL, slice off bottom with sharp knife or razor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">generic plastic wrap</td>
			<td style="width:127px;">various</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Parafilm M laboratory wrapping film</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S37440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Plastic syringe plunger</td>
			<td style="width:127px;">various</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>use syringe plunger from 3 mL syringe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Ethyl alcohol</td>
			<td style="width:127px;">Acros</td>
			<td style="width:119px;">61509-0040</td>
			<td>Absolute, 200 proof, 99.5% A.C.S. reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Acetone</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A949-4</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:249px;">Critical point drying apparatus</td>
			<td style="width:127px;">Quorum Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>E3000 Series</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Circulator</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Isotemp 3016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Carbon dioxide cylinder</td>
			<td style="width:127px;">Tech Air</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>siphon tube</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:249px;">Micrometer</td>
			<td style="width:127px;">Central Tool Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:249px;">GRAMS/AI 8.0 software</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Electron Corporation</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Nitrogen cylinder</td>
			<td style="width:127px;">Tech Air</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Another inert gas could be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:249px;">10% nitric oxide/90% nitrogen cylinder</td>
			<td style="width:127px;">Airgas</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Tygon tubing</td>
			<td style="width:127px;">various</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">T-switch valve</td>
			<td style="width:127px;">various</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">syringe needles</td>
			<td style="width:127px;">various</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

encapsulating cytochrome c in silica aerogel nanoarchitectures without metal nanoparticles while retaining gas-phase bioactivity

As aplicações, tais como sensores, baterias e pilhas de combustível foram melhoradas através da utilização de aerogeles altamente porosos compostos funcionais quando são encapsulados dentro dos aerogeles. No entanto, poucos relatos sobre encapsular proteínas dentro de sol-gel que são processados ​​para formar aerogéis de existir. Um processo para a encapsulação de citocromo C (cyt. C) em sílica (SiO2) de sol-geles que são super-criticamente processados ​​para formar bioaerogels com actividade de fase gasosa para o óxido nítrico (NO) é apresentada. Cit. C é adicionado a uma solução coloidal de sílica misturado sob a concentração de proteína e tampão controlada condições de resistência. A mistura é, então, gelificada Sol e o líquido de enchimento dos poros do gel é substituído por uma série de intercâmbios de solventes com dióxido de carbono líquido. O dióxido de carbono é levado ao seu ponto crítico e ventilado fora para formar aerogels secos com cit. C encapsulado dentro. Estes bioaerogels são caracterizados com uma espectroscopia de UV-visíveld espectroscopia de dicroísmo circular e pode ser usado para detectar a presença de óxido nítrico na fase gasosa. O sucesso deste procedimento depende da regulação da concentração de C cit. E a concentração de tampão e não necessita de outros componentes, tais como as nanopartículas metálicas. Pode ser possível encapsular outras proteínas utilizando uma abordagem semelhante tornando este procedimento importante para o futuro desenvolvimento potencial dispositivo bioanalítico.

O procedimento descrito em resultados aerogeles que contêm cit viável. C. Conforme especificado no fim da introdução, cit. C podem ser encapsuladas a partir de soluções aquosas tampão que variam de 4,4 a 70 mM de fosfato. Exemplos de cit. -silica C (cyt. C -SiO 2) aerogéis feita a partir de soluções contendo diferentes concentrações de tampão são mostrados na Figura 4. Todos os géis são relativamente translúcido, com os géis produzidos a partir de 70 mM de tampão mais opaca. Uma comparação da espectroscopia de cit. C sob condições diferentes é mostrada na Figura 5. Um espectro típico (Figura 5c) mostra o pico grande Soret cerca de 408 nm para cit. C -SiO 2 aerogéis e é muito semelhante ao do espectro de cit . C em solução (Figura 5a). Além disso, um espectro de cit.c encapsulado dentro de aerogeles com nanopartículas metálicas também é mostrado (Figura 5b) e a cit. C espectro -SiO 2 aerogel é semelhante a este espectro também. Quando o cit. C -SiO 2 aerogel é exposta ao óxido nítrico, um deslocamento de pico típico do Soret é observado (Figura 5D). Os espectros de UV-vis para géis feitos a partir de cit. C soluções em concentrações de tampão de variação são mostrados na Figura 6. Todos estes géis mostram característica espectroscópica de UV-visível, indicando que apresenta cit. C não se encontra num estado desnaturado dentro dos geles. Contudo, a translucidez diminuição dos géis feitos a partir de 70 mM de tampão resultados numa proporção inferior de sinal-para-ruído para estes espectros. Os espectros de CD de cit. C -SiO 2 aerogéis são semelhantes aos espectros de cit. C </em&gt; encapsulado dentro de aerogeles com nanopartículas de metal, enquanto que ambos os tipos de espectros de aerogel diferem de um espectro de cit. C em solução tamponada (Figura 7). A Figura 8 mostra uma resposta de monitorização de óxido nítrico típico para cit. C -SiO 2 aerogéis e aerogeles correspondentes que também contêm nanopartículas metálicas para além cit. C. A diferença entre a absorvância a 414 nm e em 408 nm que é visto para aumentar e, em seguida, diminuem quando os geles são expostos ao óxido nítrico e, em seguida, de azoto, respectivamente, em sucessão. Se o dióxido de carbono supercrítico não é libertado a uma taxa lenta o suficiente, a viabilidade do cit. C dentro dos aerogéis formados será comprometida. Isto é revelado, comparando os espectros de UV-visível resultante após a formação de geles, libertando o dióxido de carbono a diferentestaxas (Figura 9). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53802/53802fig1.jpg" /> Figura 1: aparelho de ponto crítico de secagem O aparelho de ponto crítico de secagem mostrado a partir da (A) da frente e (B) de volta com a porta do barco e aparelho de transferência mostrado ao lado da parte de trás do aparelho.. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53802/53802fig2.jpg" /> Figura 2: plataforma de papelão A plataforma de papelão montado para a realização de um aerogel no caminho do feixe de um instrumento.. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53802/53802fig3.jpg" /> Figura 3: nítrico detecção óxido de set-up O nítrico detecção óxido de set-up é mostrado incluindo (A) a coifa fechada óxido nítrico 10%., 90% cilindro de azoto, tubos, e T-válvula, e (B) a cuvete com agulhas inseridas. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53802/53802fig4.jpg" /> Figura 4:.. Cit amostra C -SiO 2 aerogéis aerogéis encapsular 15 uM cit c em 4,4 mM, 40 mM, e tampão de fosfato de potássio 70 mM são mostradas em comparação com uma moeda da esquerda para a direita.. Estes aerogeles são de aproximadamente 0,2-0,5 cm de altura. Reproduzido com permissão 9. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53802/53802fig5.jpg" /> Figura 5:. Cit c -SiO 2 aerogel espectros espectroscopia visível de 15 uM de citocromo c em (a), 50 mM de tampão de fosfato de solenóide.ution; (B) Au (5 nm) ~ cit c -SiO 2 aerogel.; (C) cit c -SiO 2 aerogel (exposta ao ar).; (D) cit. C -SiO 2 aerogel (exposto a óxido nítrico durante 3,5 min). Estes espectros representativas de cada tipo de gel são compensados ​​por razões de clareza, e a linha a tracejado indica a posição do pico Soret de cit. C em tampão. Enquanto cada espectro é de 15 uM cit. C, a espessura do gel (ou alturas) são apenas 0,2-0,5 cm comparação com a solução de 1 cm cuvete resultando em uma maior absorvência solução. Reproduzido com permissão 9. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53802/53802fig6.jpg" /> Figura 6: espectroscopia de aerogel como concentração do tampão encapsulado é variada Média de UV-visível absorvância espectral de aerogeles, dividido pelo comprimento do caminho de gel para géis encapsulando 15 _.6; M cit c em 70 mM (preto) (média de 4 espectros), 40 mM (vermelho, pontilhada) (média de 8 espectros), e 4,4 mM (verde, pontilhada) (média de 9 espectros) tampão fosfato de potássio. . Reproduzido com permissão 9. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53802/53802fig7.jpg" /> Figura 7:... O aerogel espectroscopia de dicroísmo circular espectros de dicroismo circular de citocromo C em solução tamponada com fosfato de sódio (sólido), ambos os espectros representativos da cit c -SiO 2 aerogéis (a tracejado), e dois espectros representante de Au (5 nm) ~ cit. c SiO- 2 aerogels (pontilhadas). Reproduzido com permissão 9. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/53802/53802fig8.jpg" /> Figura 8: Detecção de óxido nítrico com cit c -SiO 2. </. sub&gt; aerogéis de Acompanhamento do turno (Aa = A 414 nm - A 408 nm). na intensidade Soret de cit c (vermelho sólido) e Au ~ cit c (azul tracejada) encapsulado em SiO nanoarquiteturas aerogel 2 compósitos como o fluxo de gás. é alternado entre azoto (onde Soret pico máximo é em ~ 408 nm) e óxido nítrico (onde Soret pico máximo é em ~ 414 nm). Cada curva é uma média de 3-4 ensaios, com dois do cit c -SiO 2 ensaios monitorados pelo Aa = A 414 nm -. A 407 nm desde o pico máximo inicial Soret estava em 407 nm para estes ensaios. Reproduzido com permissão 9. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/53802/53802fig9.jpg" /> Figura 9:. Efeito do tempo de liberação de fluido supercrítico Média de absorção espectral UV-visível dividido pelo comprimento do caminho gel para cit c -SiO 2 aerogels enca.psulating 10 uM cit. C em 50 mM de tampão de fosfato em que os aerogéis super-criticamente secos foram feitas por qualquer libertação de dióxido de carbono supercrítico ao longo de 45 min (sólido, preto (média de 9 espectros)) ou 7 min (tracejado, vermelho (média de quatro Os espectros)). Reproduzido com permissão 9.

Watch this Scientific Journal Video about Encapsulating Cytochrome c in Silica Aerogel Nanoarchitectures without Metal Nanoparticles while Retaining Gas-phase Bioactivity at JoVE.com

Encapsulating Cytochrome c in Silica Aerogel Nanoarchitectures without Metal Nanoparticles while Retaining Gas-phase Bioactivity

encapsulando citocromo<em&gt; C</em&gt; Em Silica Aerogel nanoarquiteturas sem metal nanopartículas, mantendo bioatividade em fase gasosa

Este procedimento descreve como encapsular citocromo C (cyt. C) em sílica (SiO2) de sol-gel, processos esses géis para formar bioaerogels, e utilizar estes bioaerogels reconhecer rapidamente óxido nítrico (NO) por meio de uma reacção em fase gasosa. Este tipo de protocolo pode ajudar no futuro desenvolvimento de biossensores ou outros dispositivos bioanalíticos.

Applications such as sensors, batteries, and fuel cells have been improved through the use of highly porous aerogels when functional compounds are ...

encapsulating-cytochrome-c-silica-aerogel-nanoarchitectures-without

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Encapsulating Cytochrome c in Silica Aerogel Nanoarchitectures without Metal Nanoparticles while Retaining Gas-phase Bioactivity

10.3K visualizações.  Fairfield University.  Este procedimento descreve como encapsular citocromo C (cyt. C) em sílica (SiO2) de sol-gel, processos esses géis para formar bioaerogels, e utilizar estes bioaerogels reconhecer rapidamente óxido nítrico (NO) por meio de uma reacção em fase gasosa. Este tipo de protocolo pode ajudar no futuro desenvolvimento de biossensores ou outros dispositivos bioanalíticos. 

Vídeo: Encapsulating Cytochrome c in Silica Aerogel Nanoarchitectures without Metal Nanoparticles while Retaining Gas-phase Bioactivity

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion fluxes at the cellular level are required for initiating action potentials in excitable cells.2 Sodium regulation plays an important role in both of these cases; however, no method currently exists for continuously monitoring sodium levels in vivo 3 and intracellular sodium probes 4 do not provide similar detailed results as calcium probes. In an effort to fill both of these voids, fluorescent nanosensors have been developed that can monitor sodium concentrations in vitro and in vivo.5,6 These sensors are based on ion-selective optode technology and consist of plasticized polymeric particles in which sodium specific recognition elements, pH-sensitive fluorophores, and additives are embedded.7-9 Mechanistically, the sodium recognition element extracts sodium into the sensor. 10 This extraction causes the pH-sensitive fluorophore to release a hydrogen ion to maintain charge neutrality within the sensor which causes a change in fluorescence. The sodium sensors are reversible and selective for sodium over potassium even at high intracellular concentrations.6 They are approximately 120 nm in diameter and are coated with polyethylene glycol to impart biocompatibility. Using microinjection techniques, the sensors can be delivered into the cytoplasm of cells where they have been shown to monitor the temporal and spatial sodium dynamics of beating cardiac myocytes.11 Additionally, they have also tracked real-time changes in sodium concentrations in vivo when injected subcutaneously into mice.3 Herein, we explain in detail and demonstrate the methodology for fabricating fluorescent sodium nanosensors and briefly demonstrate the biological applications our lab uses the nanosensors for: the microinjection of the sensors into cells; and the subcutaneous injection of the sensors into mice.

Fluorescent nanoparticles produced in our lab are used for imaging ion concentrations and ion fluxes in biological systems such as cells during signaling and interstitial fluid during physiological homeostasis.

Nanopartículas fluorescentes para a medição da concentração de íons em Sistemas Biológicos

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Bioengenharia

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale (nanoparticles). Nanoparticles can be engineered in a precise fashion where their size, composition and surface chemistry can be carefully controlled. This enables unprecedented freedom to modify some of the fundamental properties of their cargo, such as solubility, diffusivity, biodistribution, release characteristics and immunogenicity. Since their inception, nanoparticles have been utilized in many areas of science and medicine, including drug delivery, imaging, and cell biology1-4. However, it has not been fully utilized outside of "nanotechnology laboratories" due to perceived technical barrier. In this article, we describe a simple method to synthesize a polymer based nanoparticle platform that has a wide range of potential applications. 
The first step is to synthesize a diblock co-polymer that has both a hydrophobic domain and hydrophilic domain. Using PLGA and PEG as model polymers, we described a conjugation reaction using EDC/NHS chemistry5 (Fig 1). We also discuss the polymer purification process. The synthesized diblock co-polymer can self-assemble into nanoparticles in the nanoprecipitation process through hydrophobic-hydrophilic interactions.
The described polymer nanoparticle is very versatile. The hydrophobic core of the nanoparticle can be utilized to carry poorly soluble drugs for drug delivery experiments6. Furthermore, the nanoparticles can overcome the problem of toxic solvents for poorly soluble molecular biology reagents, such as wortmannin, which requires a solvent like DMSO. However, DMSO can be toxic to cells and interfere with the experiment. These poorly soluble drugs and reagents can be effectively delivered using polymer nanoparticles with minimal toxicity. Polymer nanoparticles can also be loaded with fluorescent dye and utilized for intracellular trafficking studies. Lastly, these polymer nanoparticles can be conjugated to targeting ligands through surface PEG. Such targeted nanoparticles can be utilized to label specific epitopes on or in cells7-10.

This article describes a nanoprecipitation method to synthesize polymer-based nanoparticles using diblock co-polymers. We will discuss the synthesis of diblock co-polymers, the nanoprecipitation technique, and potential applications.

Formulação de nanopartículas poliméricas através da técnica de dibloco Nanoprecipitation

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

A Protocol for Detecting and Scavenging Gas-phase Free Radicals in Mainstream Cigarette Smoke

Cigarette smoking is associated with human cancers. It has been reported that most of the lung cancer deaths are caused by cigarette smoking 5,6,7,12. Although tobacco tars and related products in the particle phase of cigarette smoke are major causes of carcinogenic and mutagenic related diseases, cigarette smoke contains significant amounts of free radicals that are also considered as an important group of carcinogens9,10. Free radicals attack cell constituents by damaging protein structure, lipids and DNA sequences and increase the risks of developing various types of cancers. Inhaled radicals produce adducts that contribute to many of the negative health effects of tobacco smoke in the lung3. Studies have been conducted to reduce free radicals in cigarette smoke to decrease risks of the smoking-induced damage. It has been reported that haemoglobin and heme-containing compounds could partially scavenge nitric oxide, reactive oxidants and carcinogenic volatile nitrosocompounds of cigarette smoke4. A 'bio-filter' consisted of haemoglobin and activated carbon was used to scavenge the free radicals and to remove up to 90% of the free radicals from cigarette smoke14. However, due to the cost-ineffectiveness, it has not been successfully commercialized. Another study showed good scavenging efficiency of shikonin, a component of Chinese herbal medicine8. In the present study, we report a protocol for introducing common natural antioxidant extracts into the cigarette filter for scavenging gas phase free radicals in cigarette smoke and measurement of the scavenge effect on gas phase free radicals in mainstream cigarette smoke (MCS) using spin-trapping Electron Spin Resonance (ESR) Spectroscopy1,2,14. We showed high scavenging capacity of lycopene and grape seed extract which could point to their future application in cigarette filters. An important advantage of these prospective scavengers is that they can be obtained in large quantities from byproducts of tomato or wine industry respectively11,13

Spin-trapping ESR spectroscopy was used to study the effect of plant antioxidants lycopene, pycnogenol and grape seed extract on scavenging gas-phase free radicals in cigarette smoke.

Um Protocolo para Detecção e eliminação em fase gasosa radicais livres do fumo do cigarro Mainstream

Cigarette smoking is associated with human cancers. It has been reported that most of the lung cancer deaths are caused by cigarette smoking 5,6,7,12.  ...

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the monitoring of therapeutic efficiency.1-3 The circulating low molecular weight proteome (LMWP) composed of small proteins shed from tissues and cells or peptide fragments derived from the proteolytic degradation of larger proteins, has been associated with the pathological condition in patients and likely reflects the state of disease.4,5 Despite these potential clinical applications, the use of Mass Spectrometry (MS) to profile the LMWP from biological fluids has proven to be very challenging due to the large dynamic range of protein and peptide concentrations in serum.6 Without sample pre-treatment, some of the more highly abundant proteins obscure the detection of low-abundance species in serum/plasma. Current proteomic-based approaches, such as two-dimensional polyacrylamide gel-electrophoresis (2D-PAGE) and shotgun proteomics methods are labor-intensive, low throughput and offer limited suitability for clinical applications.7-9 Therefore, a more effective strategy is needed to isolate LMWP from blood and allow the high throughput screening of clinical samples. 
Here, we present a fast, efficient and reliable multi-fractionation system based on mesoporous silica chips to specifically target and enrich LMWP.10,11 Mesoporous silica (MPS) thin films with tunable features at the nanoscale were fabricated using the triblock copolymer template pathway. Using different polymer templates and polymer concentrations in the precursor solution, various pore size distributions, pore structures, connectivity and surface properties were determined and applied for selective recovery of low mass proteins. The selective parsing of the enriched peptides into different subclasses according to their physicochemical properties will enhance the efficiency of recovery and detection of low abundance species. In combination with mass spectrometry and statistic analysis, we demonstrated the correlation between the nanophase characteristics of the mesoporous silica thin films and the specificity and efficacy of low mass proteome harvesting. The results presented herein reveal the potential of the nanotechnology-based technology to provide a powerful alternative to conventional methods for LMWP harvesting from complex biological fluids. Because of the ability to tune the material properties, the capability for low-cost production, the simplicity and rapidity of sample collection, and the greatly reduced sample requirements for analysis, this novel nanotechnology will substantially impact the field of proteomic biomarker research and clinical proteomic assessment.

We developed a technology based on mesoporous silica thin film for the selective recovery of low molecular weight proteins and peptides from human serum. The physico-chemical properties of our mesoporous chips were finely tuned to provide substantial control in peptide enrichment and consequently profile the serum proteome for diagnostic purposes.

Enriquecimento protéico de baixo peso molecular em filmes finos de sílica mesoporosa para a descoberta de biomarcadores

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

Nanopartículas virais para<em&gt; Em vivo</em&gt; Imaging Tumor

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation nanoparticles (HNPs). The latter are a new family of probes recently introduced for labeling biological samples for multi-photon imaging. HNPs are capable of doubling the frequency of excitation light by the nonlinear optical process of second harmonic generation with no restriction on the excitation wavelength.
Multi-photon based methodologies for hESC differentiation into cardiac clusters (maintained as long term air-liquid cultures) are presented in detail. In particular, evidence on how to maximize the intense second harmonic (SH) emission of isolated HNPs during 3D monitoring of beating cardiac tissue in 3D is shown. The analysis of the resulting images to retrieve 3D displacement patterns is also detailed.

Protocol details are provided for in vitro labeling human embryonic stem cells with second harmonic generating nanoparticles. Methodologies for hESC investigation by multi-photon microscopy and their differentiation into cardiac clusters are also presented.

Harmonic Nanopartículas Regenerativa Research

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Identification of Metal Oxide Nanoparticles in Histological Samples by Enhanced Darkfield Microscopy and Hyperspectral Mapping

Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the identification, localization, and characterization of nanoscale materials in biological samples is on the rise. Currently available methods, such as electron microscopy, tend to be resource-intensive, making their use prohibitive for much of the research community. Enhanced darkfield microscopy complemented with a hyperspectral imaging system may provide a solution to this bottleneck by enabling rapid and less expensive characterization of nanoparticles in histological samples. This method allows for high-contrast nanoscale imaging as well as nanomaterial identification. For this technique, histological tissue samples are prepared as they would be for light-based microscopy. First, positive control samples are analyzed to generate the reference spectra that will enable the detection of a material of interest in the sample. Negative controls without the material of interest are also analyzed in order to improve specificity (reduce false positives). Samples can then be imaged and analyzed using methods and software for hyperspectral microscopy or matched against these reference spectra in order to provide maps of the location of materials of interest in a sample. The technique is particularly well-suited for materials with highly unique reflectance spectra, such as noble metals, but is also applicable to other materials, such as semi-metallic oxides. This technique provides information that is difficult to acquire from histological samples without the use of electron microscopy techniques, which may provide higher sensitivity and resolution, but are vastly more resource-intensive and time-consuming than light microscopy.

Enhanced darkfield microscopy and hyperspectral imaging with spectral mapping enable screening, localization, and identification of nanoscale materials in histological samples with improved speed and accuracy over traditional methods. The goal of this paper is to provide methods for darkfield imaging and hyperspectral mapping of metal oxide nanoparticles in histological samples.

Identificação dos Nanopartículas de óxido metálico em amostras histológicas por Aprimorado Mapeamento Darkfield Microscopy e Hyperspectral

Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

Correlativa luz e de Microscopia Eletrônica Usando Quantum Dot Nanopartículas

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

Produção de nanopartículas metálicas por ablação a laser pulsada em líquidos: uma ferramenta para estudar as propriedades antibacterianas das nanopartículas

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Protein Kinase C-delta Inhibitor Peptide Formulation using Gold Nanoparticles

Protein kinase C-delta inhibitor (PKC&#948;i) is a promising drug to prevent ischemia-reperfusion-induced organ injury. It is usually conjugated to a cell-penetrating peptide, TAT, for intracellular delivery. However, TAT has shown non-specific biological activities. Gold nanoparticles (GNPs) can be used as drug delivery carriers without recognized toxicity. Therefore, we have used a GNP/peptide hybrid to deliver PKC&#948;i. Two short peptides (P2: CAAAAE and P4: CAAAAW), at a 95:5 ratio, were used to modify the surface properties of GNP. GNPs conjugated with PKC&#948;i (GNP/PKCi) are stable in distilled water, 0.9% NaCl, and phosphate-buffered saline (PBS) containing bovine serum albumin or fetal bovine serum. Intravenous injection of GNP-PKCi was previously shown to prevent ischemia-reperfusion injury of the lung. This article outlines a protocol to formulate GNP/PKCi and assess the physiochemical properties of GNP/PKCi. We have used similar methods to formulate other peptide-based drugs with GNP. This article will hopefully draw more attention to this novel intracellular drug delivery technology and its applications in vivo.

We have previously used a gold nanoparticle peptide hybrid to intravenously deliver a synthetic peptide, protein kinase C-delta inhibitor, which reduced ischemia-reperfusion-induced acute lung injury. Here we show the detailed protocol of the drug formulation. Other intracellular peptides can be formulated similarly.

Proteína quinase C-delta inibidor do Peptide formulação utilizando nanopartículas de ouro

Protein kinase C-delta inhibitor (PKC&#948;i) is a promising drug to prevent ischemia-reperfusion-induced organ injury. It is usually conjugated to a ...