Name: high content screening analysis to evaluate the toxicological effects of harmful and potentially harmful constituents (hphc)
Uploaded: 2016-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
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Os autores gostariam de agradecer Karsta Luettich e Grégory Vuillaume para a sua revisão do manuscrito.

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Todos os autores são funcionários da Philip Morris International. Philip Morris International é a única fonte de financiamento e patrocinador deste projeto.

As necessidades de alternativas à experimentação animal e para novas abordagens de teste de alto rendimento têm sido amplamente discutido nos últimos anos. Isso levou os cientistas e autoridades reguladoras para investigar métodos alternativos para os testes de toxicidade padrão, utilizando ensaios celulares que imitam de perto a fisiologia dos tecidos-alvo. Neste estudo, demonstrámos a aplicabilidade da combinação de um analisador de células em tempo real (RTCA) com uma plataforma de alto teor de triagem (HCS) para avaliar o impacto da exposição aos componentes individuais CS em células epiteliais do pulmão humano. Esta configuração pode ser aplicada de forma análoga para avaliar a citotoxicidade induzida por vários outros poluentes transportados pelo ar, partículas transportadas pelo ar, e nanopartículas. Além disso, os resultados obtidos podem ser combinados com os de transcriptomics todo o genoma e métodos computacionais baseados em redes biológicas causais. Como relatado anteriormente, esta abordagem permitiu-nos para corroborar os dados sobre caminho molecularperturbação após exposição CS 5 com endpoints HCS, abordando estas perturbações via também fenotipicamente. Como um ensaio de fluxograma, análise de células em tempo real fornece informação relacionada com a viabilidade celular em uma resolução dose e tempo-dependente, que permite uma melhor tomada de decisão que a dose e ponto de tempo de exposição pode ser favorável para a análise a jusante 14. O princípio do analisador depende de alterações na impedância eléctrica produzida pelas células que atribuem e espalhada sobre uma superfície de cultura bem coberto com um microeléctrodo de ouro. A impedância é convertido num parâmetro adimensional denominada célula-índice, que pode ser usado para monitorar a adesão celular, espalhamento, morfologia e, finalmente, a viabilidade celular. Embora esta técnica não fornece informação sobre os mecanismos citotóxicos, a sua sensibilidade permite a detecção de mudanças morfológicas celulares, mesmo em doses muito baixas em que o HCS não é informativo (dados não mostrados). Com base na PREVIexperimentos ous, observamos que a metodologia RTCA é capaz de detectar alterações morfológicas em doses mais baixas em comparação com os endpoints HCS. Seguindo triagem inicial com o analisador de células em tempo real, uma plataforma HCS foi utilizado para obter informações mais detalhadas sobre o tipo de citotoxicidade provocada por cada HPHC. O painel de ensaio HCS permitido ao perfil HPHCs para seu potencial impacto sobre compartimentos celulares / organelas, bem como para identificar aqueles provocando genotoxicidade ou estresse oxidativo. A análise revelou perfis distintos em que as HPHCs selecionados induzem citotoxicidade nas células NHBE. Em geral, todos os compostos, excepto Fenol, foram encontrados para induzir a necrose nas doses testadas mais elevadas. Consistente com um potencial papel no desenvolvimento do cancro 1-aminonaphtalene fosforilação induzida de H2AX como um marcador para a genotoxicidade, no entanto, o painel HCS também descoberto actividade deste HPHC na leitura da toxicidade mitocondrial (massa aumentada e citocromo C releaSE) e estresse oxidativo (depleção de GSH). Da mesma forma, como anteriormente descrito, o fenol foi identificado para induzir disfunção mitocondrial, e causar danos no DNA, bem como o esgotamento de GSH. Crómio (VI), um dos compostos classificados como cancerígenos grupo I, e Crotonaldeído também foram ambos identificados como genotóxica, em particular, o cromo (VI) também induziu apoptose (caspase ativação em cascata) e Crotonaldeído causou aumento da geração de ROS. Finalmente arsênio (V), foi encontrada para induzir cJun fosforilação que é um marcador de activação da via cinase de stress. Neste estudo, utilizou-se células NHBE como um modelo para as células epiteliais do pulmão in vitro. Usando essas células em um ambiente HCS é sem precedentes e permitiu a investigação de uma gama mais ampla de endpoints, incluindo marcadores de genotoxicidade e estresse oxidativo. Ambos células vivas e abordagens de coloração de células fixadas foram descritos nos nossos protocolos, que demonstra a flexibilidade da técnica geral. na fato, os mesmos protocolos pode ser aplicado a uma ampla gama de alvos, que pode ser endereçado pela utilização de qualquer corante fluorescente ou um anticorpo. Para a execução com sucesso dos protocolos de coloração vivo, é importante respeitar o tempo de incubação, como alguns dos corantes têm uma meia-vida limitada e o sinal de fluorescência pode diminuir antes da aquisição de imagem está completado. É também importante ter em conta que, se um tipo de célula diferente é utilizado, todas as condições de coloração devem ser reavaliados, como a concentração de corante óptima e o tempo de incubação pode ser diferente. No presente trabalho, descrevemos um cenário em que apenas cinco compostos em que rastreados com a metodologia HCS. Considerando-se a disposição da placa anteriormente descrita, eles foram doseados mais de dois conjuntos diferentes de placas para um total de 24 placas (6 ensaios e 2-pontos de tempo) .O número de placas também pode ser aumentado, permitindo deste modo para o rastreio simultâneo de mais compostos ou os investigação de mais pontos de extremidade. Antes de o fazer, no entanto, deve-se tomar em consideração que certos pontos de extremidade (GSH e ROS) requerem aquisição imediata, e, como consequência, a dosagem das placas deve ser executada de forma escalonada para permitir a aquisição da placa anterior. Por outro lado, usando um protocolo de coloração de células fixadas representa uma vantagem que as placas podem ser empilhadas, interrompendo o protocolo em qualquer passo, após a fixação, para a conclusão do processo de coloração, numa fase posterior. Esta abordagem, por exemplo, que proporcionam ao operador o tempo para concluir todas as placas de coloração celular ao vivo, sem comprometer a qualidade dos dados. Para optimizar ainda mais o fluxo de trabalho através da diminuição do número de placas, seria também possível multiplexar ponto de extremidade mais juntos. Por exemplo, neste danos DNA contexto e estresse Kinase puderam ser investigadas em conjunto simplesmente usando anticorpo secundário dois com fluorocromos que emitem em diferentes channels. O desenvolvimento contínuo da plataforma HCS, incluindo a semeadura totalmente automatizado de células, diluição do composto, de dosagem e de coloração, assim como a adição de novos pontos de extremidade irá expandir ainda mais a capacidade da plataforma de HCS como uma ferramenta de perfil poderosa para HPHCs sobre epiteliais e outros tipos de células .

Avaliação do risco toxicológico tem historicamente se baseou na utilização de modelos animais que, embora fundamental nas ciências da vida, também estão ligados com deficiências tais como tradutibilidade inconsistentes para os seres humanos e de alto custo. Além disso, tem havido um esforço crescente para encontrar alternativas à experimentação animal no espírito de &quot;Os 3Rs&quot; 2 (substituição, redução e refinamento). Este esforço tem sido acelerado nos últimos anos, não só por causa dos avanços recentes, como técnicas de alto rendimento e abordagens de biologia de sistemas, mas também por causa da legislação que restringe o uso de testes em animais, especialmente na União Europeia. A complexidade das vias de sinalização celulares que regulam a resposta a insultos tóxicos torna evidente que o uso de parâmetros toxicológicos individuais não serão suficientes para descrever a base toxicológico de determinados compostos. Para isso, a interação de centenas de interagir proteins que contribuem para uma rede biológica também terão de ser tomadas em consideração. Para estudar o efeito de agentes tóxicos nessas redes, uma abordagem toxicologia sistema combinado com médio fenotípicas e ensaios de rastreio de alto rendimento é útil para inferir potências e, ao mesmo tempo, proporcionar mais informação sobre o mecanismo de acção de substâncias tóxicas individuais. Neste estudo, utilizou-HCS como uma ferramenta de rastreio poderoso, o qual é composto por um microscópio automatizado e uma aplicação de software biológico, que pode adquirir, processar e analisar os dados de imagem obtidos a partir de ensaios celulares com base em fluorescência específica. Isto permite alterações visuais dentro de uma célula a ser quantificado, a uma única célula ou nível subcelular, e muitos parâmetros a serem analisados ​​simultaneamente. 3 Por exemplo, o ADN quebras de cadeia dupla foram avaliados usando uma identificação à base de anticorpo da fosforilação da histona H2AX e espécies reactivas de oxigénio (ROS) foram quantificados utilizando uma célula-permsuperóxido eable corante sensível. Como as células epiteliais pulmonares representam a primeira barreira biológica contra tóxicos inalados, incluindo o fumo do cigarro, utilizamos células epiteliais brônquicas primárias como um modelo in vitro para traçar o perfil do efeito da HPHCs publicados pelos Estados Unidos Food and Drug Administration. 4 Este manuscrito é um follow -up em um estudo anterior 5 em que se avaliou o impacto biológico de um subconjunto diferente de HPHCs. Como parte do nosso fluxo de trabalho para avaliar a citotoxicidade in vitro, inicialmente avaliou as potências de uma seleção de 15 HPHC de, através de uma análise celular em tempo real baseado em impedância do sistema (RTCA) que nos permitiu estabelecer doses-ranges, adequados para HCS subsequente análise (Figura 1). A avaliação toxicológica HCS foi depois conduzida utilizando nove pontos de extremidade de multi-paramétricos de toxicidade celular, cada monitorizada em dois pontos de tempo (4 e 24 h). Os marcadores utilizados foram indicativos de toxicidade mitocondrial, danos no ADN, o stress quinase, espécies reactivas de oxigénio (ROS), o teor de glutationa (GSH), a caspase 3 - actividade de 7, a libertação do citocromo C e permeabilidade da membrana celular, como descrito na Tabela 1. A nossa abordagem permitiu a identificação e a caracterização do efeito de constituintes do fumo do cigarro através de amostragem da dose e dependente do tempo. Em última análise, isso produziu um perfil toxicológico in vitro para cada HPHC. abordagens multi-genómica também pode ser usado para complementar ainda mais a análise de HCS. Isto iria finalmente também fornecer uma compreensão mais profunda dos efeitos na sinalização celular e / ou do nível de transcrição.

<table><tbody><tr><td>Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader</td><td>Thermo</td><td>N01-0002B</td><td></td></tr><tr><td>xCelligence RTCA MP</td><td>ACEA</td><td>05331625001</td><td></td></tr><tr><td>Screener (HCS)</td><td>Genedata</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>CASY counter TTC</td><td>Roche</td><td>05 651 719 001</td><td></td></tr><tr><td>e-Plates VIEW 96</td><td>ACEA</td><td>06 472 451 001</td><td></td></tr><tr><td>RTCA Frame 96</td><td>ACEA</td><td>05232392001</td><td></td></tr><tr><td>RTCA Cardio Temperature Tool</td><td>ACEA</td><td>2801171</td><td></td></tr><tr><td>Plate sealer breathseal</td><td>Greiner bio-one</td><td>676051</td><td></td></tr><tr><td>Normal Human Bronchial Epithelial cells (NHBE)</td><td>Lonza</td><td>CC-2540</td><td>non-smoking 60-year-old Caucasian male donor&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BEGM BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3170</td><td>Warm at 37 &amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>ReagentPack Subculture Reagents kit</td><td>Lonza</td><td>CC-5034</td><td>Warm at 37 &amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (100x)</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Easy Flask filter cap 75&amp;nbsp;cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-565-349</td><td></td></tr><tr><td>96 well assay plate&amp;nbsp; black&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-62249</td><td></td></tr><tr><td>Draq5 (For Far Red Nuclear Staining)</td><td>Biostatus</td><td>DR50200</td><td></td></tr><tr><td>Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CMXRos</td><td>Life technologies</td><td>M-7512</td><td></td></tr><tr><td>Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CM-H2XRos</td><td>Life technologies</td><td>M-7513</td><td></td></tr><tr><td>ROS Dye: Dihydroethidium</td><td>Sigma</td><td>D7008</td><td></td></tr><tr><td>ROS Dye: CellROX</td><td>Life technologies</td><td>C10422</td><td></td></tr><tr><td>ROS Dye: MitoSOX</td><td>Life technologies</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>GSH Dye: Monochlorobimane</td><td>Sigma</td><td>69899</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>GSH Dye: Monobromobimane</td><td>Life technologies</td><td>M-1378</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Membrane permeability Dye: YO-PRO-1&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>Y3603</td><td>Irritating&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Membrane permeability Dye: TO-PRO-1&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>T3602</td><td>Irritating&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Membrane permeability Dye: TOTO-1&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>T3600</td><td>Irritating&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Caspase Dye: Cellevent Caspase 3/7 green</td><td>Life technologies</td><td>C10423</td><td>Irritating&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Cytochrome C antibody (Mouse)</td><td>Thermo</td><td>MA5-11823</td><td></td></tr><tr><td>Anti-phospho-c-Jun antibody (Mouse)</td><td>Thermo</td><td>MA5-15889</td><td></td></tr><tr><td>Anti-phospho-H2AX antibody (Mouse)</td><td>Thermo</td><td>MA1-2022</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG DyLight 650&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab96878</td><td></td></tr><tr><td>10x permeabilization buffer</td><td>Fisher</td><td>8408400</td><td></td></tr><tr><td>4% Formaldehyde solution</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>10x blocking buffer</td><td>Fisher</td><td>8408500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt solution</td><td>Sigma</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>Staurosporine</td><td>Sigma</td><td>S4400</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Valinomycin</td><td>Sigma</td><td>V0627</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Paraquat</td><td>Sigma</td><td>36541</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Anisomycin</td><td>Sigma</td><td>A9789</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Ethacrynic acid</td><td>Sigma</td><td>E4754</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>1-Aminonaphthalene</td><td>Sigma</td><td>34390</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>2-Nitropropane</td><td>Sigma</td><td>130265</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Acetamide</td><td>Sigma</td><td>695122</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma</td><td>650501</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Sigma</td><td>A9099</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Arsenic (V)</td><td>Sigma</td><td>A6756</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Benzene</td><td>Sigma</td><td>12540</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Chromium (VI)</td><td>Sigma</td><td>216623</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Crotonaldehyde</td><td>Sigma</td><td>262668</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Methyl ethyl ketone</td><td>Sigma</td><td>34861</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Nickel&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>203866</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Nitrobenzene</td><td>Sigma</td><td>48547</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Sigma</td><td>P5566</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Quinoline</td><td>Sigma</td><td>241571</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Toluene</td><td>Sigma</td><td>34866</td><td>Toxic</td></tr></tbody></table>

high content screening analysis to evaluate the toxicological effects of harmful and potentially harmful constituents (hphc)

A fumaça do cigarro (CS) é um importante fator de risco para doenças cardiovasculares e pulmonares. Porque CS é um aerossol complexo contendo mais de 7.000 produtos químicos 1 é um desafio para avaliar as contribuições de componentes individuais para a sua toxicidade geral. Perfis toxicológicos dos componentes individuais, bem como misturas podem ser no entanto estabelecida in vitro, através da aplicação de alta through-colocar ferramentas de rastreio, que permitem a caracterização dos componentes nocivos e potencialmente prejudiciais (HPHCs) da fumaça do tabaco, tal como definido por os EUA Food and Drug Administration (FDA) 2. Para uma avaliação inicial, um instrumento baseado em impedância foi usado para um tempo real de avaliação, sem rótulo de toxicidade do composto. O instrumento de leitura depende de adesão celular, viabilidade e morfologia que todos juntos fornecem uma visão geral do status celular. Um parâmetro adimensional, denominado índice de celular, é usado para a quantificação. Um conjunto de difprotocolos de coloração dife- foi desenvolvido para uma investigação baseada em imagens de fluorescência e uma plataforma de HCS foi utilizado para obter informações mais detalhadas sobre o tipo de citotoxicidade provocada por cada HPHC. Dos 15 componentes testados, apenas cinco foram seleccionados para análise baseia-HCS em que registada uma calculável LD 50 (&lt;20 mM). Estes incluíram 1-aminonaphtalene, Arsénio (V), cromo (VI), Crotonaldeído e fenol. Com base no seu efeito na HCS, 1-aminonaphtalene e fenol pode ser identificada para induzir disfunção mitocondrial, e, em conjunto com crómio (VI) como genotóxico com base no aumento da fosforilação da histona H2AX. Crotonaldeído foi identificado como um indutor de estresse oxidativo e arsênico como um ativador de quinase via do estresse. Este estudo demonstra que uma combinação de tecnologias baseadas em impedância e HCS fornece uma ferramenta robusta para a avaliação in vitro dos constituintes CS.

RTCA Porque os pontos finais HCS não será informativa quando nenhum efeito tóxico é detectada, os compostos não mostram diminuição da viabilidade celular até à concentração máxima no RCTA não são testados por HCS (Figura 3b, c, d, G, K, L, M , p). Os compostos que apresentam diminuição da viabilidade celular em apenas a mais alta concentração (Figura 3e, o) são também desmarcada para HCS. Finalmente, apenas os constituintes com um LD 50 calculável (&lt;20 mM) são seleccionadas para posterior análise HCS (Figura 3a, f, h, j, n). HPHCs que satisfazem os critérios acima são: 1-aminonaphtalene, Arsénio (V), cromo (VI), Crotonaldeído e fenol. HCS Como uma verificação de qualidade (QC), os controlos positivos são fiprimeiro analisados ​​para assegurar que o processo de coloração é realizada corretamente. Imagens representativas de células tratadas com o controlo positivo são mostrados na Figura 6. Os valores de dados são normalizados ao veículo, como descrito anteriormente. Sem curvas de resposta à dose são representados como apenas três doses são testadas e não todas as três doses são considerados em cada ponto de tempo. A dose de controlo positivos são seleccionada (com base em experiências anteriores, dados não mostrados), de modo que as respostas apropriadas são observados para cada parâmetro em ambos 4 horas e 24 horas. Em doses particulares 1 e 2 são usados ​​para avaliar o efeito em 4 horas, enquanto as doses 2 e 3 são usados ​​para avaliar o efeito às 24 h. As placas são descartados se nenhuma resposta for observada para as doses de controlo positivo. Note-se que para todos os terminais, excepto o potencial de membrana mitocondrial e conteúdo de GSH, é esperado um aumento da intensidade de sinal. Todos os compostos, com exceção de Fenol, induziu uma pheno necrótica<html> tipo, com base no aumento da permeabilidade da membrana celular (Figura 7a, F, H, L). 1-aminonaphtalene, crómio (VI), Crotonaldeído e fenol foram identificados como sendo genotóxicos baseado no aumento da fosforilação da histona H2AX (Figura 7e, j, n, p). Fenol e 1-aminonaphtalene foram encontrados para induzir a disfunção mitocondrial grave (Figura 7b, o) que, com 1-aminonaphtalene, levou a um aumento da liberação de citocromo C (Figura 7c). A detecção de um aumento da actividade da caspase 3/7 fornecida evidência de evento de apoptose por exposição crómio. Indução de estresse oxidativo (ROS ou GSH) também foi detectada após tratamento com 1-aminonaphtalene, Crotonaldeído e fenol (Figura 7d, m, q). Finalmente, o arsénio induz o stress celular, como demonstrado pelo aumento da fosforilação do factor de transcrição cJun (figura 7g). carga / 53987 / 53987fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Composto Tox-Profiler fluxo de trabalho. A) Representação esquemática do fluxo de trabalho seguido neste estudo. Em primeiro lugar, uma determinação de dose-gama foi realizada utilizando a plataforma RTCA para seleccionar as doses apropriadas para a subsequente HCS para caracterizar os perfis de toxicidade específica de composto. B) Desenho experimental do estudo. 24 horas após a semeadura, as células foram dosados ​​e valores de impedância continuamente monitorada durante as 24 horas seguintes, enquanto HCS endpoints foram investigados 4 e 24 horas após a dosagem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig2.jpg" /> Figura 2. RTCA Placa de Exposição. Placa Composto mestre é gerado pela primeira vez por executar uma de cinco etapas 01:10 série de diluição. Cada composto,incluindo o controlo de veículo (dose 0) são então adicionados em triplicado à placa de exposição em conjunto com o meio e estaurosporina como controlos. Note-se que as doses sequência é mantida após a transferência, doses mais altas estão em linha número 1, enquanto comandos do veículo estão em linha número 7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig3.jpg" /> Figura 3. Representante RTCA viabilidade celular Resultados. A) 1-aminonaphtalene, b) 2-nitropropano, c) acetamida, d) de acetona, e) acrilamida, f) arsênio (V), g) benzeno, h) de crómio (VI) , j) crotonaldeído, k) metil etil cetona, l) Nickel (II), m), nitrobenzeno, n) fenol, o) quinolina, p) Adicionou-se tolueno. Em 24 horas após a administração, a área sob a curva (AUC) foi calculada para cada dose (incluindo o controlo positivo e do veículo) e normalizado numa gama de 0 a actividade -100% (eixo y), em que 0 reflecte a actividade de o veículo e -100 do controlo positivo. Os valores foram então representados graficamente e ajustados utilizando uma equação de Hill de quatro parâmetros e, quando possível, LD50 foi calculada. As concentrações são expressas em uma escala log (eixo-x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig4.jpg" /> Figura 4. Esquema de diluição para o controlo positivo Compostos para HCS Os ensaios. A) Adição de controlos positivos e veculo para a placa de diluição em série. b) A diluição em série dos controlos positivos. c) 200X controlos positivos doses. DE) Diluição dos 200x doses controlos positivos em meio (1:40) para gerar a placa de controlo positivo contendo as doses 5x. Note-se que cada dose é diluído em triplicado para refletir o layout final na placa de exposição). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig5.jpg" /> Figura 5. HCS Placa de Exposição. Placa Composto mestre é gerado pela primeira vez por realização de uma diluição de cinco etapas. Cada composto, incluindo o controlo de veículo (dose 0) são então adicionados em triplicado à placa de exposição em conjunto com os controlos positivos. Note que a ordem doses é mantido após a transferência,doses mais elevadas são em número da linha 1 enquanto comandos do veículo estão em linha número 7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig6.jpg" /> Figura 6. Representante fluorescentes Fotos de anticorpo-ou Dye-manchados Cells a) Parâmetros nucleares - corante Nuclear:. Um corante permeável que se liga ao DNA em células vivas ou fixas. Esta mancha é usada para identificar células individuais de rótulos, a região nuclear b) Necrose - corante permeabilidade da membrana celular:. A detecção à base de corantes de integridade da membrana celular. Reagente é intrinsecamente impermeável à membrana celular. Durante a necrose, a membrana torna-se permeável e o corante entra na célula e liga-se ao ADN produzindo um forte fluorescente s. ignal c) A apoptose - citocromo C: detecção baseada em anticorpo da libertação de citocromo C, uma característica bem conhecida da apoptose precoce. Após a indução de apoptose, citocromo c é libertado a partir da mitocôndria e difunde-se para o núcleo d) de danos de ADN - pH2AX:.. Detecção baseada em anticorpo da fosforilação de H2AX histona, uma característica bem conhecida de quebras duplas ADN de cadeia e) Tensão Quinase - cJun:. detecção baseada em anticorpo da fosforilação em Ser-73 de cJun, uma característica bem conhecida de stress celular f) O stress oxidativo - DHE: detecção à base de corantes de radicais superóxido. -Se Dihydroethidium fluorescente azul no citoplasma, enquanto a forma de etídio oxidado fluorescência vermelha em cima do DNA intercalação g) GSH - mBcl:. Detecção de base de corantes de moléculas de GSH livres. mBcl reage com a GSHgerar um produto altamente fluorescente h) A apoptose - Caspase 3/7 activação:. detecção de base de corantes de 3/7 atividade caspase. Reagente é não fluorescente com um péptido de quatro aminoácidos que inibe a ligação ao ADN. Após a activação de caspase-3/7, o péptido é clivado permitindo que o corante se ligar a ADN e produzir uma resposta brilhante, fluorogénico. Painéis BH mostra células tratadas com controlo positivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig7.jpg" /> Figura 7. Representante HCS Resultados. 1-aminonaphtalene (ae), Arsénio (V) (F e G), cromo (VI) (hk), Crotonaldeído (ln) e fenol (OQ). 4 h (linha azul) e24 h (linha laranja) sinais foram calculados para cada dose e normalizada para a actividade de veículo (0%). Valores que não estão incluídos na curva cálculos de montagem são mostradas em cinza. As concentrações são expressas em uma escala log (eixo-x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig7large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Ensaio </td><td> Endpoint # </td><td> endpoint biológica </td><td> compartimento celular </td><td> recurso de saída </td></tr><tr><td rowspan="4"> citotoxicidade </td><td> 1 </td><td> Massa mitocondrial 6 </td><td> Citoplasma </td><td> Mancha área média </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Potencial de membrana mitocondrial 6 </td><td> Citoplasma </td><td> intensidade média local </td></tr><tr><td> 3 </td><td> liberação do citocromo C <sup&gt; 7 </td><td> Núcleo </td><td> intensidade média </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Permeabilidade da membrana celular 8 </td><td> Núcleo </td><td> intensidade média </td></tr><tr><td> Dano ao DNA </td><td> 5 </td><td> fosfo-H2AX 9 </td><td> Núcleo </td><td> intensidade média </td></tr><tr><td> Kinase estresse </td><td> 6 </td><td> fosfo-cJun 10 </td><td> Núcleo </td><td> intensidade média </td></tr><tr><td> ROS </td><td> 7 </td><td> ROS 11 </td><td> Núcleo </td><td> intensidade média </td></tr><tr><td> conteúdo de GSH </td><td> 8 </td><td> GSH 12 </td><td> Citoplasma </td><td> intensidade média local </td></tr><tr><td> apoptose </td><td> 9 </td><td> Caspase 3 13 </td><td> Citoplasma </td><td> intensidade média local </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Lista de HCS umssays e endpoints. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"></td><td rowspan="2"> Veículo </td><td colspan="6" rowspan="2"> doses RTCA (uM) </td><td rowspan="2"> LD 50 </td><td colspan="5"> doses HCS </td></tr><tr><td colspan="2"></td><td colspan="4"> Viabilidade celular-seleccionado (uM) </td><td> 3R4F (nM) </td></tr><tr><td colspan="2"> 1-Aminonaphtalene </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> 280? M </td><td> 2.000 </td><td> 500 </td><td> 200 </td><td> 150 </td><td> 0,27 </td></tr><tr><td colspan="2"> 2-nitropropano </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Acetamide </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Acetona </td><td> água </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> acrilamida </td><td> água </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Arsénio (V) </td><td> água </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> 160 uM </td><td> 200 </td><td> 100 </td><td> 50 </td><td> 25 </td> &lt;td&gt; 0,17 </td></tr><tr><td colspan="2"> Benzeno </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> O crómio (VI) </td><td> água </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> 20 uM </td><td> 100 </td><td> 50 </td><td> 20 </td><td> 10 </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td colspan="2"> crotonaldeído </td><td> água </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> 200 uM </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2.000 </td></tr><tr><td colspan="2"> Metil-etil-cetona </td><td> água </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt;20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Níquel </td><td> água </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> nitrobenzeno </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Fenol </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> 2.300? M </td><td> 5.000 </td><td> 2.000 </td><td> 1.000 </td><td> 500 </td><td> 240 </td></tr><tr><td colspan="2"> quinolina </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td&gt; <td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Tolueno </td><td> água </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 2. Lista de compostos HPHC testados com o LD Relativa 50 às 24 horas de tratamento. Os compostos selecionados para análise HCS são destacados em laranja e doses testadas também são dadas. A dose 3R4F é equivalente à quantidade de constituinte presente na fumaça de um pedaço de madeira do 3R4F cigarro de referência. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Ensaio </td><td> Composto </td><td> Solução stock </td><td> Solvente </td&gt; <td colspan="3"> Dose (s) (uM) </td></tr><tr><td> Viabilidade celular </td><td> estaurosporina </td><td> 10 mM </td><td> DMSO </td><td colspan="3"> 50 </td></tr><tr><td> citotoxicidade </td><td> valinomicina </td><td> 10 mM </td><td> DMSO </td><td> 50 </td><td> 20 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Dano ao DNA </td><td> paraquat </td><td> 100 mM </td><td> DMSO </td><td> 500 </td><td> 200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Kinase estresse </td><td> anisomicina </td><td> 2 mM </td><td> DMSO </td><td> 10 </td><td> 4 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ROS </td><td> rotenone </td><td> 200 mM </td><td> DMSO </td><td> 1.000 </td><td> 400 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> conteúdo de GSH </td><td> ácido etacrínico </td><td> 200 mM </td><td> DMSO </td><td> 1.000 </td><td> 400 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> apoptose </td><td> estaurosporina </td><td> 40 mM </td><td> DMSO </td><td> 200 &lt;/ Td&gt; <td> 50 </td><td> 20 </td></tr></tbody></table> Tabela 3. Lista de controlos positivos e concentrações utilizadas para cada ensaio.

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High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents HPHC

The objective of the study was to assess the biological impact of 15 cigarette smoke constituents using a combination of an impedance-based real time cell analyzer and a high-content screening (HCS)-based platform for toxicological assessment in vitro. This study provides information on effective doses, toxicity and modes of action of the tested compounds.

Análise alto teor de triagem para avaliar os efeitos toxicológicos de Constituintes nocivas e potencialmente prejudiciais (HPHC)

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it ...

high-content-screening-analysis-to-evaluate-toxicological-effects

Research

JoVE Journal

Biology

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHC)

12.1K visualizações.  Philip Morris International R&D. The objective of the study was to assess the biological impact of 15 cigarette smoke constituents using a combination of an impedance-based real time cell analyzer and a high-content screening (HCS)-based platform for toxicological assessment in vitro. This study provides information on effective doses, toxicity and modes of action of the tested compounds. 

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Human Pluripotent Stem Cell Based Developmental Toxicity Assays for Chemical Safety Screening and Systems Biology Data Generation

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in vitro toxicity testing of potential drugs. To provide a solid scientific basis for such assays, it will be important to gain quantitative information on the time course of development and on the underlying regulatory mechanisms by systems biology approaches. Two assays have therefore been tuned here for these requirements. In the UKK test system, human embryonic stem cells (hESC) (or other pluripotent cells) are left to spontaneously differentiate for 14 days in embryoid bodies, to allow generation of cells of all three germ layers. This system recapitulates key steps of early human embryonic development, and it can predict human-specific early embryonic toxicity/teratogenicity, if cells are exposed to chemicals during differentiation. The UKN1 test system is based on hESC differentiating to a population of neuroectodermal progenitor (NEP) cells for 6 days. This system recapitulates early neural development and predicts early developmental neurotoxicity and epigenetic changes triggered by chemicals. Both systems, in combination with transcriptome microarray studies, are suitable for identifying toxicity biomarkers. Moreover, they may be used in combination to generate input data for systems biology analysis. These test systems have advantages over the traditional toxicological studies requiring large amounts of animals. The test systems may contribute to a reduction of the costs for drug development and chemical safety evaluation. Their combination sheds light especially on compounds that may influence neurodevelopment specifically.

The protocols describe two in vitro developmental toxicity test systems (UKK and UKN1) based on human embryonic stem cells and transcriptome studies. The test systems predict human developmental toxicity hazard, and may contribute to reduce animal studies, costs and the time required for chemical safety testing.

Human células estaminais pluripotentes Baseado Developmental Toxicity Ensaios para Química Triagem e Safety Systems Biology Data Generation

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in ...

Biologia do Desenvolvimento

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

In vitro transactivation bioassays have shown promise as water quality monitoring tools, however their adoption and widespread application has been hindered partly due to a lack of standardized methods and availability of robust, user-friendly technology. In this study, commercially available, division-arrested cell lines were employed to quantitatively screen for endocrine activity of chemicals present in water samples of interest to environmental quality professionals. A single, standardized protocol that included comprehensive quality assurance/quality control (QA/QC) checks was developed for Estrogen and Glucocorticoid Receptor activity (ER and GR, respectively) using a cell-based Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) assay. Samples of treated municipal wastewater effluent and surface water from freshwater systems in California (USA), were extracted using solid phase extraction and analyzed for endocrine activity using the standardized protocol. Background and dose-response for endpoint-specific reference chemicals met QA/QC guidelines deemed necessary for reliable measurement. The bioassay screening response for surface water samples was largely not detectable. In contrast, effluent samples from secondary treatment plants had the highest measurable activity, with estimated bioassay equivalent concentrations (BEQs) up to 392 ng dexamethasone/L for GR and 17 ng 17&#946;-estradiol/L for ER. The bioassay response for a tertiary effluent sample was lower than that measured for secondary effluents, indicating a lower residual of endocrine active chemicals after advanced treatment. This protocol showed that in vitro transactivation bioassays that utilize commercially available, division-arrested cell &#34;kits&#34;, can be adapted to screen for endocrine activity in water.

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

A protocol to screen for endocrine activity in organic extracts of water samples, including treated wastewater effluent and surface (receiving) water, was adapted using commercially available division-arrested ("freeze and thaw") in vitro transactivation bioassays.

Triagem para Endocrine Atividade em Água Utilizando disponíveis comercialmente<em&gt; In Vitro</em&gt; Transativação Bioensaios

In vitro transactivation bioassays have shown promise as water quality monitoring tools, however their adoption and widespread application has been ...

Ambiente

Identifying Per- and Polyfluorinated Chemical Species with a Combined Targeted and Non-Targeted-Screening High-Resolution Mass Spectrometry Workflow

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the local to federal levels. The continuing evolution of PFAS chemistries presents a challenge to the environmental monitoring, where ongoing development of targeted methods necessarily lags the discovery of new chemical compounds. There is a need, therefore, to have forward-looking methodologies that can detect emerging and unexpected compounds, monitor these species over time, and resolve details of their chemical structure to enable future work in human health. To this end, non-targeted analysis by high-resolution mass spectrometry offers a broad base detection approach that can be combined with almost any sample preparation scheme and provides significant capabilities for compound identification after detection. Herein, we describe a solid-phase extraction (SPE) based sample concentration method tuned for shorter chain and more hydrophilic PFAS chemistries, such as per fluorinated ether acids and sulfonates, and describe analysis of samples prepared in this fashion in both targeted and non-targeted modes. Targeted methods provide superior quantification when reference standards are available but are intrinsically limited to expected compounds when performing analysis. In contrast, a non-targeted approach can identify the presence of unexpected compounds and provide some information about their chemical structure. Information about chemical features can be used to correlate compounds across sample locations and track abundance and occurrence over time.

Here, we present a protocol for the sequential targeted quantification and non-targeted analysis of fluorinated compounds in water by mass spectrometry. This methodology provides quantitative levels of known fluorochemical compounds and identifies unknown chemicals in related samples with semi-quantitative estimates of their abundance.

Identificação por- e espécies químicas perfluorados com um fluxo de trabalho combinada alvo e não alvo-triagem de alta resolução de espectrometria de massa

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug crisis in public health. Conventional urine drug testing based on a two-tier immunoassay screen followed by a gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) or liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method are expensive and prone to bias while being limited to targeted panels of known drugs of abuse (DoA). Herein, we outline an improved method for drug surveillance that allows for the resolution and detection of an expanded panel of DoA and their metabolites when using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry (MSI-CE-MS). Multiplexed separations of ten urine samples with a quality control by CE (&lt; 3 min/sample) in conjunction with full-scan data acquisition using a time-of-flight mass spectrometer (TOF-MS) under positive ion mode detection allows for the identification and quantification of DoA above recommended cut-off levels. An excellent resolution of drug isomers and isobars, including background interferences, are achieved when using MSI-CE-MS with an electrokinetic spacer between sample segments, where accurate mass/molecular formula together with the comigration of a matching deuterated internal standard and the detection of one or more bio-transformed metabolites facilitate DoA identification over a wider detection window. Additionally, urine samples can be analyzed directly without enzyme deconjugation for the rapid screening without complicated sample workup. MSI-CE-MS enables the surveillance of a broad spectrum of DoA that is required for the treatment monitoring of high-risk patients, including confirming prescribed drug adherence, revealing illicit drug use/substitution, and evaluating optimal dosage regimes as required for new advances in precision medicine.

Here we describe a high-throughput method for comprehensive drug surveillance that allows for the improved resolution and detection of large panels of drugs of abuse and their metabolites, with quality control based on multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry.

Vigilância de drogas de alto rendimento e abrangente utilizando espectrometria de massa Multisegment eletroforese capilar-injeção

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Química

A High-Throughput Screening Approach for Evaluating the Binding Affinity of Environmental Pollutants to Nuclear Receptors

Increasing levels of compounds have been detected in the environment, causing widespread pollution and posing risks to human health. However, despite their high environmental occurrence, there is very limited information regarding their toxicological effects. It is urgent to develop high-throughput screening (HTS) methods to guide toxicological studies. In this study, a receptor-ligand binding assay using an HTS system was developed to determine the binding potency of environmental pollutants on nuclear receptors. The test is conducted using a microplate reader (i.e., a 96-well plate containing various chemicals) by measuring the fluorescence polarization (FP) of a specific fluorescent probe. This assay consists of four parts: the construction and transformation of recombinant vectors, the expression and purification of the receptor protein (ligand-binding domain), receptor-probe binding, and competitive binding of chemicals with the receptor. The binding potency of two environmental pollutants, perfluorooctanesulfonic acid (PFOS) and triphenyl phosphate (TPHP), with peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR&#947;) was determined to illustrate the assay procedure. Finally, the advantages and disadvantages of this method and its potential applications were also discussed.

This protocol describes a high-throughput screening system that uses fluorescence polarization of a specific fluorescent probe binding to a nuclear receptor as a readout for screening environmental pollutants.

Increasing levels of compounds have been detected in the environment, causing widespread pollution and posing risks to human health. However, despite ...

High-Content Screening Assay for the Identification of Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Modifying Compounds

Immunotherapy with antigen-specific antibodies or immune checkpoint inhibitors has revolutionized the therapy of breast cancer. Breast cancer cells expressing the epidermal growth factor receptor HER2 can be targeted by the anti-HER-2 antibody trastuzumab. Antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) is an important mechanism implicated in the antitumor action of HER-2. Trastuzumab bound to cancer cells can be recognized by the Fc receptors of ADCC effector cells (e.g., natural killer (NK) cells, macrophages, and granulocytes), triggering the cytotoxic activity of these immune cells leading to cancer cell death. We set out to develop an image-based assay for the quantification of ADCC to identify novel ADCC modulator compounds by high-content screening. In the assay, HER2 overexpressing JIMT-1 breast cancer cells are co-cultured with NK-92 cells in the presence of trastuzumab, and target cell death is quantified by automated microscopy and quantitative image analysis. Target cells are distinguished from effector cells based on their EGFP fluorescence. We show how compound libraries can be tested in the assay to identify ADCC modulator drugs. For this purpose, a compound library test plate was set up using randomly selected fine chemicals off the lab shelf. Three microtubule destabilizing compounds (colchicine, vincristine, podophyllotoxin) expected to interfere with NK cell migration and degranulation were also included in the test library. The test screen identified all three positive control compounds as hits proving the suitability of the method to identify ADCC-modifying drugs in a chemical library. With this assay, compound library screens can be performed to identify ADCC-enhancing compounds that could be used as adjuvant therapeutic agents for the treatment of patients receiving anticancer immunotherapies. In addition, the method can also be used to identify any undesirable ADCC-inhibiting side effects of therapeutic drugs taken by cancer patients for different indications.

This protocol presents an automated, image-based high-throughput technique to identify compounds modulating natural killer cell-mediated breast cancer cell killing in the presence of a therapeutic anti-HER-2 antibody.

Ensaio de Triagem de Alto Conteúdo para Identificação de Compostos Modificadores de Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpos

Immunotherapy with antigen-specific antibodies or immune checkpoint inhibitors has revolutionized the therapy of breast cancer. Breast cancer cells ...

Pesquisa do câncer

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

Avaliação do citotóxicos e efeitos imunomoduladores de substâncias no pulmão humano de precisão de corte fatias

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Imunologia e Infecção

Avaliando as alterações de comportamento celular induzidas por MOF por detecção elétrica de substrato celular

Electric Cell-Substrate Sensing for Real-Time Evaluation of Metal-Organic Framework Toxicological Profiles

Metal-organic frameworks (MOFs) are hybrids formed through the coordination of metal ions and organic linkers in organic solvents. The implementation of MOFs in biomedical and industrial applications has led to concerns regarding their safety. Herein, the profile of a selected MOF, a zeolitic imidazole framework, was evaluated upon exposure to human lung epithelial cells. The platform for evaluation was a real-time technique (i.e., electric cell-substrate impedance sensing [ECIS]). This study identifies and discusses some of the deleterious effects of the selected MOF on the exposed cells. Furthermore, this study demonstrates the benefits of using the real-time method versus other biochemical assays for comprehensive cell evaluations. The study concludes that observed changes in cell behavior could hint at possible toxicity induced upon exposure&#160;to MOFs of different physicochemical characteristics and the dosage of those frameworks being used. By understanding changes in cell behavior, one foresees the ability to improve safe-by-design strategies of MOFs to be used for biomedical applications by specifically tailoring their physicochemical characteristics.

Autor em destaque: Avanços na avaliação da resposta das células epiteliais pulmonares humanas a estruturas metal-orgânicas 

The following study evaluates the toxicological profile of a selected metal-organic framework utilizing electric cell-substrate impedance sensing (ECIS), a real-time, high-throughput screening technique.

Sensoriamento Elétrico Célula-Substrato para Avaliação em Tempo Real de Perfis Toxicológicos de Estrutura Metal-Orgânica

Metal-organic frameworks (MOFs) are hybrids formed through the coordination of metal ions and organic linkers in organic solvents. The implementation of ...

Análise alto teor de triagem para avaliar os efeitos toxicológicos de Constituintes nocivas e potencialmente prejudiciais (HPHC)

Resumo

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