We are grateful to Dr. Sachiko Sato and Julie-Christine L&#233;vesque at the Bioimaging Platform of the Centre de recherche du CHU de Qu&#233;bec for their technical assistance. Grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) RGPIN-2014-05308, The Banting Research Foundation, and The Scottish Rite Charitable Foundation of Canada to M.E.T supported this work.
H.E.H. is recipient of a scholarship from the Lebanese Ministry of Education and Higher Education, and K.B. from the Facult&#233; de m&#233;decine of Universit&#233; Laval.

Nota: Todos os experimentos foram aprovados e realizados sob as orientações do comitê de ética animal Institucional, em conformidade com a Canadian Council on Animal Care diretrizes administrado pelo Comitê de Cuidados Animais da Université Laval. Foram utilizados ratos macho APP-PS1 entre 4 e 21 meses de idade. Estes animais foram alojados sob um ciclo de luz-escuro de 12 h a 22-25 ° C, com livre acesso a comida e água. 1. Metoxi-X04 Preparação de Soluções <ol><li> Prepara-se uma solução de 5 mg / ml de metoxi-X04 9 dissolvendo metoxi-X04 em uma solução contendo 10% de dimetilsulfóxido (DMSO), 45% de propileno glicol e 45% de fosfato de sódio salino (NaCl a 0,9% em tampão de fosfato 100 mM , pH 7,4). <ol><li> Usando uma microbalança, Pesar 5 mg do composto metoxi-X04. De acordo com um exaustor, dissolve-se o metoxi-X04 em DMSO e agita-se até se obter uma solução esverdeada clara. Sucessivamente adicionar propilenoglicol e pHosphate tampão de solução salina com agitação após cada adição. </li><li> Agita-se a solução a 4 ° C num rotor O / N. Obter uma emulsão verde amarelado. A solução pode ser armazenada a 4 ° C durante até dois meses, sem degradação. </li></ol></li></ol> 2. Metoxi-X04 Injecção Solução <ol><li> 24 h antes da perfusão, pesar os ratinhos e atribuir a cada ratinho uma injecção intraperitoneal de metoxi-X04 a uma dose de 10 mg / kg de peso do corpo, utilizando uma agulha de 27 G ½. </li></ol> 3. transcardial Perfusão do camundongos injetados <ol><li> No dia antes da perfusão, preparar volumes apropriados de tampão fosfato salino (PBS), 3,5% de acroleína, e soluções de 4% de paraformaldeído (PFA) 13 e armazená-las a 4 ° CO / N. Nota: Estas soluções serão utilizadas tanto para a perfusão e a incorporação de pré-imuno-histoquímica. Tome especial cuidado quando se trabalha com acroleína, como é corrosivo e tóxico para ambospesquisadores e meio ambiente. Além disso, uma vez que a acroleína é corrosivo para o plástico, sempre utilizar material de vidro adequado para preparar soluções de acroleína. </li><li> No dia da perfusão, filtrar o PFA e acroleína, utilizando papel de filtro vulgar de retenção de partículas de 25 um. </li><li> Durante a perfusão, utilizar uma bomba peristáltica para fornecer 15 ml de PBS, 75 ml de acroleína, e 150 mL de PFA, sucessivamente, para a circulação do rato, a uma taxa de fluxo de 25 ml / min. Tenha cuidado. Realização de perfusão estritamente dentro de um exaustor para evitar fumos nocivos da PFA e acroleína. <ol><li> Para configurar a bomba, insira uma extremidade na solução PBS, encher o tubo (segurando cerca de 15 ml) com PBS e fixar um alado agulha de recolha de sangue 25 G para a outra extremidade. Em todos os momentos, garantir que a tubulação está livre de quaisquer bolhas de ar aprisionadas. </li><li> Colocar o tubo directamente na garrafa de acroleína após ajustar a bomba de perfusão com o tubo cheio com PBS. </li></ol></li><li> Aaesthetize um rato de cada vez com 90 mg / kg de peso corporal dose de pentobarbital de sódio injectado intraperitonealmente utilizando uma agulha de 27 G ½. Avaliar as respostas para pitadas cauda / tep. Prossiga apenas se o rato não responde a tais aversivas, estímulos dolorosos. </li><li> Garantir o mouse na posição supina (deitada de costas, com o rosto para cima) gravando as patas dianteiras e patas posteriores à superfície de trabalho e expor cuidadosamente o coração, sem causar danos a outros órgãos. Certifique-se de trabalhar rapidamente após a perfuração do diafragma. <ol><li> Realizar uma incisão através da pele com uma tesoura cirúrgica ao longo da linha média torácica começando caudal para a caixa torácica e proceder rostral à clavícula. </li><li> Faça duas incisões laterais adicionais ao longo da base da caixa torácica ventral. Suavemente mover e fixar as duas abas de pele, certificando-se de expor toda a cavidade torácica. </li><li> Segure o apêndice xifóide com uma pinça sem corte para expor a cavidade torácica e estabilize a tesoura pointeds. Corte através do diafragma e da caixa torácica, tomando cuidado para evitar atingir os pulmões, e continuar a rostral incisão para as clavículas. Certifique-se de trabalhar rapidamente após a perfuração do diafragma. </li></ol></li><li> Gentilmente rasgar o saco pericárdio com uma pinça sem corte. Segure o coração estável com uma pinça sem corte, corte o átrio direito, e começar a infusão de PBS. Imediatamente insira a agulha de recolha de sangue para o ventrículo esquerdo. </li><li> Perfundir o rato com PBS (no tubo) seguido de acroleína durante 3 min (correspondendo a 75 ml), em seguida mudar para PFA durante 6 min (correspondendo a 150 ml). Certifique-se de fazer uma pausa no fluxo da bomba antes da solução de comutação para evitar bolhas de entrar no tubo. </li><li> Decapitar o rato e extrair o cérebro fixo e colocá-la directamente para um frasco de vidro contendo PFA a 4% durante pelo menos 2 horas a 4 ° C. <ol><li> Para extrair o cérebro, utilizar tesouras e pinças para cortar através da pele para expor o crânio. Cuidadosamente quebrar o op crânioPT entre os olhos, e chip fora pequenos pedaços do mesmo para expor o cérebro subjacente. </li><li> Retire cuidadosamente o cérebro e pós expostos corrigi-lo com PFA 4% para mais 2 horas antes de prosseguir para vibratome seccionamento. </li></ol></li></ol> 4. Seccionamento cérebro usando um Vibratome <ol><li> Lavar o cérebro fixo 3 vezes com PBS arrefecido. Usando uma lâmina de barbear afiada, remover o bolbo olfactivo (a menos que esta região está sob investigação) e cortar transversalmente o cérebro em 2 - 3 pedaços de aproximadamente a mesma altura, todos os quais podem ser seccionados em simultâneo, a fim de acelerar o processo. </li><li> Cole as peças de tecido cerebral verticalmente sobre a placa de amostra fixada na bandeja. Certifique-se de que a superfície de corte lisa adere firmemente à placa de amostra e não ficar desalojado durante o processo de corte. Adicionar solução PBS o suficiente na bandeja até a superfície do cérebro inteiro está completamente submerso. É importante manter the peças de cérebro e secções subsequentes totalmente imersa em PBS ao longo deste passo. </li><li> Coloque a bandeja na vibratome, ajustar a velocidade de corte a 0,5 mm / seg, a frequência de corte de 90 Hz, e a espessura de alimentação a 50 um, a fim de se obter 50 mm de espessura. Em seguida, transferir as secções em frascos de vidro de 20 ml contendo solução de crioprotector (40% de PBS, 30% de etileno-glicol e 30% de glicerol) utilizando um pincel fino. Armazenar os tubos a -20 ° C até à sua utilização. Alternativamente, manter as secções em PBS para o rastreio imediato tal como descrito nas etapas seguintes. </li></ol> 5. Secção de triagem para a presença de placas Metoxi-X04-manchadas <ol><li> Com o auxílio de um cérebro de rato atlas estereotáxico 14, secções do cérebro seleccione contendo a região de interesse, por exemplo, o hipocampo CA1 como usado no presente exemplo. Colocar cada secção em um poço numa placa de cultura de 24 poços contendo a solução de agente crioprotector suficientede modo a evitar que as secções de secagem para fora. </li><li> Examine cada seção sucessivamente, para evitar a secagem das secções, utilizando o seguinte procedimento: <ol><li> Adicionar uma gota de PBS para uma lâmina de microscópio com uma pipeta descartável, e colocar a seção sobre a gota. </li><li> Examinar a secção sob um microscópio de fluorescência para identificar regiões que contêm placas de Ap metoxi-X04 rotulados. Nota: metoxi-X04 pode ser facilmente visualizadas utilizando um filtro de fluorescência de raios ultravioleta (UV) (excitação 340-380 nm). </li></ol></li><li> Capturar imagens de regiões de interesse (ROI) no campo luminoso, bem como em modo de fluorescência sem mover a platina do microscópio, uma vez que cada imagem deve mostrar a mesma região em ambos os domínios, a fim de correlacionar a presença das placas directamente à região estrutural de a secção de tecido. </li><li> Salve e nomeie as imagens tiradas de acordo com o número de animais. Também gravar o número poço na placa e no campo das imagens de TAken. Por exemplo, Ex: 9978A1B; número de animais: 9978; Bem número: A1; Campo: Bright. Coloca a secção de volta no bem o seu designado uma vez que a imagem é concluída. Nota: No final, para cada secção examinados, duas imagens são obtidas, uma em campo brilhante e uma outra no campo UV. </li><li> Abra as duas imagens do mesmo ROI (um em campo claro e outro no campo UV) em Imagem J, e usando o plugin MosaicJ, alinhar as bordas das duas imagens e guardar a imagem alinhada e combinados de acordo com o número bem ele veio de. </li><li> Salvar a imagem em uma pasta separada com o número do animal particular. Combine as imagens para identificar e localizar as placas na secção de tecido, e ter uma visão completa de toda a secção nos dois campos diferentes (brilhantes e UV). </li><li> Após o processo de triagem é completada, armazenar as secções examinadas a -20 ° C em uma placa de cultura de 24 poços contendo crioprotector até imunocoloração ou processamento posterior é cArried fora. </li></ol> 6. Pré-incorporação imunocoloração para IBA1 Nota: Execute a marcação para IBA1 em seções livremente flutuantes selecionados, colocando a placa em uma cadeira de balanço movendo-se lentamente à temperatura ambiente. <ol><li> Lavar exaustivamente as secções 3 vezes com aproximadamente 1 mL de PBS, de cada lavagem com duração de 10 min. </li><li> Extingue-se as peroxidases endógenas com 0,3% de peróxido de hidrogénio em solução de PBS durante 10 min. Este passo evita a actividade da peroxidase não-específica, o que é importante para evitar a coloração de fundo. </li><li> Lavar o tecido em PBS 3 vezes durante 10 minutos cada. </li><li> Incubam-se as secções em 0,1% de borohidreto de sódio em solução de PBS durante 30 min. Esta etapa é importante para reduzir quaisquer aldeídos remanescentes do passo de fixação, e é especialmente importante se a acroleína é usado na fixação do tecido. </li><li> Lave o tecido em PBS 3 vezes durante 10 minutos de cada vez e certifique-se de remover todas as bolhas. </li><li> Bloquear as secções durante 1 h.Diferentes anticorpos podem requerer diferentes tempos e soluções de bloqueio. Para IBA1, preparar tampão contendo 10% de soro fetal de bovino, 3% de albumina de soro de bovino, e 0,01% de Triton X-100 em 50 mM Tris-salino tamponado de bloqueio (TBS, pH 7,4). Nota: O passo de bloqueamento é para evitar a ligação não específica do anticorpo primário. A baixa concentração de Triton X-100 permite ligeira permeabilização de membranas para melhor coloração e é baixo o suficiente para preservar a maioria das características ultra-estruturais de tecido sob EM. </li><li> Remover o tampão de bloqueio a partir do tecido, e incubar em solução de anticorpos primários (anticorpo de coelho anti-IBA1, diluiu-se [1: 1000] em tampão de bloqueio) a 4 ° CO / N. </li><li> Lavar 3 vezes em TBS durante 10 min de cada vez. </li><li> Incubar em anticorpo secundário (anticorpo de cabra anti-coelho conjugado com biotina) [1: 200] em TBS 0,05 M durante 90 min. </li><li> Lavar com TBS 5 vezes durante 5 min cada vez. </li><li> Incubar em solução de complexo avidina-biotina (Avidina [1: 100], Biotina [1: 100]) em TBSsolução durante 1 h. </li><li> Lavar com TBS 5 vezes durante 5 min cada vez. </li><li> Revelar a coloração IBA1 com 0,05% de diaminobenzidina (DAB) e 0,015% de peróxido de hidrogénio em TBS durante 8 min. Nota: O tempo de desenvolvimento pode variar de DAB protocolo de protocolo e deve ser determinada pelo exame rapidamente as secções coradas sob um microscópio de luz. Nota: Para IBA1, um deve ser capaz de visualizar claramente os corpos celulares e processos dos microglia manchado de IBA1 em 20X (veja a Figura 2, por exemplo representativo). Seja cauteloso usando DAB, como é um conhecido agente cancerígeno. </li><li> Evitar o excesso de desenvolvimento através da monitorização cuidadosa das seções (como descrito acima) durante esta etapa. Parar a reacção por lavagem das secções em PB refrigeradas 5 vezes, durante 5 min de cada vez. </li></ol> 7. Processamento de Microscopia Eletrônica <ol><li> Preparar a solução de tetróxido de ósmio a 1% em PBS num frasco de vidro. Tetróxido de ósmio é fotossensível; cobrir o gfrasco moça com folha de alumínio para proteger a solução da luz. Seja cautelosa, utilizando tetróxido de ósmio, como é uma substância química muito perigosos. Executar esta e as seguintes etapas dentro de um exaustor. </li><li> Remover o PBS das seções e espalhá-los plana usando um pincel fino. Execute esta etapa um poço de cada vez para manter as seções de secar. Certifique-se de achatar as secções imediatamente antes da adição de tetróxido de ósmio, como quaisquer dobras nas seções irá tornar-se permanente e tentando alisar o tecido pós ósmio fixação só vai quebrar as seções. </li><li> Mergulhar as secções em tetróxido de ósmio durante 30 min à temperatura ambiente, adicionando uma gota de tetróxido de ósmio de uma vez com uma pipeta de transferência, para evitar que as secções de dobragem. Cobrir o poço com uma folha de alumínio para proteger as seções da luz. Nota: Esta etapa corrige os lípidos dentro das seções. O tecido vai aparecer muito escuro depois de ósmio pós-fixação. </li><li> Enquanto que as secções estão em tetro de ósmiohidróxido O, preparar a resina de plástico numa proveta descartável através da mistura de 20 g de componente A e 20 g de componente B, 0,6 g de componente C, e 0,4 g de componente D. Combinar os componentes juntos na ordem acima e misturá-los bem utilizando uma pipeta de 10 ml serológica até se obter uma cor uniforme. </li><li> Transfira a mistura preparados para pratos de alumínio de pesagem. Eles receberão as secções de tecido depois de terem sido desidratadas. </li><li> Desidratar as secções em concentrações crescentes de etanol, durante 2 minutos na seguinte ordem: 35%, 35%, 50%, 70%, 80%, 90%, 100%, 100%, 100%. </li><li> Para remover o etanol residual, imergir as secções de óxido de propileno de 3 vezes durante 2 min de cada vez. Remover os desidratados secções da placa de cultura de 24 poços em 20 ml de frascos de vidro. Sempre utilizar frascos de vidro quando se trabalha com óxido de propileno, uma vez que se dissolve de plástico, e manter cautela, uma vez que é perigoso. </li><li> Use uma ponta de pipeta de vidro dobrada ou um pincel fino para transferir as seções de soluti óxido de propilenona na resina e deixar O / N para a infiltração à TA. Tenha cuidado para não diluir a resina com óxido de propileno. </li><li> Incorporar a secção com a resina de poli-cloro-tri-f luoro-etileno (PCTFE) filmsheets: <ol><li> Colocar os pratos de pesagem de alumínio contendo as amostras em um 50 - 60 ° C forno por 10 - 15 min antes da incorporação das secções em filmsheets PCTFE. </li><li> Ao incorporar secções, trabalhar com um prato de pesagem de alumínio de cada vez. Usando um pincel fino, pinte uma fina camada de resina na folha de filme de uma PCTFE. </li><li> Mover uma seção de tecido de cada vez a partir da pesagem de alumínio prato para a folha de filme PCTFE. Retire o excesso de resina de todo o tecido, tomando cuidado para não perturbá-la. </li><li> Depois de mover todas as secções de um prato de pesagem para a folha de película PCTFE, colocar uma segunda folha PCTFE através da primeira, a criação de um sanduíche de tecido e resina em entre 2 folhas. </li></ol></li><li> Polimerizar a resina em uma incubadora durante 3 dias a 55-60 ° C. </li><li> O material está pronto para corte ultrafinos e exame ultra-estrutural, técnicas especializadas, que são muitas vezes realizados por instalações nucleares do EM. Armazene as amostras entre folhas de filme PCTFE com segurança em RT sem degradação ultra-estrutural. Nota: Os passos subsequentes para ultrafino seccionamento e transmissão exame de microscopia eletrônica são explicadas em um protocolo separado 13. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Este protocolo explica uma abordagem correlativa para a segmentação do núcleo denso placas de Ap com EM. Metoxi-X04 na injeção vivo permite uma rápida seleção de seções do cérebro que contêm placas de Ap em determinadas regiões e camadas de interesse, por exemplo, a CA1 do hipocampo, radiatum estratos, e lacunosum-moleculare. No presente exemplo, metoxi-X04 pré-rastreio foi combinada com pré-incorporação de imunocoloração para IBA1 para estudar como diferentes fenótipos microgliais ...

Ap a formação de placa amilóide é a principal característica neuropatológica da doença de Alzheimer (AD). No entanto evidência crescente sugere funções importantes do sistema imunitário em 1,2 a progressão da doença. Em particular, os novos dados de estudos pré-clínicos e clínicos estabelecidos disfunção imunológica como piloto principal e contribuinte para a patologia. Com estes resultados, as células imunes centrais e periféricas surgiram como alvos terapêuticos promissores para 3 AD. O protocolo a seguir combina microscopia óptica e eletrônica (EM) para gerar novos insights sobre a relação entre a deposição de placas de Ap e alterações fenotípicas microgliais em AD. Este protocolo permite a rotulagem de placas de Ap em modelos do rato de AD usando na injeção vivo do corante fluorescente metoxi-X04. Metoxi-X04 é um derivado de Vermelho do Congo que pode facilmente atravessar a barreira sangue-cérebro para entrar no parênquima cerebral e ligar folhas β-pregueadas com um elevadoffinity. Uma vez que o corante fluorescente é, ele pode ser utilizado para a detecção in vivo de deposição de placas de Ap com microscopia de dois fotões 4. Uma vez ligado ao Aâ, metoxi-X04 não se dissociam ou redistribuir longe de placas, e que mantém a sua fluorescência ao longo do tempo. É geralmente administrada perifericamente para permitir a imagem não invasiva de dinâmica cerebral 5. A fluorescência também permanece seguinte fixação aldeído, permitindo análises correlativa post-mortem, incluindo a investigação de morte neuronal na vizinhança de Ap placas 6. Este protocolo tira proveito das propriedades de metoxi-X04 para selecionar seções do cérebro de APP SWE / PS1A 246e ratos (APP-PS1; coexpressï¿½ uma mutação dupla na gene APP Lys670Asn / Met671Leu, ea variante presenilina PS1-A264E humana) 7, que exibem Ap placas em regiões específicas de interesse (CA1 do hipocampo, radiatum estratos, e lacunosum-moleculare) Antes da pré-incorporação de imunocoloração com o marcador de microglia ionizado molécula de adaptador se liga a cálcio 1 (IBA1) para visualizar os corpos celulares microgliais e processos com EM. Os ratinhos são dadas injecção intraperitoneal de solução de metoxi-X04, 24 horas antes da fixação do cérebro através de perfusão transcardial. secções cerebrais coronais são obtidos utilizando um vibratome. As secções que contêm a CA1 do hipocampo são rastreadas sob um microscópio fluorescente para a presença de placas de Ap em estratos radiatum e lacunosum-moleculare. Imunocoloração para IBA1, tetróxido de ósmio pós-fixação e inclusão em resina plástica são, então, realizada nas seções selecionadas do cérebro. No final deste protocolo, as seções podem ser arquivados sem mais degradação ultra-estrutural, pronto para corte ultrafinos e exame ultra-estrutural. Importante, as placas ainda são fluorescentes após imunocoloração com anticorpos diferentes, por exemplo IBA1 como no presente protocolo. Eles se tornam mais escuras than sua neurópilo envolvente seguinte tetróxido de ósmio pós-fixação, independentemente da coloração metoxi-X04, que ajuda a identificar com precisão as regiões de interesse, geralmente para baixo a alguns milímetros quadrados, a ser examinado com o microscópio eletrônico de transmissão. Esta abordagem correlativa oferece uma maneira eficiente para identificar as secções específicas do cérebro para examinar a nível ultra-estrutural. Isto é particularmente útil quando se estuda patologia AD cedo, dentro das regiões ou camadas específicas do cérebro que só pode conter algumas placas de Ap, presentes em apenas uma pequena fração dos cortes de tecido. Durante estes tempos em especial, seria ineficiente para usar imunocoloração para Ap (e etiquetagem dupla para outros marcadores celulares, tais como IBA1) em várias secções do cérebro simplesmente para se obter uma pequena fracção que contém placas de Ap no local certo. Além disso, a injecção de ratos ao vivo com metoxi-X04 antes do sacrifício e processamento de tecidos não compromisE é a preservação ultra-estrutural. Métodos alternativos, tais como coloração post mortem com vermelho do Congo, Tioflavina S, tioflavina T ou metoxi-X04 em secções de tecido fixadas requerem diferenciação coloração em etanol, o que faz com 8-11 stress osmótico e interrompe a ultra-estrutura. Vermelho do Congo é também um conhecido cancerígeno humano 12.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1006">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Methoxy-X04</td>
			<td style="width:197px;">Tocris Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">4920</td>
			<td style="width:167px;">10 mg substrate per tablet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Propylene glycol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W294004&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP231-1</td>
			<td>Caution: toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Hydrochloride</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP153500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acrolein&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>110221</td>
			<td>Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde Granular</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19210</td>
			<td>Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-790-14F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peristaltic Pump with Tubing</td>
			<td>ColeParmer</td>
			<td>cp.78023-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Excel Winged blood Collection Set Needles 25G&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Extrafine Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11152-10</td>
			<td>Tip shape: curved</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14090-09</td>
			<td>Tip shape: straight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hartman Hemostats</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>13003-10</td>
			<td>Tip shape: curved</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Surgical Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14004-16</td>
			<td>Tip shape: straight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Dissecting Scissors</td>
			<td>ROBOZ surgical store</td>
			<td>5818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass scintillation vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>74515-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibrating Blade Michrotome Leica VT1000 S</td>
			<td>Leica Biosystems&#160;</td>
			<td>14047235612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome blades</td>
			<td>Electron microscopy Sciences</td>
			<td>71990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well Tissue Culture Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylene Glycol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP230-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP229-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrogen Peroxide, 30%</td>
			<td>J.T.BAKER</td>
			<td>cat: 2186-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium borohydride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>480886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP153-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin (BSA), fraction V</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C001H24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti IBA1, Rabbit&#160;</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>019-19741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111066046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VECTASTAIN Elite ABC Kit (Standard)</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3.3&#39;-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride (DAB)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5905-50TAB</td>
			<td>Caution: toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Osmium tetroxide, 4% solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19150</td>
			<td>Caution: toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Durcupan&#8482; ACM single component A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>44611</td>
			<td>Resin Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Durcupan&#8482; ACM single component B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>44612</td>
			<td>Hardener Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Durcupan&#8482; ACM single component C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>44613</td>
			<td>Plasticizer Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Durcupan&#8482; ACM single component D</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>44614</td>
			<td>Accelerator Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>LesAlcoolsdeComerce</td>
			<td>151-01-15N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Propylene oxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>110205</td>
			<td>Caution: corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminum weigh dishes</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70048-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ACLAR&#174;&#8211;Fluoropolymer Films</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oven/Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

correlative light and electron microscopy to study microglial interactions with &#946;-amyloid plaques

Um protocolo detalhado é fornecido aqui para identificar placas amilóides de Ap em secções do cérebro a partir de modelos de rato da doença de Alzheimer antes de pré-incorporação de imunocoloração (especificamente para ionizado molécula de ligação ao cálcio do adaptador 1 (IBA1), uma proteína de ligação de cálcio expresso pela microglia) e processamento do tecido para microscopia eletrônica (EM). Metoxi-X04 é um corante fluorescente que atravessa a barreira sangue-cérebro e selectivamente se liga a folhas p pregueada encontradas no núcleo denso placas de Ap. Injeção dos animais com metoxi-X04 antes do sacrifício e fixação do cérebro permite pré-triagem e seleção das seções do cérebro contendo placas para posterior processamento com manipulações demorados. Isto é particularmente útil quando se estuda patologia AD início dentro de regiões específicas do cérebro ou camadas que podem conter muito poucas placas, presentes em apenas uma pequena fração das seções. processamento pós-mortem de secções de tecido com Vermelho do Congo, Tioflavina S e Thioflavin T (ou mesmo com metoxi-X04) pode rotular folhas beta-pregueada, mas requer extensa clareira com etanol para remover o excesso de corante e esses procedimentos são incompatíveis com a preservação ultra-estrutural. Além disso, seria ineficiente para realizar etiquetagem para Ap (e outros marcadores celulares, tais como IBA1) em todas as secções do cérebro a partir das regiões de interesse, apenas para se obter uma fracção contendo pequenas placas de Ap no local certo. Importante, placas de Ap ainda são visíveis após o processamento do tecido para a EM, permitindo uma identificação precisa das áreas (geralmente para baixo a alguns milímetros quadrados) para examinar ao microscópio eletrônico.

Esta secção ilustra os resultados que podem ser obtidos em diferentes etapas críticas do protocolo. Em particular, os resultados mostram exemplos de seções do cérebro contendo metoxi-X04 placas manchado na região específica e camadas de interesse: o CA1 do hipocampo, radiatum estratos, e lacunosum-moleculare. As placas e organização regional / lamelar do hipocampo são sucessivamente visualizadas utilizando uma combinação de filtros UV e de campo brilhante (Figura 1)....

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Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with &#946;-Amyloid Plaques

Este artigo descreve um protocolo para a visualização de placas amilóides de Ap em modelos de rato da doença de Alzheimer utilizando metoxi-X04, que atravessa a barreira sangue-cérebro e selectivamente se liga a p-pregueadas folhas encontradas no núcleo denso placas de Ap. Ele permite pré-triagem de secções de tecido contendo placas antes de imunocoloração e processamento para microscopia eletrônica.

Correlativa Luz e Microscopia Eletrônica para estudar interações Microglial com placas de beta-amilóide

A detailed protocol is provided here to identify amyloid A&#946; plaques in brain sections from Alzheimer&#39;s disease mouse models before pre-embedding ...

correlative-light-electron-microscopy-to-study-microglial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.2K visualizações.  CHU de Québec Research Center.  Este artigo descreve um protocolo para a visualização de placas amilóides de Ap em modelos de rato da doença de Alzheimer utilizando metoxi-X04, que atravessa a barreira sangue-cérebro e selectivamente se liga a p-pregueadas folhas encontradas no núcleo denso placas de Ap. Ele permite pré-triagem de secções de tecido contendo placas antes de imunocoloração e processamento para microscopia eletrônica. 

Vídeo: Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with β-Amyloid Plaques

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

Ion Beam centrada Fresagem e Microscopia Eletrônica de Varredura do Tecido Cerebral

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Neurociência

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer basic questions on how light information is processed and shared between rapid and circadian behaviors. Drosophila larvae display a stereotypical avoidance behavior when exposed to light. To investigate light dependent behaviors comparably simple light-dark preference tests can be applied. In vertebrates and arthropods the neural pathways involved in sensing and processing visual inputs partially overlap with those processing photic circadian information. The fascinating question of how the light sensing system and the circadian system interact to keep behavioral outputs coordinated remains largely unexplored. Drosophila is an impacting biological model to approach these questions, due to a small number of neurons in the brain and the availability of genetic tools for neuronal manipulation. The presented light-dark preference assay allows the investigation of a range of visual behaviors including circadian control of phototaxis.

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Here we describe a light-dark preference test for Drosophila larva. This assay provides information about innate and circadian regulation of light sensing and processing photobehavior.

Luz Ensaio Preferências para estudar inata e circadiano Photobehavior Regulamentado<em&gt; Drosophila</em&gt; As larvas

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

Micron escala Resolução óptica Tomografia de todo cérebro do rato com confocal Luz Folha de Microscopia

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipulação genética de Cerebelar Granule Neurônios<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Estudar Neuronal Morfologia e Migração

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

O Sistema Olfativo como um modelo para estudar os padrões de crescimento axonal e Morfologia<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

A Human Blood-Brain Interface Model to Study Barrier Crossings by Pathogens or Medicines and Their Interactions with the Brain

The early screening of nervous system medicines on a pertinent and reliable in cellulo BBB model for their penetration and their interaction with the barrier and the brain parenchyma is still an unmet need. To fill this gap, we designed a 2D in cellulo model, the BBB-Minibrain, by combining a polyester porous membrane culture insert human BBB model with a Minibrain formed by a tri-culture of human brain cells (neurons, astrocytes and microglial cells). The BBB-Minibrain allowed us to test the transport of a neuroprotective drug candidate (e.g., Neurovita), through the BBB, to determine the specific targeting of this molecule to neurons and to show that the neuroprotective property of the drug was preserved after the drug had crossed the BBB. We have also demonstrated that BBB-Minibrain constitutes an interesting model to detect the passage of virus particles across the endothelial cells barrier and to monitor the infection of the Minibrain by neuroinvasive virus particles. The BBB-Minibrain is a reliable system, easy to handle for researcher trained in cell culture technology and predictive of the brain cells phenotypes after treatment or insult. The interest of such in cellulo testing would be twofold: introducing derisking steps early in the drug development on the one hand and reducing the use of animal testing on the other hand.

Here we present a protocol describing the setting of an in cellulo BBB (Blood brain barrier)-Minibrain polyester porous membrane culture insert system in order to evaluate the transport of biomolecules or infectious agents across a human BBB and their physiological impact on the neighboring brain cells.

Um modelo de Interface de sangue-cérebro humano para estudar os cruzamentos de barreira por agentes patogénicos ou medicamentos e suas interações com o cérebro

The early screening of nervous system medicines on a pertinent and reliable in cellulo BBB model for their penetration and their interaction with the ...

Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the cells themselves. Here, we present the method of Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins (LIMAP) using the PRIMO system as a patterning technique to produce micro-patterned extracellular matrix (ECM) substrates using a single or combination of proteins. The method enables printing of ECM patterns in micron resolution with excellent reproducibility. We provide a step-by-step protocol and demonstrate how this can be applied to study the processes of neuronal pathfinding. LIMAP has significant advantages over existing micro-printing methods in terms of the ease of patterning more than one component and the ability to generate a pattern with any geometry or gradient. The protocol can easily be adapted to study the contribution of almost any chemical component towards cell fate and cell behavior. Finally, we discuss common issues that can arise and how these can be avoided.

Our overall aim is to understand how cells sense extracellular cues that lead to directed axonal growth. Here, we describe the methodology of Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins, used to produce defined micro-patterns of extracellular matrix components in order to study specific events that govern axon outgrowth and pathfinding.

Adsorção molecular induzida por luz de proteínas usando o sistema PRIMO para Micropadronização para estudar as respostas celulares às proteínas da matriz extracelular

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In addition, some features of dendritic spines, such as volume of the spine and post-synaptic density (PSD) (representing post-synaptic part of the synapse), presence of presynaptic terminal, and smooth endoplasmic reticulum or atypical form of PSD (e.g., multi-innervated spines), can be observed only with 3D EM. By employing serial block-face scanning electron microscopy (SBEM) it is possible to obtain 3D EM data easier and in a more reproducible manner than when performing traditional serial sectioning. Here we show how to prepare mouse hippocampal samples for SBEM analysis and how this protocol can be combined with immunofluorescence study of dendritic spines. Mild fixation perfusion allows us to perform immunofluorescence studies with light microscopy on one half of the brain, while the other half was prepared for SBEM. This approach reduces the number of animals to be used for the study.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) is applied to image and analyze dendritic spines in the murine hippocampus.

Microscopia eletrônica de varredura de blocos de bloco serial (SBEM) para o estudo de espinhas dendríticas

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In ...

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to use these cells for the purpose of studying the pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) in the rat hSOD1G93A model. First, the protocol shows how to isolate and culture astrocytes and microglia from postnatal rat cortices, and then how to characterize and test these cultures for purity by immunocytochemistry using the glial fibrillary acidic protein (GFAP) marker of astrocytes and the ionized calcium-binding adaptor molecule 1 (Iba1) microglial marker. In the next stage, methods are described for dye-loading (calcium-sensitive Fluo 4-AM) of cultured cells and the recordings of Ca2+ changes in video imaging experiments on live cells.
The examples of video recordings consist of: (1) cases of Ca2+ imaging of cultured astrocytes acutely exposed to immunoglobulin G (IgG) isolated from ALS patients, showing a characteristic and specific response compared to the response to ATP as demonstrated in the same experiment. Examples also show a more pronounced transient rise in intracellular calcium concentration evoked by ALS IgG in hSOD1G93A astrocytes compared to non-transgenic controls; (2) Ca2+ imaging of cultured astrocytes during a depletion of calcium stores by thapsigargin (Thg), a non-competitive inhibitor of the endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase, followed by store-operated calcium entry elicited by the addition of calcium in the recording solution, which demonstrates the difference between Ca2+ store operation in hSOD1G93A and in non-transgenic astrocytes; (3) Ca2+ imaging of the cultured microglia showing predominantly a lack of response to ALS IgG, whereas ATP application elicited a Ca2+ change. This paper also emphasizes possible caveats and cautions regarding critical cell density and purity of cultures, choosing the correct concentration of the Ca2+ dye and dye-loading techniques.

We present here a protocol on how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from rat cortices for time-lapse video imaging of intracellular Ca2+ for research on pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis in the hSOD1G93A rat model.

Culturas Primárias de Astrócitos de Rato e Microglia e Seu Uso no Estudo da Esclerose Lateral Amiotrófica

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature vibrations of molecules. However, these vibrational signatures are also characteristic of molecules within anatomical tissue such as the brain, making it increasingly useful and applicable for Neuroscience applications. For example, CARS can measure lipids by specifically exciting chemical bonds within these molecules, allowing for quantification of different aspects of tissue, such as myelin involved in neurotransmission. In addition, compared to other techniques typically used to quantify myelin, CARS can also be set up to be compatible with immunofluorescent techniques, allowing for co-labeling with other markers such as sodium channels or other components of synaptic transmission. Myelination changes are an inherently important mechanism in demyelinating diseases such as multiple sclerosis or other neurological conditions such as Fragile X Syndrome or autism spectrum disorders is an emerging area of research. In conclusion, CARS can be utilized in innovative ways to answer pressing questions in Neuroscience and provide evidence for underlying mechanisms related to many different neurological conditions.

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy CARS Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Visualizing myelination is an important goal for many researchers studying the nervous system. CARS is a technique that is compatible with immunofluorescence that can natively image lipids within tissue such as the brain illuminating specialized structures such as myelin.

Aplicação coerente de espectroscopia Raman anti-Stokes (CARS) para mielinização por imagem em fatias cerebrais

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature ...

Correlativa Luz e Microscopia Eletrônica para estudar interações Microglial com placas de beta-amilóide

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