Este estudo foi financiado pelo 1-FAC-2014-243-A-N JDRF, ADA 7-14-JF-07, NIH 5 P30 DK079638-05 piloto PJ e o Robert e Janice McNair Foundation.
Agradecemos a Sandra Pena e Andrene McDonald para o recrutamento de paciente, Samuel Blum para assistência técnica, Dr. George Makedonas pelo dom de controle usado para otimização de PCR de DNA e anticorpos.

1. identificar a população de células T de interesse.
 Nota: antígeno específica proliferação em combinação com tintura de divisão celular (como Carboxyfluorescein succinimidil éster, CFSE) pode ser usada para isolar as células T com base na sua proliferação em resposta à estimulação antigênica. Se a partir de PBMC, uma expansão de 7 dias em vitro deve ser suficiente para identificar um antígeno específico CFSE baixa população 12.
<ol><li>PBMCs mistura 1:1 com células MHC-combinados do alimentador e etiqueta com tintura de divisão celular 5 µM CFSE.</li>
	<li>Placa de 2 a 2,5 x 10 5 células por poço em um fundo redondo 96 poços cultura placa em 200 µ l 10% FCS completo RPMI mídia. 
	Nota: RPMI completa contém 2 mM l-glutamina, piruvato de sódio 1 mM, 100 µM MEM não essenciais aminoácidos, 5 mM HEPES, 5.5 × 10 &#8722; 5 unidades de 2-Mercaptoetanol, 100 mL de U &#8722; 1 penicilina e 100 µ g mL &#8722; 1 estreptomicina.</li>
	<li>Estimulam as células com antigénios de peptídeo 25 µM.</li>
	<li>No quarto dia da cultura, com cuidado, remova e substitua a 100 µ l de mídia. 
	Nota: Uma abordagem mais ideal para identificação de célula de T antígeno-específicas é o uso de peptídeo-HLA tetrâmeros 13. Tetrâmero coloração permite a avaliação simultânea de especificidade antigénica, bem como a restrição de HLA.</li>
</ol> 2. Configurar o tipo de célula única.
<ol><li>Executar todos os procedimentos em uma capa ou uma área livre de modelo amplificado. Alíquota os reagentes para evitar contaminação, limpe todas as superfícies de trabalho e, se for possível, o equipamento com 10% bleach antes da instalação do PCR. Use dicas de filtro, reagentes livre de RNAse e DNAse e plásticos em todos o PCR e o vetor de clonagem passos. Principais reagentes podem ser encontrados na Tabela de materiais. 
	Nota: A reação de PCR multiplex é altamente sensível, e baixos níveis de contaminação podem resultar em produto amplificado.</li>
	<li>Gerar o mix de transcrição reversa mestre combinando 10 x reação de RT do buffer, 25 X DNTPs, 9 enzima RT U, 0,01% Triton-X, inibidor de RNAse U 0,7 e 383 nM de cada primer RT-TCR (listado na tabela 1) em um reservatório de pipetagem estéril. Para cada placa de 96 poços, compõem suficiente mistura mestre para 10 reações adicionais (106 total), para compensar a perda de líquido durante a pipetagem. Consulte a tabela 2 para componentes de reação e montantes por bem.</li>
	Placa de <li>preparar uma coleção de PCR de 96 poços para célula Classificar por pipetagem µ l 6 da mistura mestre transcrição reversa por alvéolo com uma pipeta multicanal. Manter a placa no gelo ou em um bloco frio.</li>
	<li>Células com anticorpos de marcadores de superfície (tais como CD4 e CD3, ou CD8 e CD3, cada um em 2 µ g/mL, em combinação com tintura de divisão celular ou tetrâmero coloração) da pilha de rótulo.</li>
	<li>De células T do tipo em uma célula por alvéolo, ignorando a décima segunda fila, que servirá como um controle negativo. 
	Nota: A eficiência da classificação dependerá alinhamento de placa precisos coleção dentro do suporte da placa, bem como a manutenção das células e placas em uma baixa temperatura antes da reação de cDNA. Placas de coleção devem ser mantidas no gelo em todos os momentos, exceto durante a classificação, quando eles são fixos dentro da placa de resfriamento. Nem todos os classificadores estão equipados com um suporte de placa regulamentado de temperatura; no entanto, é altamente recomendável o uso de um. Desde que o tipo geralmente leva cerca de 10-15 min por placa, há um aumento potencial de degradação de RNA se a placa não é mantida a uma temperatura baixa.</li>
	<li>Como um controle positivo, adicionar um maior número de células (100) manualmente com uma pipeta para um dos poços nesta fase. Alternativamente, anteriormente isolado RNA das células em pool pode ser usado como controle positivo em 10 ng por alvéolo. 
	Nota: Pipetar controle purificado RNA com precisão e cuidado para evitar contaminação cruzada de outros poços e resultados falso-positivos.</li>
	<li>a placa com a película adesiva do selo e girar para baixo a 1000 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Imediatamente transcrever RNA de cDNA por incubar a placa a 25 ° C por 10 min, a 37 ° C por 45 min e 85 ° C por 10 min. 
	Nota: Para garantir a reação de PCR eficiente, é recomendável que a primeira reação de PCR seja realizada no mesmo dia. Alternativamente, as placas transcritas podem ser mantidas em-80 ° C por até 2 meses.</li>
</ol> 3. Realizar o PCR multiplex aninhada Nota: preparar todas as misturas de mestre numa área limpa livre de modelo para evitar contaminação.
Cartilha de <ol><li>reconstituir cada região variável de 100 µM com DNAse e RNAse livre H 2 O. Em seguida, combine 20 µ l de cada um dos 44 primers para gerar o pool de cartilha V-alfa. Para gerar o V-beta piscina cartilha combinar 20 µ l de cada um dos primers V-beta 40 e 80 µ l de DNAse e RNAse livre H 2 O. Primer sequências estão listadas na tabela 1. Uma vez reunidos, a concentração de cada primer na mistura é 2.3 µM.</li>
	<li>Reconstituir os primers região constante a solução estoque de 100 µM com DNAse e RNAse livre H 2 O. dilua os primers região constante 10 solução de trabalho µM e alíquota para uso.</li>
	<li>Preparar duas mixagens mestre separadas para amplificação de TCR-alfa e beta-TCR. Gerar as mixagens mestre combinando 5x buffer, pool de cartilha de 2 µM de dNTPs, 3% DMSO, 80 µM (concentração final de 46 nM para cada primeira demão), 200 nM TCR-constante região inversa da primeira demão, 1 U DNA-polimerase e DNAse e RNAse livre H 2 O (tabela 2 
	Nota: Os cálculos são baseados em volume final de 25 µ l por alvéolo, onde 22,5 mistura µ l de mestre-PCR é combinada com o modelo de cDNA 2,5 µ l PCR.</li>
	<li>Manter a placa com cDNA no gelo ou em um bloco frio. Use um multicanal para pipetar 22,5 µ l de reação de TCR-beta em uma nova placa PCR de 96 poços. Em seguida, use um multicanal para transferir 2,5 µ l de cDNA em placa de PCR.</li>
	<li>Usar um multicanal para pipetar 22,5 µ l de reação de TCR alfa diretamente para a placa contendo o restante do cDNA.</li>
	<li>Selar as placas com adesivo, delicadamente vórtice e rotação para baixo a 1000 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Executar a reação de PCR multiplex com os seguintes ciclos: 5 min a 95 ° C seguido de 34 ciclos de 20 s a 95 ° C, 30 s 54 ° c e a 1 minuto a 72 ° C, seguiram por 7 min em 72 ° C.</li>
	<li>Transportar para fora a reação de PCR aninhada em um volume final de 25 µ l, utilizando 2,5 µ l da mistura de PCR multiplex como modelo.
	<ol><li>Reconstituir os primers internos e adaptador de 100 µM com DNAse e RNAse livre H 2 O. fazer 10 µM alíquotas para as ações de trabalho.</li>
		<li>Preparar duas mixagens mestre separadas para TCR-alfa e beta-TCR amplificação. Mix 5 X tampão, 25 X DNTP, 3% DMSO, cartilha de adaptador frente 200 nM, 200 nM reversa aninhados primer, 1 U DNA polimerase e DNA polimerase e livre de nuclease H 2 O, para um volume final de 22,5 µ l (tabela 2). Para cada placa de 96 poços, compõem suficiente mistura mestre para 10 reações adicionais (106 total), para compensar a perda de líquido durante a pipetagem. 
		Nota: Na segunda utilização do PCR reação a 5 X PCR de buffer contendo corante de carregamento para facilitar o carregamento do gel do agarose.</li>
		<li>Usando um multicanal, pipetar as mixagens mestre para as reações de TCR-alfa e beta-TCR em 22,5 µ l por alvéolo em duas novas placas PCR de 96 poços.</li>
		<li>Adicionar o modelo de reação de PCR multiplex em 2,5 µ l por alvéolo. 
		Nota: A primeira reação de PCR restante deve ser selada e armazenada a-20 ° C, para servir como uma fonte de modelo adicional, se for necessário (ver passo Nota 4,3).</li>
		<li>Selar as placas, delicadamente vórtice e rotação para baixo a 1000 x g por 5 min em 4 ° C.</li>
		<li>Executar a reação de PCR aninhada com os seguintes ciclos: 5 min a 95 ° C seguido de 34 ciclos de 20 s a 95 ° C, 30 s a 56 ° C e 1 min a 72 ° C, seguiram por 7 min em 72 ° C.</li>
		<li>Executar 5 µ l da reação final para fora em uma agarose a 1% do gel contendo brometo de etídio (incluindo os poços de controle negativo e positivo). 
		Nota: A banda esperada deve ser executado em cerca de 500 tamanho de bp. Uma reação de exemplo é mostrada na Figura 2.</li>
		<li>Purificar o restante da segunda reação (20 µ l) usando um formato kit de purificação de PCR de 96 poços, eluir com 15 µ l de 70 ° C H 2 O por alvéolo e executar Sanger sequenciamento. Use o apropriado TCR-alfa ou beta-TCR adaptador frente primer para sequenciamento (tabela 1). 
		Nota: As sequências podem ser analisadas com software de Imunogenética disponível on-line.</li>
	</ol></li></ol> 4. Sub clonagem cadeias PCR alfa e beta.
 Nota: A piscina de frente primers utilizados na primeira reação e os primers reversos na segunda reação PCR são usados para incorporar sítios de restrição. Portanto, os obtidos alfa e beta da cadeia os produtos de PCR estão prontos para ser sequencialmente sub clonado no vetor retroviral modelo ( Figura 1).
Produtos <ol><li>Digest o PCR purificado do beta aninhada reação com BstbI e MfeI (tabela 3). 
	Nota: Não exceda 5 inserção µ g.</li>
	<li>Em paralelo, digerir o vetor modelo com BstbI e MfeI (tabela 3). Use 1-2 µ g do vetor modelo por TCR. Execute o vetor digerido em um gel de agarose e isolar a maior banda (~ 7500 bp). Purificar o vetor com um gel kit de purificação de DNA. 
	Nota: Durante a síntese da enzima de restrição, a região variável modelo murino TCR-beta é removido, permitindo a adição da região variável humana de TCR-beta.</li>
	<li>Purificar os produtos PCR digeridos usando um kit de purificação de PCR. 
	Nota: Verificar a capacidade de purificação de DNA das colunas incluídas no kit; Use várias colunas se necessário. A quantidade mínima de uma inserção purificada necessária para uma reação de sucesso da ligadura é 50 ng em uma concentração mínima de 10 ng / µ l. Se a quantidade de inserção purificado não é suficiente para uma bem sucedida da ligadura, a segunda reação de PCR pode ser repetida.</li>
	<li>Tratar o vetor modelo com 10 enzima U CIP para 1 h a 37 ° C para evitar Auto ligadura, seguida por inativação de calor durante 10 minutos a 75 ° C. Purify o DNA com um kit de purificação de PCR (tabela 3).</li>
	<li>Ligam TCR-beta inserir e vetoriais usando DNA ligase em um volume total de 20 µ l em 6 excesso molar da inserção por 30 min à temperatura ambiente. 
	Nota: No total, a reação da ligadura deve conter cerca de 150 ng de DNA (tabela 3).</li>
	<li>Para transformações, misture 8 µ l de reação da ligadura com 80 µ l de células quimicamente competentes de Escherichia coli DH5α (Tabela de materiais) e incubar no gelo por 30 min. choque térmico a 42 ° C por 45 s. µ l adicionar 500 Super Caldo ideal com Catabolite supressão (S.O.C) médio e agitar durante 1,5 h a 37 ° C.</li>
	<li>Placa fora 250 µ l de cultura bacteriana em uma ampicilina contendo placa de ágar caldo lisogenia (LB). Incubar a placa durante a noite (~ 16 h) a 37 ° C.</li>
	<li>No dia seguinte escolha colônias bacterianas e eles cresce meio de 3 mL LB contendo ampicilina durante a noite. Isolar o DNA do plasmídeo usando o kit de purificação de plasmídeo de DNA.</li>
	<li>Confirmar a inserção bem sucedida da cadeia beta de um teste em pequena escala-digest com as enzimas de restrição, BstbI e MfeI. Em um volume de reação total 12 µ l, combine 200-500 µ g plasmídeo, 0,25 µ l de cada enzima e buffer de enzima 10 X (tabela 3). Executar a reação fora em um gel de agarose 1% contendo brometo de etídio para confirmar o tamanho da banda inserir (~ 500 bp).</li>
	<li>Depois de confirmar a presença da inserção, sequenciar a seção TCR-beta do vetor usando o primer reverso IRES (tabela 1).</li>
	<li>Após a confirmação da sequência da inserção da TCR-beta, realizar um processo semelhante para a inserção da região variável alfa. Digerir os produtos PCR purificados da reação aninhada alfa e a inserção de TCR-beta recentemente gerada contendo o vetor, com SnaBI e SacII. 
	Nota: Durante a síntese da enzima de restrição, a região variável modelo murino TCR-alfa é removido, permitindo a adição da região variável de TCR-alfa humana.</li>
	Alfa <li>ligam insere-se em vetores TCR codificação correspondente região variável beta usando o ligase do DNA em um volume total de 20 µ l em 6 excesso molar da inserção por 30 min à temperatura ambiente. 
	Nota: No total, a reação da ligadura deve conter cerca de 150 ng de DNA (tabela 3).</li>
	<li>Para transformações, misture 8 µ l de reação da ligadura com 80 µ l de células quimicamente competentes de Escherichia coli DH5α (Tabela de materiais) e incubar no gelo por 30 min. choque térmico a 42 ° C por 45 s. adicionar 500 µ l S.O.C médio e agitar durante 1,5 h a 37 ° C.</li>
	<li>Placa fora 250 µ l de cultura bacteriana em uma ampicilina contendo placa de ágar caldo lisogenia (LB). Incubar a placa durante a noite (~ 16 h) a 37 ° C.</li>
	<li>No dia seguinte escolha colônias bacterianas e eles cresce meio de 3 mL LB contendo ampicilina durante a noite. Isolar o DNA do plasmídeo usando o kit de purificação de plasmídeo de DNA.</li>
	<li>Confirmar a inserção bem sucedida da cadeia alfa de um teste em pequena escala-digest com as enzimas de restrição, SnaBI e SacII. Em um volume de reação total 12 µ l combine 200-500 µ g plasmídeo, 0,25 µ l de cada enzima e buffer de enzima 10 x (tabela 3). Executar a reação fora em um gel de agarose 1% contendo brometo de etídio para confirmar o tamanho da banda inserir (~ 500 bp).</li>
	<li>Depois de confirmar a presença da inserção, sequenciar a seção TCR-alfa do vetor usando o primer MSCV2-para diante (tabela 1).</li>
	<li>Uma vez que a sequência de cadeia alfa é validada, verificar a completa inserção TCR de sequenciação com IRES-ré e TCR-beta-reverso primer (tabela 1).</li>
</ol> 5. Verifique se a expressão de superfície celular TCR e especificidade.
 Nota: HEK293T células são usadas para testar o sucesso TCR cadeia pariNG e célula de superfície de expressão ( Figura 3A) 8. Peptídeo-MHC tetrâmero coloração também pode ser realizada em células transfectadas HEK293T para testar para retenção de isolamento ( Figura 3B) gene TCR do post especificidade antigênica.
<ol><li>Placa HEK293T células em placas de cultura de tecidos de 12-poços em 1 x 10 5 células por poço em 1ml completa DMEM mídia contendo 5% FCS e cultura durante a noite a 37 ° C. Plate fora células suficientes para designou poços separados para cada nova TCR , controle modelo TCR vetor, CD3 vetor somente, controle vetorial TCR única e uma não-transfectadas bem. 
	Nota: Transfection com um totalmente rato modelo TCR vector (mTCR-pMIA) em combinação com mCD3εγδζ-pMIG vector, vector mTCR-pMIA sozinho, e mCD3εγδζ-pMIG vector sozinho são usados como controles positivos e negativos. 
	Nota: DMEM completa contém 2 mM 1 mM piruvato de sódio, L-glutamina, 100 µM não essenciais aminoácidos, 5 mM HEPES buffer, 5,5 x 10 -5 unidades de 2-Mercaptoetanol, 100 U/ml penicilina/estreptomicina.</li>
	<li>No dia seguinte, transfect as células com um reagente de transfeccao baseada em lipossomas, seguindo as instruções do fabricante, 1 vetor de CD3εγδζ-pMSCVII-GFP (pMIG) de rato µ g e 1 µ g quimérico h/mTCR-pMIA vetor.</li>
	<li>Para cada TCR, adicionar o reagente de transfeccao 6 µ l para 100 µ l da temperatura ambiente, DMEM isento de soro. Brevemente o vórtice e incubar a temperatura ambiente por 15 min.</li>
	<li>Em separado 1,5 mL tubos combinam 1 µ g de TCR-pMIA vector com 1 µ g do mouse CD3εγδζ-pMSCVII-GFP (pMIG) vetor, ou 1 µ g de cada vetor separado para controles.</li>
	<li>Dropwise, adicionar a solução DMEM/reagente de Transfeccao para os tubos contendo o DNA do vetor. Incubar a temperatura ambiente por 15 min.</li>
	<li>Dropwise, adicionar a solução de DNA/DMEM/reagente de Transfeccao para as células HEK293T. Bata levemente a placa para misturar. Incubar a 37 ° C por 24 h.</li>
	<li>Após 24 h substituir os meios de comunicação e manter as células em cultura para adicionais 24 h.</li>
	<li>Remover células da placa pipetando vigoroso e mancha as células com anticorpos de anti-rato CD3 (2,5 µ g/mL) para verificar a expressão de superfície de quimérico-TCR por citometria de fluxo.</li>
	<li>a fim de comparar a expressão CD3 entre células que foram transfectadas para um nível semelhante, portão a análise de células expressando um alto nível similar de moléculas de repórter fluorescente (GFP para complexo CD3 e Ametrine para vetor de expressão de TCR). Idealmente, a análise deve ser fechada na GFP + Ametrine + células dentro de 10 4 10 5 fluorescente intensidade ( Figura 3A). 
	Nota: O nível de expressão CD3 em células transfectadas com o constructo quimérico deve ser comparável do vetor de rato (modelo original) de controle ( Figura 3A). Vetores retrovirais TCR gerados são compatíveis com sistemas de expressão em vivo como descrito anteriormente 4.</li>
</ol>

<ol>
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Os autores não têm nada para divulgar.

O protocolo atual, descrevemos um método eficiente para amplificação de TCR unicelulares e subsequente sub clonagem de cadeias de alfa e beta TCR emparelhadas em um vetor retroviral expressão do modelo. Embora, desenvolveram-se vários protocolos PCR de célula única, nenhum até agora têm sido compatíveis com imediata sub clonagem em um vetor de expressão. Na maioria dos casos, uma sequência parcial, englobando as regiões CDR3 altamente variáveis é amplificada, com suficiente sequência de extrapolar a regi?...

O receptor de células T (TCR) dita decisão de destino T celular durante o desenvolvimento, estado estacionário/homeostase e estimulação antigênica na periferia1,2,3. Recente expansão de tecnologias de sequenciamento de profundidade descobriu uma diversidade TCR subvalorizada anteriormente dentro respostas de célula T específica do antígeno. Diversidade TCR sugere um potencial de respostas funcionalmente amplo de célula T. Para integrar a análise de repertório do TCR sequência com ensaios funcionais de TCR, as abordagens de sequenciamento devem ser projetadas para ser compatível com sistemas experimentais e na vivo modelos utilizados para posterior análise funcional de select TCRs. Desenvolvemos uma abordagem eficiente para o isolamento de sequência humana TCR e racionalizado sub clonagem em um vetor de modelo TCR quimérico humano/rato compatível com expressão de TCR em ratos HLA-humanizado4. Isolamento das correspondentes cadeias alfa e beta de heterodimérica TCRs requer amplificação por PCR de ambas as correntes de uma única célula. Apesar de vários protocolos TCR da célula única clonagem foram desenvolvidos e utilizados, nenhum até agora foram facilmente compatível com elevado-throughput simplificada clonagem direto do desconhecido Vα/Vβ TCRs em vetores retrovirais necessárias para re-expressão in vivo 4,5,6,7. Estudos anteriores já utilizaram duas abordagens principais, tanto para amplificar seletivamente uma parte limitada da TCR suficiente para extrapolar a sequência, ou amplificar a sequência TCR inteira4,5,6 , 7. análise funcional a jusante das sequências TCR, obtidos através da primeira abordagem requer dispendiosos em silico montagem e novo de construção da TCR. Enquanto a segunda abordagem fornece a sequência completa de TCR, região constante humana não é compatível com expressão na vivo das TCRs clonados em modelos do rato. Nossa abordagem é especificamente projetada para ser compatível na vivo análise funcional de TCRs em modelos do rato. Desenvolvemos uma única célula simplificada e eficiente protocolo PCR que permite o sub clonagem direto de fragmentos do PCR em vetor de expressão do modelo.
Nossa abordagem utiliza uma altamente sensível aninhada multiplex PCR reação é executada em duas etapas. Na primeira reação de multiplex passo uma de 40 primers específicos para todas as cadeias de V-beta e uma piscina de 44 primers específicos para todas as cadeias de V-Alfa são usadas para amplificar o TCR-alfa ou beta-TCR sem o conhecimento prévio da sequência (tabela 1). O primer para a frente tem uma sequência de adaptador, que é incorporada a 5' do produto do PCR. O primer reverso baseia-se na região constante da TCR. Nós identificamos sites única restrição que são ausentes de variável humana ou junção TCR regiões e incorporada no redesenhado TCRα e TCRβ primers (Figura 1). Na segunda reação aninhada, um primer específico para a sequência de adaptador e um primer reverso aninhado dentro da região constante são usados para amplificar ainda mais as cadeias TCR com maior especificidade (tabela 1, Figura 1). Após o isolamento de célula única, duas rodadas de PCR (reação de primeira com uma piscina de primers tanto Vα e Vβ e a segunda com primers adaptador) resultam em um produto PCR que pode diretamente ser sub clonado no vetor retroviral modelo. Construção de TCR final irá codificar, em uma moldura única leitura aberta (ORF), regiões variáveis humanas, combinadas com regiões de constante do mouse conectadas pela 'self chicotada' sequência de proteína, P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)8. A sequência de P2A tem sido usada em vários sistemas e foi extensivamente testada especificamente para a expressão de TCRs8,9,10,11. Embora, após tradução, a maioria dos restos sequência P2A anexada ao C-terminal da cadeia alfa, conectado por um vinculador flexível, enquanto a sequência de sinal de cadeia beta tem uma prolina adicional, esta alteração não tem nenhum efeito prejudicial na função TCR. A região constante do mouse é usada na construção em vez de humanos para evitar potenciais interações alteradas com componentes de sinalização downstream quando re-expressa em células de rato. O único ORF irá resultar em estequiométrico expressão separada da de9,de cadeias alfa e beta11. O protocolo atual é baseado em reagentes e abordagens que estão amplamente disponíveis e é projetado para ser executada de maneira otimizada e eficiente. Embora especificamente usamos essa técnica para ensaiar TCRs de células T auto-reativas implicadas na diabetes auto-imune, prevemos que este protocolo pode ser amplamente aplicável para identificação e avaliação funcional de humanos TCRs específicos para epítopos auto-imunes, câncer epítopos ou respostas a patógenos e vacinas.

<table><tbody><tr><td>CFSE&amp;nbsp;</td><td>eBioscience&amp;nbsp;</td><td>65-0850-84</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>anti-human CD4 (OKT4) BV421</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>317433</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-human CD3 (OKT3) PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>317336</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-mouse CD3 AF647</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>100322</td><td>2.5 mg/mL</td></tr><tr><td>Recombinant RNAse inhibitor biotech grd 2.5KU&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>97068-158</td><td>0.7 U</td></tr><tr><td>Applied Biosystems High capaity cDNA RT kit&amp;nbsp;</td><td>Invirtogen&amp;nbsp;</td><td>4368814</td><td>9 U (RT enzyme)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NF-H2O: Nuclease-free water 1000mL</td><td>Invirtogen&amp;nbsp;</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Gotaq DNA polymerase 2500U</td><td>VWR</td><td>PAM3008</td><td>1 U</td></tr><tr><td>96 Well Half Skirt PCR Plate</td><td>Phenix</td><td>MPX-96M2</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Clear Adhesive Film&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>4306311</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose&amp;nbsp;</td><td>Invirtogen&amp;nbsp;</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>SnaBI</td><td>New England Biolabs&amp;nbsp;</td><td>R0130</td><td>15 U (insert) 30 U (vector)</td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs&amp;nbsp;</td><td>R0157</td><td>40 U (insert) 80 U (vector)</td></tr><tr><td>MfeI</td><td>New England Biolabs&amp;nbsp;</td><td>R3589S</td><td>40 U (insert) 80 U (vector)</td></tr><tr><td>BstBI</td><td>New England Biolabs&amp;nbsp;</td><td>R0519</td><td>40 U (insert) 80 U (vector)</td></tr><tr><td>Calf Intestinal Phosphatase (CIP)</td><td>New England Biolabs&amp;nbsp;</td><td>M0290S</td><td>10 U</td></tr><tr><td>Quick ligase&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs&amp;nbsp;</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus minipreps DNA purification systems&amp;nbsp;</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>A1460</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus midipreps DNA purification systems&amp;nbsp;</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>A7640</td><td></td></tr><tr><td>DNA clean &amp;amp; concentrator-25 kit</td><td>Genesee Scientific&amp;nbsp;</td><td>11-304C</td><td></td></tr><tr><td>ZR-96 DNA clean &amp;amp; concentrator-5 kit</td><td>Genesee Scientific&amp;nbsp;</td><td>11-306A</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick gel extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>18265017</td><td></td></tr><tr><td>Transit LT-1 Reagent 1mL (transfection reagent)</td><td>Mirus&amp;nbsp;</td><td>MIR2300</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Aria II (sorter)</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Fortessa (flow cytometer)</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

streamlined single cell tcr isolation and generation of retroviral vectors for in vitro and in vivo expression of human tcrs

Embora, desenvolveram-se vários métodos de sequenciamento de emparelhados T cell receptor (TCR) alfa e beta cadeias de células T únicas, nenhum até agora têm sido propício à jusante na vivo análise funcional de TCR heterodímeros. Nós desenvolvemos um protocolo melhorado baseado em um Two-Step aninhada multiplex PCR, o que resulta em um produto PCR que abrange regiões inteiras de variável de um humano TCR alfa e beta cadeias. Identificando locais da limitação original e incorporando-os aos primers PCR, fizemos o produto do PCR compatível com sub clonagem direto para o vetor retroviral do modelo. A construção resultante retroviral codifica um quimérico humano/mouse TCR com um domínio intracelular do mouse, que é funcional em células de rato ou em modelos de rato na vivo . No geral, o protocolo descrito aqui combina humana única célula emparelhada TCR alfa e beta cadeia identificação com geração simplificada de vetores retrovirais facilmente adaptávelas para expressão de TCR in vitro e in vivo . O vídeo e o material que acompanha são projetados para dar uma descrição minuciosa da única célula PCR, para que os passos críticos podem ser seguidas e potenciais armadilhas evitadas. Além disso, nós fornecemos uma descrição detalhada das etapas necessárias para gerar o vetor de expressão clonagem. Uma vez dominado, todo o processo de célula única classificação a expressão TCR poderia ser realizado em um curto período de duas semanas.

A eficiência da reação de PCR multiplex aninhada é verificada na etapa 3.2.7 (Figura 2), a esgotar-se 5µL da segunda reação em um gel de agarose. Em média, a eficiência de amplificação de TCR-beta é esperada em cerca de 80%, enquanto a eficiência da reação de TCR-alfa é geralmente baixa, em torno de 50%4. Só emparelhadas cadeias TCR-alfa e beta-TCR podem ser usadas para a expressão de TCR; no entanto, todos os produto...

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Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

O atual combina de protocolo único celular emparelhado humana TCR alfa e beta cadeia sequenciamento com simplificada geração de vetores retrovirais compatíveis com expressão de TCR in vitro e in vivo .

Aerodinâmico única célula TCR isolamento e geração de vetores retrovirais para In Vitro e In Vivo de expressão de TCRs humanas

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have ...

streamlined-single-cell-tcr-isolation-generation-retroviral-vectors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

9.3K visualizações.  Baylor College of Medicine, Texas Children's Hospital. O atual combina de protocolo único celular emparelhado humana TCR alfa e beta cadeia sequenciamento com simplificada geração de vetores retrovirais compatíveis com expressão de TCR in vitro e in vivo .

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Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Transdução retroviral de receptor de células T no rato células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Imunologia e Infecção

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

Transdução retroviral de Células de Medula Óssea progenitoras para gerar células T Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

Gerando<em&gt; De Novo</em&gt; Antígeno-específica T Humano receptores celulares por Transdução retroviral de Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

Transdução retroviral de células T helper como uma abordagem genética para estudar mecanismos que controlam a sua diferenciação e função

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

Generation of Human Regulatory T Cell Clones

Human regulatory T cells (Treg) are notoriously difficult to isolate in high purity given the current methods of Treg enrichment. These methods are based on the identification of Treg through several activation-dependent cellular surface markers with varying expression levels in different physiologic and pathologic conditions. Populations isolated as &#8220;Treg&#8221; therefore often contain considerable numbers of non-Treg effector cells (i.e., Teff) which hamper the precise phenotypic and functional characterization of these cells, their genomic and proteomic characterization, their reliable enumeration in different states of health and disease, as well as their isolation and expansion for therapeutic purposes. The latter, in particular, remains a major hurdle, as the inadvertent expansion of effector cells homing in Treg-relevant cellular compartments (e.g., CD4+CD25+ T cells) may render Treg-based immunotherapy ineffective, or even harmful. This work presents a method that circumvents the problems associated with population-based isolation and expansion of Treg and shows that the generation of Treg candidate clones with the subsequent selection, culture, and expansion of only carefully vetted, monoclonal cells, enables the generation of an ultrapure Treg cell product that can be kept in culture for many months, enabling downstream investigation of these cells, including for possible therapeutic applications.

This protocol describes the cloning and expansion of human regulatory T cells for the generation of ultra-high purity viable human Treg with stable demethylation at the Treg-specific demethylated region (TSDR) and Treg-specific phenotypic features.

Human regulatory T cells (Treg) are notoriously difficult to isolate in high purity given the current methods of Treg enrichment. These methods are based ...

Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with hematological malignancies and are currently being investigated for various solid tumors. CAR-T cells are generated by removing T cells from a patient's blood and engineering them to express a synthetic immune receptor that redirects the T-cells to recognize and eliminate target tumor cells. Gene editing of CAR-T cells has the potential to improve safety of current CAR-T cell therapies and further increase the efficacy of CAR-T cells. Here, we describe methods for the activation, expansion, and characterization of human CRISPR-engineered CD19 directed CAR-T cells. This comprises transduction of the CAR lentiviral vector and use of single guide RNA (sgRNA) and Cas9 endonuclease to target genes of interest in T cells. The methods described in this protocol can be universally applied to other CAR constructs and target genes beyond the ones used for this study. Furthermore, this protocol discusses strategies for gRNA design, lead gRNA selection and target gene knockout validation to reproducibly achieve high-efficiency, multiplex CRISPR-Cas9 engineering of clinical grade human T cells.

Here, we present a protocol for gene editing in primary human T cells using CRISPR Cas Technology to modify CAR-T cells.

Produção de células CAR-T projetadas por CRISPR humanas

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with ...

Protocolo simplificado para geração de células CAR-T de camundongo em modelos singênicos

Efficient Generation of Murine Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T Cells

Engineered cell therapies utilizing chimeric antigen receptor (CAR)-T cells have achieved remarkable effectiveness in individuals with hematological malignancies and are presently undergoing development for the treatment of diverse solid tumors. So far, the preliminary evaluation of novel CAR-T cell products has predominantly taken place in xenograft tumor models using immunodeficient mice. This approach is chosen to facilitate the successful engraftment of human CAR-T cells in the experimental setting. However, syngeneic mouse models, in which tumors and CAR-T cells are derived from the same mouse strain, allow evaluation of new CAR technologies in the context of a functional immune system and comprehensive tumor microenvironment (TME). The protocol described here aims to streamline the process of mouse CAR-T cell generation by presenting standardized methods for retroviral transduction and ex vivo T cell culture. The methods described in this protocol can be applied to other CAR constructs beyond the ones used in this study to enable routine evaluation of new CAR technologies in immune-competent systems.

Autor em destaque: Melhorando a função das células CAR-T em modelos de tumores singênicos 

This protocol streamlines retroviral vector production and murine T cell transduction, facilitating the efficient generation of mouse CAR-T cells.

Geração Eficiente de Células T do Receptor de Antígeno Quimérico Murino (CAR)-T

Engineered cell therapies utilizing chimeric antigen receptor (CAR)-T cells have achieved remarkable effectiveness in individuals with hematological ...

Bioengenharia

<meta charset="utf8"></head><body>Transdução retroviral de RNA guia para edição de genes na diferenciação Th17

Retroviral CRISPR/Cas9-Mediated Gene Targeting for the Study of Th17 Differentiation in Vitro

T helper cells that produce IL-17A, known as Th17 cells, play a critical role in immune defense and are implicated in autoimmune disorders. CD4 T cells can be stimulated with antigens and well-defined cytokine cocktails in vitro to mimic Th17 cell differentiation in vivo. Research has been conducted extensively on the Th17 differentiation regulation mechanisms using the in vitro Th17 polarization assay.
Conventional Th17 polarization methods typically involve obtaining na&#239;ve CD4 T cells from genetically modified mice to study the effects of specific genes on Th17 differentiation and function. These methods can be time-consuming and costly and may be influenced by cell-extrinsic factors from the knockout animals. Thus, a protocol using retroviral transduction of guide RNA to introduce gene knockout in CRISPR/Cas9 knockin primary mouse T cells serves as a very useful alternative approach. This paper presents a protocol to differentiate na&#239;ve primary T cells into Th17 cells following retroviral-mediated gene targeting, as well as the subsequent flow cytometry analysis methods for assaying infection and differentiation efficiency.

<meta charset="utf8"></head><body>Direcionamento de genes mediados por CRISPR/Cas9 retroviral para o estudo da diferenciação Th17 in vitro

We present a protocol for retroviral transduction of guide RNA into primary T cells from Cas9 transgenic mice, providing an efficient alternative for gene editing in studying Th17 differentiation.

Direcionamento de genes mediados por CRISPR/Cas9 retroviral para o estudo da diferenciação Th17 in vitro

T helper cells that produce IL-17A, known as Th17 cells, play a critical role in immune defense and are implicated in autoimmune disorders. CD4 T cells ...

Aerodinâmico única célula TCR isolamento e geração de vetores retrovirais para In Vitro e In Vivo de expressão de TCRs humanas

Resumo

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Transdução retroviral de receptor de células T no rato células T

Transdução retroviral de Células de Medula Óssea progenitoras para gerar células T Receptor Retrogenic Mice

Gerando

Transdução retroviral de células T helper como uma abordagem genética para estudar mecanismos que controlam a sua diferenciação e função

Generation of Human Regulatory T Cell Clones

Produção de células CAR-T projetadas por CRISPR humanas

Geração Eficiente de Células T do Receptor de Antígeno Quimérico Murino (CAR)-T

Geração Eficiente de Células T do Receptor de Antígeno Quimérico Murino (CAR)-T

Geração Eficiente de Células T do Receptor de Antígeno Quimérico Murino (CAR)-T

Direcionamento de genes mediados por CRISPR/Cas9 retroviral para o estudo da diferenciação Th17 in vitro