Nosso protocolo de laboratório permite a combinação de edição de genoma humano com terapia celular CAR T. O procedimento laboratorial é a abordagem com o CRISPR-Cas9 para atingir até três genes com alta eficiência. E, finalmente, nossa abordagem é capaz de ser traduzida em testes clínicos em humanos.
Os métodos descritos podem ser aplicados a outras construções car e genes de destino. A base das técnicas são robustas o suficiente para serem traduzidas para maior escala e para colaboradores acadêmicos e industriais para o desenvolvimento posterior. Ao tentar este protocolo pela primeira vez, limite o número de grupos na tela RNA guia para permitir tempos precisos de incubação.
Aderindo às condições culturais e à densidade de semeaduras como descrito, provaram ser críticos em nossa experiência. Para começar, obtenha células mononucleares de sangue periféricos autólogos, ou PBMCs, de doadores voluntários saudáveis e isole células T positivas CD4 e CD8 usando kits de seleção cd4 e CD8 disponíveis comercialmente. Combine células T positivas cd4 e CD8 em uma proporção de um para um e incubar 3 milhões de células por mililitro em R10, complementados com 5 nanogramas por mililitro de cada IL7 humano e IL15 humano durante a noite a 37 graus Celsius.
No dia seguinte, conte as células T e centrífugas de 5 a 10 milhões de células a 300 vezes G durante cinco minutos. Descarte todos os supernascedores e lave a pelota celular em uma mídia essencial mínima de soro reduzido. Suspenda a pelota em 100 microliters de solução de afeto nuclear de acordo com as instruções do fabricante.
Durante a lavagem das células, prepare uma ribonucleoproteína, ou complexo RNP, incubando 10 microgramas de nuclease Cas9 com 5 microgramas de RNA guia único por 10 minutos à temperatura ambiente. Inclua um controle simulado sem RNA de guia único. Combine as células re-suspensas com o complexo RNP e adicione 4,2 microliters de quatro aprimoradores de eletroporação micromolar.
Misture bem e transfira para cuvetas de eletroporação. Eletroporar as células usando o código de pulso EH111, em seguida, incubar 5 milhões de células por mililitro em R10, complementado com 5 nanogramas por mililitro humano IL7 e IL15 humano a 30 graus Celsius por 48 horas em 12 placas de poço. Após a incubação, prossiga com ativação e expansão de células T.
Projete os primers de sequenciamento inserindo a sequência da amplicon PCR em um software de design primer padrão. O software de design sugerirá várias sequências de primer adequadas para sequenciamento Sanger. Escolha primers para frente e reverso que se unam com o amplicon pelo menos 150 pares de base rio acima ou rio abaixo do local de corte gRNA para garantir uma boa qualidade de sequenciamento em torno dos indels.
Use a análise TIDE para detectar a eficiência do nocaute no nível genômico. O algoritmo reconstrói com precisão o espectro de indels a partir dos traços de sequência e calcula os valores quadrados R. Após a ativação, as células T são expandidas na cultura e criopreservadas para estudos futuros.
Durante a expansão, a duplicação populacional e as mudanças de volume são acompanhadas ao longo do protocolo tanto para células CAR T simuladas quanto editadas. Não foram detectadas alterações significativas na proliferação e ativação durante a expansão. Uma vez que as células foram criopreservadas, os níveis de expressão CAR foram determinados para estudos funcionais adicionais tanto para as células CAR T simuladas e knockout.
Não foram observadas alterações significativas. A eficiência do nocaute pode ser determinada usando múltiplas técnicas. Nestes gráficos representativos de citometria de fluxo, os locis PDCD1 e TRAC foram direcionados usando RNA de guia único, mostrando uma eficiência de 90% para o RNA guia único PDCD1 e 98% para o TRAC guia único RNA em vários doadores saudáveis.
É importante ter certeza de que as relações molares de Cas9 e guiar RNAs são precisas. Durante o procedimento, as células devem ser sempre mantidas a quatro graus Celsius e não serem deixadas na solução de eletroporação por longos períodos de tempo. Após a preservação do CAR, as células CAR T projetadas pelo CRISPR podem ser usadas para ensaios funcionais in vitro e in vivo, como ensaios de citotoxicidade, produção de citocinas e modelos de camundongos tumorais sintéticos ou xenógrafos.
Nossa abordagem usando a tecnologia CRISPR Cas9 está sendo aplicada a testes clínicos. A abordagem pode ser usada tanto para o câncer, quanto para uma doença genética não maligna, como hemoglobinofias, que afetam milhões de crianças e adultos em todo o mundo.
