NMvD thanks Dr. Michael Reichelt (Max-Planck-Institute for chemical Ecology, Jena, Germany) for providing the first reference samples when she started using this method 16 years ago. Ciska Raaijmakers (NIOO-KNAW, Wageningen, the Netherlands), Sebastian Krosse (B-Ware, Nijmegen, the Netherlands), and Christian Ristok (iDiv, Leipzig) are acknowledged for improving the protocol over the course of the years. Mirka Macel and Martine Huberty (University T&#252;bingen, Germany) are acknowledged for their permission to use the Rorippa chromatogram. The authors gratefully acknowledge the support of the German Centre for Integrative Biodiversity Research (iDiv) Halle-Jena-Leipzig, funded by the German Research Foundation (FZT 118).

1. Preparação de soluções necessárias para o glucosinolatos Extração <ol><li> Preparar 500 ml de metanol a 70% (MeOH) em água (ultrapura) num frasco de vidro. Para amostras de 100 e 5 padrões, 420 mL de 70% MeOH é necessário. </li><li> Preparar 20 mM de acetato de sódio (NaOAc) (pH = 5,5) pela adição de 0,82 g de NaOAc ou 1,36 g de NaOAc x 3 H2O em 500 mL de água; ajustar o pH com ácido clorídrico (HCl). Armazenar o NaOAc na geladeira. Para amostras de 100 e 5 padrões, 370 mL de NaOAc 20 mM (pH = 5,5) em água é necessária. </li><li> Para preparar o material da coluna, misturar 10 g de gel de dextrano reticulado (tipo G-25) com 125 ml de água ultrapura. Armazenar a mistura resultante no frigorífico (4 ° C). </li><li> Preparação da solução de sulfatase <ol><li> Dissolve-se 10.000 unidades de sulfatase de arilo (tipo H-1 a partir de Helix pomatia) em 30 ml de água ultrapura e adicionar 30 mL de etanol absoluto (EtOH). Misture bem a solução e transferi-lo para um CEN 250 mltubo trifuge ou vários tubos menores, dependendo da disponibilidade. </li><li> Centrifugar a mistura a 2650 xg durante 20 min à temperatura ambiente (RT). Transferir o sobrenadante (s) para uma proveta; adicionar 90 ml de EtOH e misturá-lo. Centrifugar a mistura em um ou mais tubos de centrifugação a 1030 xg durante 15 min à temperatura ambiente. </li><li> Descartar o sobrenadante. Dissolve-se e combinar os microgrânulos num total de 25 ml de água ultrapura. Vortex bem, dispensar em 1 ml tubos, e armazenar em um congelador a -20 ° C; eles vão manter por pelo menos um ano. </li></ol></li><li> Preparação da solução de referência sinigrin <ol><li> Pesa-se cerca de 9 mg de mono-hidrato de sinigrin com 1? G de precisão (por exemplo, 8,769 mg). Transferi-la para um balão volumétrico de 10 ml e dissolve-se o mono-hidrato de sinigrin em 10,0 ml de água ultrapura. </li><li> Calcula-se a molaridade da solução de estoque e preparar cinco referências sinigrin entre 50-750 uM por diluição da solução-mãe. Para um exemplo detalhado, consulte<html> <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/20160918GrosservanDamJoVEGlucosinolates_S1.docx" target="_blank">Suplementar S1 arquivo</a> . </li><li> Dispensar a diferentes referências sinigrin em tubos de reacção de 1,5 mL e congelá-los a 20 ° C. Incluem uma série de cinco referências sinigrin em cada lote de extracção. Sempre use os valores molarity corretos para o usado atualmente sinigrin referências ao calcular as concentrações. </li></ol></li></ol> 2. Preparação do Setup Extração <ol><li> Prepara-se uma coluna de cremalheira para as colunas pipeta de Pasteur (para a preparação de colunas, ver passo 3.1). Rotular o rack ou as colunas para manter o controle dos números de amostra (ver Figura 1). </li><li> Preparar um bloco que prende o mesmo número de tubos de microcentrífuga rotulados de 2 ml (ver passo 3.3 e a Figura 1) </li></ol>5 / 55425fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Rack para extração de glucosinolatos. Vista frontal (esquerda) e vista de cima (direita) de um rack coluna self-made e bloqueio para a extração de glucosinolatos. Altura: 100 mm, a distância entre os orifícios deslocados (para segurar as colunas pipeta de Pasteur): 30 mm (eixo X) x 15 mm (eixo dos y). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 3. Preparação das Colunas e microtubos <ol><li> Prepare uma coluna por amostra e cinco colunas extras para as cinco amostras de referência sinigrin. <ol><li> Em cada pipeta de vidro, coloque um pedaço de lã de vidro cerca de 1 cm x 1 cm. Utilizar um pedaço de madeira ou de vidro para empurrar a lã de vidro para baixo para o ponto em que a pipeta se estreita. A lã de vidro deve impedir que o material da coluna de esgotar-se, mas não use demais, uma vez que irá retardar a eluição das colunas. Usar luvas de when trabalhando com a lã de vidro. </li></ol></li><li> Colocar as colunas na cremalheira coluna (ver Figura 1). Coloque o rack coluna em um (a bandeja de resíduos) bandeja de laboratório para pegar os eluentes usados ​​para as lavagens da coluna consecutivos. </li><li> Cortar os primeiros 5 mm da ponta de uma ponta de pipeta de plástico de 1 ml e pipeta 0,5 ml de material da coluna preparada (G-25 de gel em água, ver passo 1.3) em cada coluna. Agitar o frasco contendo o material da coluna bem antes de pipetar. Descartar colunas vazamento (materiais G-25 a esgotar-se através da camada de lã de vidro) e substitua por novas. <ol><li> Após pipetar o material da coluna para as colunas, adicionar 1 ml de água ultrapura para lavar para baixo o material. </li></ol></li><li> Preparar um tubo de reacção de 2 ml por amostra e cinco tubos para as cinco amostras de referência sinigrin; classificá-los. Use uma agulha de dissecação para fazer furos nas tampas para depois de liofilização e colocar os tubos preparados para o bloco de tubos no mesmo padrão exato como ocolunas (passo 2.2, ver Figura 1). </li></ol> 4. Extracção do Glucosinolatos <ol><li> Pesar liofilizado e material vegetal finamente moído (geralmente 50,0-100,0 mg de peso seco; as concentrações finais de glucosinolato no extracto deve estar na gama da curva de referência) com a aproximação de 0,1 mg em 2 ml, marcado, rodada -bottom tubos de reacção. Adicionar duas pequenas bolas de metal (3 mm de diâmetro) como retardadores de ebulição para cada tubo. NOTA: O protocolo também pode ser aplicado aos materiais frescos, congelados rapidamente, que foram triturados em azoto líquido e mantido congelado até à extracção. Aumentar a quantidade de material pesado para a extracção e a percentagem de MeOH em líquido de extracção a 85% para compensar a diluição pela água no material 19. </li><li> Pipete 1 mL de 70% de MeOH em cada tubo e agitar com vortex brevemente. Feche os tubos e selá-los com tampas de segurança antes de colocá-los tão rapidamente quanto possível em um hot water banho (90-92 ° C) por alguns minutos (~ 5 min), até o 70% MeOH apenas ferve. Cuidado: Use óculos de segurança durante esta etapa! </li><li> Colocar os tubos de ensaio num banho de ultra-sons durante 15 min. Enquanto isso, pegue a sulfatase e as cinco amostras de referência sinigrin fora do congelador para descongelar-los à temperatura ambiente. </li><li> Após a ultra-sonicação, centrifugar os tubos de amostra em 2.700 xg numa centrífuga de bancada durante 10 min à temperatura ambiente; um sedimento deve formar em cada tubo. Adicionar o sobrenadante para as colunas rotuladas e pipeta as amostras de referência de cinco em colunas separadas. <ol><li> Enquanto pipetando os sobrenadantes, manter a ponta bem acima do pellet para evitar materiais vegetais pipetagem. Note-se que quando as amostras secas são utilizadas, o volume de sobrenadante será menor do que 1,0 mL. </li></ol></li><li> Adicionar 1 mL de 70% MeOH para os peletes remanescentes nos tubos de amostra e os tubos vortex antes de os colocar num banho de ultra-sons durante 15 min. Centrifugar os tubos novamente, tal como no passo 4.4, e adicionar a supernates às respectivas colunas; devido às propriedades do material da coluna, o grupo sulfato carregados negativamente dos glucosinolatos será especificamente retidos na coluna. </li><li> Lavar as colunas com os extratos em três etapas sequenciais. <ol><li> Pipeta 2 x 1 mL de 70% de MeOH em cada coluna. Aguarde até que a coluna para secar antes de adicionar os próximos 1 mL; este vai remover mais compostos a partir dos extractos apoiares (por exemplo, clorofila). </li><li> Lave o MeOH por adição de 1 ml de água ultrapura para cada coluna. </li><li> Pipeta de 2 x 1 mL de 20 mM NaOAc tampão para cada coluna para criar as condições ideais para a reação sulfatase. </li></ol></li><li> Leve o rack com as colunas para fora da bandeja de resíduos e secar os pés do rack com um lenço de papel. Coloque o rack sobre o bloco com frascos e tubos rotulados. Certifique-se de que cada ponta coluna é na correspondente, marcado, tubo de 2 mL (ver Figura 1). </li><li> Adicionar 20 ul de soluti sulfataseem que as colunas. Certifique-se de que a sulfatase atinge a superfície do material da coluna. Pipeta de 50 mL de NaOAc tampão em cada coluna para jogar na sulfatase. Cubra as colunas com folha de alumínio e deixe descansar durante a noite. NOTA: Devido às actividades da sulfatase, o grupo sulfato vai ser removido, libertando os desulfoglucosinolates a partir da coluna de modo que eles podem eluir com água. Para uma descrição detalhada, consulte Crocoll et al. 19. </li><li> No dia seguinte, as eluir desulfoglucosinolates pipetando 2 x 0,75 ml de água ultrapura para cada coluna. Quando todas as colunas secaram, levante o rack de coluna e removê-lo a partir dos tubos de reacção. <ol><li> Tampe os tubos (certifique-se de que existem furos nas tampas) e congelá-los em nitrogênio líquido ou em -80 ° C congelador por 30 min. Liofilizar as amostras durante 12-24 horas (dependendo do número de amostras e a capacidade do liofilizador) para remover toda a água. </li></ol></li> &lt;li&gt; Após liofilização, re-dissolve-se o resíduo num volume exacto (normalmente 1,0 mL) de água ultrapura. Transferir as amostras e as cinco referências sinigrin para frascos de HPLC rotulados. Manter as amostras no frigorífico (4 ° C) durante até duas semanas ou de um congelador (-20 ° C) durante até um ano antes de analisar os com HPLC. </li><li> Deixe o vidro secar colunas sob o capô durante a noite e descartá-los quando seca. Recuperar as bolas de metal dos tubos de amostra utilizados no passo 4,5 para reutilização e colocar os tubos no escaninho da eliminação de resíduos. </li></ol> 5. As medições de HPLC de amostras extraídas <ol><li> Separa-se os glucosinolatos em um de fase inversa C 18 coluna (4,6 x 150 mm, 3 um, 300 A) com um gradiente de acetonitrilo-água (ver Tabela 1) e um fluxo de 0,75 mL / min e uma temperatura de coluna de 40 ° C . Realizar a detecção e quantificação a 229 nm. </li><li> Meça as referências sinigrin na mesma coluna, mas com um gradiente adaptadaMétodo para reduzir a utilização de solventes (ver Quadro 2). Começar com cinco injectando as referências sinigrin, começando com o de referência com a concentração mais baixa. Em seguida, injectar as amostras, incluindo uma injecção de metanol (em branco) depois de cada amostra X para limpar a coluna e para evitar o arrastamento de picos. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Tempo [min] </td><td> Fluxo [mL / min] </td><td> % Uma água </td><td> % B ACN </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0,750 </td><td> 98 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 35 </td><td> 0,750 </td><td> 65 </td><td> 35 </td></tr><tr><td> 40 </td><td> 0,750 </td><td> 98 </td><td> 2 </td></tr><tr><td colspan="4"> Temperatura da coluna 40 ° C. </td></tr></tbody></table> Tabela 1: gradiente de acetonitrilo-água para a separação de glucosinolatos e analysis em HPLC de fase inversa. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Tempo [min] </td><td> Fluxo [mL / min] </td><td> % Uma água </td><td> % B ACN </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0,750 </td><td> 98 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 0,750 </td><td> 89,3 </td><td> 10,7 </td></tr><tr><td> 11 </td><td> 0,750 </td><td> 98 </td><td> 2 </td></tr><tr><td colspan="4"> Temperatura da coluna 40 ° C. </td></tr></tbody></table> Tabela 2: encurtado gradiente de acetonitrilo-água para a quantificação dos cinco referências sinigrin utilizados para a quantificação de glucosinolatos. 6. glucosinolatos identificação e quantificação <ol><li> Identificação <ol><li> Comparar os tempos de espectros de UV e de retenção dos picos nas amostras com sucesso comercialmentecapazes, referências glucosinolatos puros. Veja a Figura 2 para exemplos de espectros de UV das várias classes de glucosinolatos. </li><li> Identificar glucosinolatos desconhecidos com padrões de referência ou em LC-MS 18, 19, se possível. </li><li> Identificar glucosinolatos desconhecidos com ressonância magnética nuclear (RMN), se possível. </li><li> Comparar os tempos de espectros de UV e de retenção dos picos com aqueles na Figura 2 e Tabela referências 3, bancos de dados, ou da literatura. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55425/55425fig2.jpg" /> Figura 2. Os espectros de UV das classes mais comuns de glucosinolato. UV espectro de absorção (200-350 nm) de seis desulfoglucosinolates (GSL), com base em soluções feitas de compostos de referência disponíveis comercialmente extraídos, conforme descrito aqui, representando as classes estruturais mais comuns. O nome comum, snome tructural (entre parênteses), e classe estrutural são dadas. (A) sinigrin (2-propenil GSL), alcenilo; (B) glucoerucin (4-metiltiobutilo GSL), thioalkenyl; (C) glucorafanina (4-methylsulfinlybutyl GSL), sulfinilo; (D) glucobrassicina (indol-3-ilmetil GSL), indole; (E) gluconasturtiin (2-feniletil GSL), aromático; (F) sinalbin (4-hidroxibenzil GSL), aromático. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol start="2"><li> quantificação <ol><li> Integrar a área sob os picos dos cinco referências sinigrin e as amostras. </li><li> Calcular uma curva de calibração das cinco referências sinigrin medidos com base na área integrada. Use a equação da linha de regressão (ver Equação 1) para calcular o valor interpolado de glucosinolatos (ver Equação 2).</li><li> Para calcular a concentração dos diferentes glucosinolatos, multiplicar o valor interpolado (x) pelo factor de resposta (M) para a detecção a 229 nm a partir de CE (1990) 16, de Buchner (1987) 15, ou Brown et ai. (1993) 17; os factores de resposta de consenso da desulphoglucosinolates mais vulgarmente detectados são dadas na Tabela 3. NOTA: Os factores de resposta pode variar entre sistemas de esta pode ser a razão que existem diferentes valores dados por diferentes referências (ver Referências 15-17). No entanto, os valores são na sua maioria muito estreita e em uma escala semelhante com classes estruturais. Seguindo a convenção, definir o factor de resposta de glucosinolatos não identificados como 1, embora para glucosinolatos de indolo desconhecidos com um espectro de UV semelhante ao do glucobrassicina e outros glucosinolatos de indolo (Figura 2), que seria aconselhável a utilização de 0,25, como um factor de resposta para se obteruma estimativa realista da concentração (Tabela 3). </li><li> Para calcular o montante final da glucosinolatos (x t) na amostra, tomar o fator de diluição (D) e da massa de amostra (w) utilizados para a análise em conta (ver Equação 3). <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/55425/55425eq1.jpg" /> (1) <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/55425/55425eq2.jpg" /> (2) <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/55425/55425eq3.jpg" /> (3) Y = área do pico m = declive da curva de regressão de referência de 5 pontos c = a intercepção da linha de regressão com o eixo y X = quantidade de glucosinolatos no extrato x T = concentração de glucosinolatos na amostra planta D = factor de diluição H = factor de resposta para a detecção a 229 nm a partir de Buchner (1987) ou Brown et ai. (1993) w = massa de amostra utilizada para a extração </li></ol></li></ol>

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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+and+systemic+induced+responses+to+cabbage+root+fly+larvae+(Delia+radicum)+in+Brassica+nigra+and+B.+oleracea.">Local and systemic induced responses to cabbage root fly larvae (Delia radicum) in Brassica nigra and B. oleracea.</a> Chemoecology. 16 (1), 17-24 (2006).</li><li>Gols, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+changes+affect+plant+chemistry+and+tritrophic+interactions.">Temporal changes affect plant chemistry and tritrophic interactions.</a> Bas Appl Ecol. 8 (5), 421-433 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

As maiores vantagens deste método estabelecido e amplamente utilizado é que ela é robusta, bastante simples e relativamente de baixo custo por amostra. A maior parte do equipamento necessário para a extracção e análise devem estar disponíveis em um padrão de laboratório ou podem ser auto-construído, com a excepção de o HPLC-PDA. Outra vantagem é que desulfoglucosinolates dissolvidos em água são quimicamente muito estável quando mantido frio e em (HPLC) frascos hermeticamente fechados, de modo que os extractos poderia ser facilmente enviado para análise por HPLC em outro lugar. Em contraste com plataformas LC-MS, que exigem formação e vasta experiência prática para a gestão do software e análise de dados especializados, HPLC-UV / PDAs pode ser facilmente executado depois de um curto período de treinamento. Isto não só reduz os custos do processo, mas também torna este método mais acessível para uma ampla gama de cientistas, incluindo estudantes. Geralmente, quando os procedimentos descritos acima são seguidos carefully, alguns problemas devem ocorrer. Em geral, os picos de glucosinolato são muito bem separados no cromatograma. Se este não for o caso, o programa de gradiente pode ser adaptado por diminuir a taxa de aumento de acetonitrilo no eluente. Em alternativa, a construção de uma nova pré-coluna (200-500 injeções) ou coluna (1.500 -2.000 injeções) podem resolver o problema. Ocasionalmente, cromatogramas de amostras únicas em um lote pode mostrar muito pequeno ou nenhum pico. Isto é geralmente devido a erros de pipetagem ao adicionar o sulfatases (por exemplo, uma coluna foi ignorado ou a sulfatase não foi devidamente lavado para dentro da coluna). Alternativamente, a concentração de glucosinolatos nos materiais experimentais pode ter sido menor do que o esperado e muito pouco material foi utilizado para a extracção. Se este for o caso, o volume de injecção pode ser aumentada para 100? L, ou uma alíquota exacta (por exemplo, 800 ul) de o extracto pode ser concentrado. Esta última poderia ser conseguida por congelamento-secoing o extracto, dissolução do resíduo num volume mais pequeno (por exemplo, 100 mL) de água, e reinjecção usando a mesma curva de referência. Nos cálculos para a concentração original do extrato, os números devem ser multiplicados pelo factor de diluição. Se isto não resolve o problema, os materiais devem ser extraídas novamente utilizando mais material de partida. Se este é mais do que 100 mg, o volume dos solventes de extracção e o tamanho dos tubos deve ser ajustado proporcionalmente para manter a eficiência da extracção. Uma vantagem adicional é que este método tem sido bem validada. Isso é porque ele tem sido descrito como um método padrão para a quantificação dos glucosinolatos em colza, para os quais os procedimentos e precisão foram confirmadas em vários laboratórios 16. Além disso, o fundo genético, a biossíntese, e as funções biológicas de glucosinolatos estão sujeitos a esforços intensos de investigação, no model espécies de plantas de Arabidopsis thaliana, entre outros 4, 6, 12. Por isso, muitos factores de resposta para a quantificação exacta de desulfoglucosinolates em relação ao sinigrin são bem definidas e divulgadas publicamente 15,17. Apesar de protocolos baseados no LS-MS são mais de alto rendimento, mais sensível, e são capazes de (tentativamente) identificar glucosinolatos para os quais não há padrões estão disponíveis 18, 19, 20, a falta de factores de resposta universais para LC-MS limita o quantificação exacta das concentrações de glucosinolatos 18. Além disso, estes métodos geralmente não inclui um passo de liofilização, e a quantidade de água no material de planta fresco é desaparecidos nos cálculos, tornando difícil a quantificação exacta. Por último, porque o nosso método de extração envolve uma base colunapurificação e o passo de concentração, que também pode ser aplicado a amostras &quot;sujas&quot; com baixas concentrações de glucosinolatos, tais como solos 21. Em comparação com os métodos baseados em LC-MS, que normalmente extrair recém materiais congelados, utilizam placas de 96 poços, durante a extracção, e não incluem um passo de sulfatase 18, 19, o nosso método é relativamente moroso e de trabalho intenso. Com as prateleiras de coluna descritas neste documento, uma única pessoa pode extrair cerca de 100-150 amostras em um dia. Eluição (dia seguinte), congelar secagem (overnight), e re-dissolução pode ocorrer nos dois dias seguintes. Com um injector automático HPLC, uma corrida e equilíbrio de tempo de 40-45 minutos por injeção, e sem imprevistos, levaria 3-4 dias para obter os dados para este conjunto de amostras. Quando o software de HPLC permite a quantificação automático com base na curva sinigrin, uma verificação manual dos cromatogramas e PEatribuições ak para 100 amostras só pode tomar outro 1 ou 2 h antes de os dados podem ser usados ​​para análises estatísticas. Apesar da crescente disponibilidade de padrões de glucosinolatos, apenas uma pequena fração dos mais de 130 candidatos atualmente pode ser comercialmente comprado. No entanto, com algumas referências para cada uma das classes biossintéticas; acesso a bases de dados de literatura que especifiquem os compostos anteriormente encontrados nas espécies de plantas (por exemplo, Fahey et al 22.); conhecimento básico dos princípios cromatograf icos, tais como a lógica de série eluotropic (por exemplo, para um número crescente de Cs na cadeia lateral nos compostos alifáticos, as Figuras 3 e 4); e a validação de amostras simples de LC-MS 19 ou glucosinolatos isolados no RMN 23, pode-se facilmente ultrapassar esta limitação. A maioria dos protocolos de glucosinolatos analisa usar curvas de referência internos(Isto é, uma certa concentração para a extracção de sinigrin ou sinalbin para a extracção por solvente 16, 17, 19). Principalmente, as curvas de referência internos são mais apropriadas para corrigir erros de processamento de amostras individuais e, assim, teoricamente, produzir uma maior precisão. Apesar desta vantagem, é preferível utilizar uma curva de referência externo de cinco pontos, como frequentemente analisar diferentes espécies selvagens, alguns dos quais contêm níveis elevados de sinigrin (por exemplo, Brassica nigra 24) ou sinalbin (por exemplo, Sinapis alba 25), o duas referências glucosinolatos para o qual factores de resposta estão disponíveis. Além disso, a adição de padrões internos a cada amostra, aumenta o custo das análises, como padrões de referência de alto grau de glucosinolatos são geralmente muito caros. Em conclusão, apesar das etapas demoradas, este protocoloproporciona um método simples e acessíveis para extrair glucosinolatos e quantificar em amostras de plantas. No entanto, é importante considerar que os níveis de glucosinolato em si são apenas uma indicação do potencial de actividade biológica, visto que a necessidade de reagir com mirosinase, e a variação nos produtos de reacção pode surgir a partir de uma única glucosinolatos 11. Os ensaios de validação devem ser realizados para confirmar a relevância biológica.

Estima-se que as plantas produzem mais de 200.000 diferentes tipos de compostos químicos 1. Apenas uma minoria destes composto parece desempenhar um papel no metabolismo primário das plantas, o qual alimenta o crescimento e reprodução; a maioria são os chamados metabólitos secundários. Apesar do seu nome, metabólitos secundários são frequentemente críticos para a sobrevivência e reprodução das plantas, uma vez que servem para atrair polinizadores ou para defender a planta contra patógenos e herbívoros 1. Glucosinolatos são uma classe muito diversificado de metabólitos secundários que têm sido estudados há mais de 150 anos 2. Até à data, mais de 130 glucosinolatos estruturalmente diferentes foram identificados 3. Em termos gerais, os glucosinolatos pode ser subdividida em classes diferentes com base no aminoácido a partir do qual eles são sintetizados. glucosinolatos de indolo, por exemplo, são sintetizados a partir do aminoácidotriptofano, fenilalanina Considerando que proporciona o esqueleto de base para a síntese de 4 glucosinolatos aromáticos. Nas classes, há um elevado grau de diversidade estrutural, que é provocada por etapas sequenciais de alongamento da cadeia em vias biossintéticas, tais como na classe de glucosinolatos alifáticos, ou por modificações da cadeia lateral (por exemplo, hidroxilação) 4, 5. Uma das espécies de plantas em glucosinolatos pode conter até 37 glucosinolatos diferentes pertencentes a diferentes classes estruturais 6. Apesar de espécies de plantas têm perfis glucosinolatos típicos, variação intraespecífica para os tipos de glucosinolatos é freqüentemente encontrada entre os indivíduos e populações 6, 7. Glucosinolatos intactos são armazenados nos vacúolos das células vegetais e podem ser encontrados em nenhum dos órgãos acima do solo ou abaixo do solo 7, &lt;sup class = &quot;xref&quot;&gt; 8, 9. Após a ruptura de células (por exemplo, por herbivoria), glucosinolatos são liberados e são misturados com a enzima mirosinase, desencadeando uma bomba de óleo de mostarda 10. Devido à actividade de mirosinase, e, dependendo da estrutura do glucosinolato, as condições de reacção, e a presença de enzimas modificadoras, diferentes compostos pungentes, tóxicas ou nocivas são formados, tais como nitrilos e (iso) tiocianatos 11. Os produtos de reacção têm altas actividades biológicas; por exemplo, eles servem como repelentes de insetos herbívoros generalistas 12. A hereditariedade e biossintéticas vias de glucosinolatos são bem estudadas, principalmente por causa de sua importância para herbívoro e resistência de patógenos, seu valor como componentes de sabor em mostardas e couves, e sua negativa (progoitrin) e efeitos positivos (glucoraphanin) na saúde humana 5, </sup&gt; 13, 14. Por causa do grande interesse em glucosinolatos como compostos, métodos biologicamente activas de extracção e detecção com base em cromatografia líquida de alta pressão de fase inversa (HPLC), equipado com radiação ultravioleta (UV) ou o agrupamento de fotodíodos (PDA) detectores de ter sido utilizada desde a década de 1980 15 . Com base neste método, as Comunidades Europeias emitido um protocolo padrão que foi testado e validado em vários laboratórios para a análise de glucosinolatos em sementes oleaginosas (Brassica napus, colza, canola 16). Outros adicionado a este método (por exemplo, determinando os factores de resposta para glucosinolatos adicionais que não estão presentes nas sementes de colza) 17. Apesar da crescente disponibilidade de espectrometria de cromatografia de massa plataformas líquidos (LC-MS) e protocolos de alto rendimento para a análise de glucosinolatos 18 <sup&gt;, 19, o método HPLC-UV / PDA originais ainda é bastante usada pelos cientistas. As principais razões são que este método é simples e de baixo custo, e relativamente acessível a laboratórios, sem uma extensa infra-estrutura de conhecimento químico-analíticos. Para servir esta comunidade, nós aqui detalhadamente o protocolo para a extração de glucosinolatos partir de materiais vegetais ea análise de suas formas desulfo com HPLC-PDA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Methanol HiPerSolv CHROMANORM&#174; gradient grade for HPLC grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20,864,320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate (NaOAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W302406-1KG-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1,090,571,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A25120-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;(&#8722;)-Sinigrin hydrate 
			from horseradish&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1647-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aryl Sulfatase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9626-10KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20,816,298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipette</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4518.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Wool</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7377.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass /wooden stick</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HERE1080766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL reaction tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>211-2606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needle</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>KX93.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotilabo-lab dishes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0772.1</td>
			<td>Waste tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze Dryer Freezone 12 L</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7960030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitril super gradient grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83,639,320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>462-5112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB 15061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH Electrode</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>STARA2115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Heraeus Multifuge X1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>69697</td>
			<td>C18 column (4.6 x 10 mm, 5 &#181;m, 300 &#197;)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column Acclaim 300</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>60266</td>
			<td>C18 column (4.6 x 150 mm, 3 &#181;m, 300 &#197;)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Ultimate 3000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>with column oven and UV or PDA detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask 1000 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>215-1595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucosinolate reference compounds</td>
			<td>Phytoplan</td>
			<td>various</td>
			<td>http://www.phytoplan.de/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a straightforward method for glucosinolate extraction and analysis with high-pressure liquid chromatography (hplc)

Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil quality, food flavoring, and human health. The biological activity of glucosinolates is released upon tissue damage, when they are mixed with the enzyme myrosinase. This results in the formation of pungent and toxic breakdown products, such as isothiocyanates and nitriles. Currently, more than 130 structurally different glucosinolates have been identified. The chemical structure of the glucosinolate is an important determinant of the product that is formed, which in turn determines its biological activity. The latter may range from detrimental (e.g., progoitrin) to beneficial (e.g., glucoraphanin). Each glucosinolate-containing plant species has its own specific glucosinolate profile. For this reason, it is important to correctly identify and reliably quantify the different glucosinolates present in brassicaceous leaf, seed, and root crops or, for ecological studies, in their wild relatives. Here, we present a well-validated, targeted, and robust method to analyze glucosinolate profiles in a wide range of plant species and plant organs. Intact glucosinolates are extracted from ground plant materials with a methanol-water mixture at high temperatures to disable myrosinase activity. Thereafter, the resulting extract is brought onto an ion-exchange column for purification. After sulfatase treatment, the desulfoglucosinolates are eluted with water and the eluate is freeze-dried. The residue is taken up in an exact volume of water, which is analyzed by high-pressure liquid chromatography (HPLC) with a photodiode array (PDA) or ultraviolet (UV) detector. Detection and quantification are achieved by conducting comparisons of the retention times and UV spectra of commercial reference standards. The concentrations are calculated based on a sinigrin reference curve and well-established response factors. The advantages and disadvantages of this straightforward method, when compared to faster and more technologically advanced methods, are discussed here.

Este método permite a detecção e a separação de desulfoglucosinolates comumente encontrados em todas as classes estruturais (Figura 3). A prejudicial progoitrin 2-hydroxyglucosinolate vem relativamente cedo no cromatograma e é claramente separada da glucoraphanin glucosinolatos benéfica, a única methylsulfinylglucosinolate nesta amostra. Sinigrin, gluconapin, e glucobrassicanapin formar uma série de glucosinolatos eluotropic alcenilo com comprimentos de cadeia lateral aumentando (C3, C4, C5 e, respectivamente). Uma série lógica semelhante é visível para as duas glucosinolatos methylthioalkenyl, glucoiberverin (C3) e glucoerucin (C4). Os picos dos três glucosinolatos de indolo, glucobrassicina e seus derivados de 4-hidroxi-1 e methoxyglucobrassicin (neoglucobrassicin), são também claramente separados. Deve-se notar que os picos de neoglucobrassicin e glucoerucin, bem como gluconasturtiin, a única gluco aromáticosinolate neste exemplo, são particularmente elevados neste extrato Brassica devido à adição de extratos de raiz à mistura 9. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55425/55425fig3.jpg" /> Figura 3: Cromatograma de um extracto de glucosinolatos. Detalhe (1-32 min) de um cromatograma HPLC resultante da análise de amostras combinadas da raiz e caule de Brassica nigra, B. rapa e B. oleracea. Os rótulos de pico indicam o tempo de retenção e as abreviaturas para desulfoglucosinolates identificados (GSL). Pro = progoitrin (2-OH-3-butenil GSL); RAPH = glucoraphanin (4-methylsulfinlybutyl GSL); SIN = sinigrin (2-propenil GSL), GNA = gluconapin (3-butenil GSL); 4Oh = 4-hydroxyglucobrassicin; IBV = glucoiberverin (3-metiltiopropil GSL); GBN = glucobrassicanapin (4-pentenilo GSL); ERU = glucoerucin (4-metiltiobutilo GSL); GBC = glucobrassicina (indol-3-ilmetil GSL); NAS = gluconasturtiin (2-feniletil GSL); NEO = neoglucobrassicin (1-MeOH-glucobrassicin). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Mais glucosinolatos metilsulfinilo cadeia, que são comumente encontrados na planta modelo Arabidopsis, também mostram uma série eluotropic, como visto em um extrato de raiz de Rorippa austriaca. Glucohesperalin (C6), glucosiberin (C7), glucohirsutin (C8) e glucoarabin (C9) aparecem em intervalos regulares sobre o cromatograma (Figura 4). Juntamente com o espectro de UV dos picos, tal série lógica eluotropic podem ser usadas para classificar e identificar provisoriamente, glucosinolatos desconhecidos. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55425/55425fig4.jpg" /> Figura 4: Cromatograma (quadro 9-30 min) Dos desulfoglucosinolates em um extrato austriaca raiz Rorippa. Os rótulos de pico indicam o tempo de retenção e as abreviaturas para desulfoglucosinolates identificados (GSL). HES = glucohesperin (6-methylsulfinylhexyl GSL); SBE = glucosiberin (7-methylsulfinylheptyl GSL); GBC = glucobrassicina (indol-3-ilmetil GSL); HIR = glucohirsutin (8-methylsulfinlyoctyl GSL); ARA = glucoarabin (9-methylsulfinylnonylglucosinolate); NEO = neoglucobrassicin (1-MeOH-glucobrassicin). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Nome comum </td><td> Estrutura de cadeia lateral </td><td> Tr (min) * </td><td> 229 nm </td><td> referência# </td></tr><tr><td> aliphatic glucosinolatos </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glucocapparin </td><td> metilo </td><td> 3,5 </td><td> 1 </td><td> Castanho </td></tr><tr><td> sinigrin </td><td> 2-propenilo </td><td> 5.5 </td><td> 1 </td><td> Brown, CE </td></tr><tr><td> Gluconapin </td><td> 3-butenilo </td><td> 9.5 </td><td> 1.11 </td><td> CE </td></tr><tr><td> Glucobrassicanapin </td><td> 4-pentenilo </td><td> 13,5 </td><td> 1.15 </td><td> CE </td></tr><tr><td> Glucoiberverin </td><td> 3-metiltiopropilo </td><td> 10,9 </td><td> 0,8 </td><td> Castanho </td></tr><tr><td> Glucoerucin </td><td> 4-metiltiobutilo </td><td> 14,0 </td><td> 0,9 </td><td> Castanho </td></tr><tr><td> Glucoiberin </td><td> 3-methylsulfinylpropyl </td><td> 3.7 </td><td> 1.2 </td><td> Castanho </td></tr><tr><td> glucoraphanin </td><td> 4-methylsulfinylbutyl </td><td> 4.9 </td><td> 0,9 </td><td> Castanho </td></tr><tr><td> Glucoalyssin </td><td> 5-methylsulfinylpentyl </td><td> 7.6 </td><td> 0,9 </td><td> Castanho </td></tr><tr><td> Glucohesperin </td><td> 6-methylsulfinylhexyl </td><td> 10.5 </td><td> 1 </td><td> Castanho </td></tr><tr><td> Glucosiberin </td><td> 7-methylsulfinylheptyl </td><td> 13,5 </td><td> 1 </td><td> Castanho </td></tr><tr><td> Glucohirsutin </td><td> 8-methylsulfinyloctyl </td><td> 16.8 </td><td> 1.1 </td><td> Castanho </td></tr><tr><td> Glucoarabin </td><td> 9-methylsulfinylnonyl </td><td> 20,5 </td><td> 1 </td><td></td></tr><tr><td> Glucocheirolin </td><td> 3-methylsulfonylpropyl </td><td> 4.2 </td><td> 0,9 </td><td> Castanho </td></tr><tr><td> Progoitrin </td><td> 2 (R) -OH-3-butenil </td><td> 4,5 </td><td> 1,09 </td><td> Buchner, CE </td></tr><tr><td> Gluconapoleiferin </td><td> 2-OH-5-pentenilo </td><td> 8.3 </td><td> 1 </td><td> CE </td&gt; </tr><tr><td> glucosinolatos de indole </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4-hydroxyglucobrassicin </td><td> 4-hidroxi-indol-3-ilmetil </td><td> 11.2 </td><td> 0,28 </td><td> Buchner, CE </td></tr><tr><td> glucobrassicin </td><td> indol-3-ilmetil </td><td> 15,3 </td><td> 0,29 </td><td> Buchner, CE </td></tr><tr><td> 4-Methoxyglucobrassicin </td><td> 4-metoxi-indol-3-ilmetil </td><td> 18,2 </td><td> 0,25 </td><td> Buchner, CE </td></tr><tr><td> Neoglucobrassicin </td><td> 1-metoxi-indol-3-ilmetil </td><td> 22,5 </td><td> 0,2 </td><td> Buchner, CE </td></tr><tr><td> glucosinolatos aromáticos </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sinalbin </td><td> 4-hidroxibenzil </td><td> 8.1 </td><td> 0,5 </td><td> Buchner </td></tr><tr><td> Glucosibarin </td><td> 2 (R) -OH-2-feniletil </td><td> 12.1 </td><td&gt; 0,95 </td><td> veja a próxima </td></tr><tr><td> Glucobarbarin </td><td> 2 (S) -OH-2-feniletil </td><td> 12,7 </td><td> 0,95 </td><td> Buchner </td></tr><tr><td> Glucotropaeolin </td><td> benzilo </td><td> 13,8 </td><td> 0,95 </td><td> Buchner, CE </td></tr><tr><td> Gluconasturtiin </td><td> 2-feniletil </td><td> 18,0 </td><td> 0,95 </td><td> Buchner, CE </td></tr><tr><td> desconhecido - alifático / aromático como espectro UV </td><td></td><td></td><td> 1 </td><td> CE </td></tr><tr><td> desconhecido - indole como espectro </td><td></td><td></td><td> 0,25 </td><td> CE </td></tr><tr><td colspan="5"> * O tempo de retenção aproximado (Rt) arredondadas para o mais próximo de 0,1 min (± 0,3 minutos dependendo da coluna, a qualidade do eluente). Os tempos de retenção são determinadas em plataformas ThermoFisher / Dionex final de HPLC equipado com uma coluna C 18 (150 x 4,6 mm, 3 micrómetros de tamanho de partícula) mais C 18 </sUB&gt; pr coluna (10 x 4,6 mm, 5 micrómetros de tamanho de partícula) com um programa de gradiente como na Tabela 1. </td></tr><tr><td colspan="5"> # Referências para factores de resposta: Buchner, R. em glucosinolatos em sementes de colza (ed JP Wathelet) 50-58 (Martinus Nijhoff Publishers, 1987); Brown, PD, Tokuhisa, JG, Reichelt, M. &amp; Gershenzon, J. Variação da acumulação de glucosinolatos entre diferentes órgãos e estágios de desenvolvimento de Arabidopsis thaliana. Fitoquímica. 62 (3), 471-481, DOI: 10.1016 / S0031-9422 (02) 00549-6 (2003); CE. oleaginosas - deliberação de glucosinolatos Líquida de Alta Eficiência cromatografia. Jornal Oficial das Comunidades Europeias. L 170/28. Anexo VIII 03.07.27-34 (1990). </td></tr></tbody></table> Tabela 3: Os factores de resposta dos mais comumente encontrados desulfo-glucosinolatos em extratos vegetais e seus tempos de retenção aproximados no C 18 colunas. Eluentes, gradient, temperatura da coluna, e a taxa de fluxo, como na Tabela 1.

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A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography HPLC

Here, we describe in great detail an established and robust protocol for the extraction of glucosinolates from ground plant materials. After an on-column sulfatase treatment of the extracts, the desulfoglucosinolates are eluted and analyzed by high-pressure liquid chromatography.

Um método simples para glucosinolatos Extracção e análise com cromatografia líquida de alta pressão (HPLC)

Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography (HPLC)

25.0K visualizações.  German Centre for Integrative Biodiversity Research (iDiv) Halle-Jena-Leipzig. Here, we describe in great detail an established and robust protocol for the extraction of glucosinolates from ground plant materials. After an on-column sulfatase treatment of the extracts, the desulfoglucosinolates are eluted and analyzed by high-pressure liquid chromatography. 

Vídeo: A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography HPLC

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first separated into polar and non-polar fractions by a liquid-liquid phase extraction, and partially purified to facilitate downstream analysis. Both aqueous (polar metabolites) and organic (non-polar metabolites) phases of the initial extraction are processed to survey a broad range of metabolites. Metabolites are separated by different liquid chromatography methods based upon their partition properties. In this method, we present microflow ultra-performance (UP)LC methods, but the protocol is scalable to higher flows and lower pressures. Introduction into the mass spectrometer can be through either general or compound optimized source conditions. Detection of a broad range of ions is carried out in full scan mode in both positive and negative mode over a broad m/z range using high resolution on a recently calibrated instrument. Label-free differential analysis is carried out on bioinformatics platforms. Applications of this approach include metabolic pathway screening, biomarker discovery, and drug development.

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Untargeted metabolomics provides a hypothesis generating snapshot of a metabolic profile. This protocol will demonstrate the extraction and analysis of metabolites from cells, serum, or tissue. A range of metabolites are surveyed using liquid-liquid phase extraction, microflow ultraperformance liquid chromatography/high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS) coupled to differential analysis software.

Metabolomics irrelevantes de fontes biológicas Usando UltraPerformance cromatografia líquida de alta resolução Espectrometria de Massa (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Química

Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the face of turgor pressures several atmospheres in magnitude. Across the diverse shapes and sizes of the bacterial kingdom, the cell wall is composed of peptidoglycan, a macromolecular network of sugar strands crosslinked by short peptides. Peptidoglycan&#8217;s central importance to bacterial physiology underlies its use as an antibiotic target and has motivated genetic, structural, and cell biological studies of how it is robustly assembled during growth and division. Nonetheless, extensive investigations are still required to fully characterize the key enzymatic activities in peptidoglycan synthesis and the chemical composition of bacterial cell walls. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) is a powerful analytical method for quantifying differences in the chemical composition of the walls of bacteria grown under a variety of environmental and genetic conditions, but its throughput is often limited. Here, we present a straightforward procedure for the isolation and preparation of bacterial cell walls for biological analyses of peptidoglycan via HPLC and Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), an extension of HPLC that utilizes pumps to deliver ultra-high pressures of up to 15,000 psi, compared with 6,000 psi for HPLC. In combination with the preparation of bacterial cell walls presented here, the low-volume sample injectors, detectors with high sampling rates, smaller sample volumes, and shorter run times of UPLC will enable high resolution and throughput for novel discoveries of peptidoglycan composition and fundamental bacterial cell biology in most biological laboratories with access to an ultracentrifuge and UPLC.

The bacterial cell wall is composed of peptidoglycan, a macromolecular network of sugar strands crosslinked by peptides. Ultra Performance Liquid Chromatography provides high resolution and throughput for novel discoveries of peptidoglycan composition. We present a procedure for the isolation of cell walls (sacculi) and their subsequent preparation for analysis via UPLC.

Isolamento e Preparação de Paredes Celulares Bacterianas para Análise Composicional por Cromatografia Líquida de Ultra Desempenho

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the ...

High-pressure Sapphire Cell for Phase Equilibria Measurements of CO2/Organic/Water Systems

The high pressure sapphire cell apparatus was constructed to visually determine the composition of multiphase systems without physical sampling. Specifically, the sapphire cell enables visual data collection from multiple loadings to solve a set of material balances to precisely determine phase composition. Ternary phase diagrams can then be established to determine the proportion of each component in each phase at a given condition. In principle, any ternary system can be studied although ternary systems (gas-liquid-liquid) are the specific examples discussed herein. For instance, the ternary THF-Water-CO2 system was studied at 25 and 40&#160;&#176;C and is described herein. Of key importance, this technique does not require sampling. Circumventing the possible disturbance of the system equilibrium upon sampling, inherent measurement errors, and technical difficulties of physically sampling under pressure is a significant benefit of this technique. Perhaps as important, the sapphire cell also enables the direct visual observation of the phase behavior. In fact, as the CO2 pressure is increased, the homogeneous THF-Water solution phase splits at about 2 MPa. With this technique, it was possible to easily and clearly observe the cloud point and determine the composition of the newly formed phases as a function of pressure.
The data acquired with the sapphire cell technique can be used for many applications. In our case, we measured swelling and composition for tunable solvents, like gas-expanded liquids, gas-expanded ionic liquids and Organic Aqueous Tunable Systems (OATS)1-4. For the latest system, OATS, the high-pressure sapphire cell enabled the study of (1) phase behavior as a function of pressure and temperature, (2) composition of each phase (gas-liquid-liquid) as a function of pressure and temperature and (3) catalyst partitioning in the two liquid phases as a function of pressure and composition. Finally, the sapphire cell is an especially effective tool to gather accurate and reproducible measurements in a timely fashion.

High-pressure Sapphire Cell for Phase Equilibria Measurements of CO2/Organic/Water Systems

The high pressure sapphire cell apparatus is a unique tool to study, without sampling, phase behavior under a wide range of pressures. Using a cathetometer, very precise volume measurements can be recorded to measure liquid expansion and phase composition. Thus, this synthetic method enables the study of (1) phase equilibria of multi-component mixtures and (2) the partition behavior of catalyst or model compounds as a function of pressure.

Sapphire celular de alta pressão para medições de Equilíbrio de Fases de CO<sub&gt; 2</sub&gt; / Orgânicos / Sistemas de Água

The high pressure sapphire cell apparatus was constructed to visually determine the composition of multiphase systems without physical sampling. ...

Preparing Silica Aerogel Monoliths via a Rapid Supercritical Extraction Method

A procedure for the fabrication of monolithic silica aerogels in eight hours or less via a rapid supercritical extraction process is described. The procedure requires 15-20 min of preparation time, during which a liquid precursor mixture is prepared and poured into wells of a metal mold that is placed between the platens of a hydraulic hot press, followed by several hours of processing within the hot press. The precursor solution consists of a 1.0:12.0:3.6:3.5 x 10-3 molar ratio of tetramethylorthosilicate (TMOS):methanol:water:ammonia. In each well of the mold, a porous silica sol-gel matrix forms. As the temperature of the mold and its contents is increased, the pressure within the mold rises. After the temperature/pressure conditions surpass the supercritical point for the solvent within the pores of the matrix (in this case, a methanol/water mixture), the supercritical fluid is released, and monolithic aerogel remains within the wells of the mold. With the mold used in this procedure, cylindrical monoliths of 2.2 cm diameter and 1.9 cm height are produced. Aerogels formed by this rapid method have comparable properties (low bulk and skeletal density, high surface area, mesoporous morphology) to those prepared by other methods that involve either additional reaction steps or solvent extractions (lengthier processes that generate more chemical waste).The rapid supercritical extraction method can also be applied to the fabrication of aerogels based on other precursor recipes.

This article describes a rapid supercritical extraction method for fabricating silica aerogels. By utilizing a confined mold and hydraulic hot press, monolithic aerogels can be made in eight hours or less.

Preparação de sílica aerogel Monólitos através de um Método de extracção rápida supercrítico

A procedure for the fabrication of monolithic silica aerogels in eight hours or less via a rapid supercritical extraction process is described. The ...

Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

Pós Coluna A derivação utilizando a reação Fluxo cromatografia líquida de alta Colunas

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is ...

A Method to Manipulate Surface Tension of a Liquid Metal via Surface Oxidation and Reduction

Controlling interfacial tension is an effective method for manipulating the shape, position, and flow of fluids at sub-millimeter length scales, where interfacial tension is a dominant force. A variety of methods exist for controlling the interfacial tension of aqueous and organic liquids on this scale; however, these techniques have limited utility for liquid metals due to their large interfacial tension.
Liquid metals can form soft, stretchable, and shape-reconfigurable components in electronic and electromagnetic devices. Although it is possible to manipulate these fluids via mechanical methods (e.g., pumping), electrical methods are easier to miniaturize, control, and implement. However, most electrical techniques have their own constraints: electrowetting-on-dielectric requires large (kV) potentials for modest actuation, electrocapillarity can affect relatively small changes in the interfacial tension, and continuous electrowetting is limited to plugs of the liquid metal in capillaries.
Here, we present a method for actuating gallium and gallium-based liquid metal alloys via an electrochemical surface reaction. Controlling the electrochemical potential on the surface of the liquid metal in electrolyte rapidly and reversibly changes the interfacial tension by over two orders of magnitude ( &#820;500 mN/m to near zero). Furthermore, this method requires only a very modest potential (&#60; 1 V) applied relative to a counter electrode. The resulting change in tension is due primarily to the electrochemical deposition of a surface oxide layer, which acts as a surfactant; removal of the oxide increases the interfacial tension, and vice versa. This technique can be applied in a wide variety of electrolytes and is independent of the substrate on which it rests.

We present a method to control the interfacial energy of a liquid metal in an electrolyte via electrochemical deposition (or removal) of a surface oxide layer. This simple method can control the capillary behavior of gallium-based liquid metals by tuning the interfacial energy rapidly, significantly, and reversibly using modest voltages.

Um Método para Manipular a Tensão Superficial de um Metal Líquido via Oxidação e Redução Superficial

Controlling interfacial tension is an effective method for manipulating the shape, position, and flow of fluids at sub-millimeter length scales, where ...

High Pressure Single Crystal Diffraction at PX^2

In this report we describe detailed procedures for carrying out single crystal X-ray diffraction experiments with a diamond anvil cell (DAC) at the GSECARS 13-BM-C beamline at the Advanced Photon Source. The DAC program at 13-BM-C is part of the Partnership for Extreme Xtallography (PX^2) project. BX-90 type DACs with conical-type diamond anvils and backing plates are recommended for these experiments. The sample chamber should be loaded with noble gas to maintain a hydrostatic pressure environment. The sample is aligned to the rotation center of the diffraction goniometer. The MARCCD area detector is calibrated with a powder diffraction pattern from LaB6. The sample diffraction peaks are analyzed with the ATREX software program, and are then indexed with the RSV software program. RSV is used to refine the UB matrix of the single crystal, and with this information and the peak prediction function, more diffraction peaks can be located. Representative single crystal diffraction data from an omphacite (Ca0.51Na0.48)(Mg0.44Al0.44Fe2+0.14Fe3+0.02)Si2O6 sample were collected. Analysis of the data gave a monoclinic lattice with P2/n space group at 0.35 GPa, and the lattice parameters were found to be: a = 9.496 &#177;0.006 &#197;, b = 8.761 &#177;0.004 &#197;, c = 5.248 &#177;0.001 &#197;, &#946; = 105.06 &#177;0.03&#186;, &#945; = &#947; = 90&#186;.

In this report, we describe detailed procedures for carrying out single crystal X-ray diffraction experiments with a diamond anvil cell at the GSECARS 13-BM-C beamline at the Advanced Photon Source. ATREX and RSV programs are used to analyze the data.

Alta Pressão Único Difração de Cristal no PX ^ 2

In this report we describe detailed procedures for carrying out single crystal X-ray diffraction experiments with a diamond anvil cell (DAC) at the ...

A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites

The extraction and analysis of catecholamine neurotransmitters in biological fluids is of great importance in assessing nervous system function and related diseases, but their precise measurement is still a challenge. Many protocols have been described for neurotransmitter measurement by a variety of instruments, including high-pressure liquid chromatography (HPLC). However, there are shortcomings, such as complicated operation or hard-to-detect multiple targets, which cannot be avoided, and presently, the dominant analysis technique is still HPLC coupled with sensitive electrochemical or fluorimetric detection, due to its high sensitivity and good selectivity. Here, a detailed protocol is described for the pretreatment and detection of catecholamines with high pressure liquid chromatography with electrochemical detection (HPLC-ECD) in real urine samples of infants, using electrospun composite nanofibers composed of polymeric crown ether with polystyrene as adsorbent, also known as the packed-fiber solid phase extraction (PFSPE) method. We show how urine samples can be easily precleaned by a nanofiber-packed solid phase column, and how the analytes in the sample can be rapidly enriched, desorbed, and detected on an ECD system. PFSPE greatly simplifies the pretreatment procedures for biological samples, allowing for decreased time, expense, and reduction of the loss of targets. 
Overall, this work illustrates a simple and convenient protocol for solid-phase extraction coupled to an HPLC-ECD system for simultaneous determination of three monoamine neurotransmitters (norepinephrine (NE), epinephrine (E), dopamine (DA)) and two of their metabolites (3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) and 3,4-dihydroxy-phenylacetic acid (DOPAC)) in infants' urine. The established protocol was applied to assess the differences of urinary catecholamines and their metabolites between high-risk infants with perinatal brain damage and healthy controls. Comparative analysis revealed a significant difference in urinary MHPG between the two groups, indicating that the catecholamine metabolites may be an important candidate marker for early diagnosis of cases at risk for brain damage in infants.

We present a convenient solid-phase extraction coupled to high-pressure liquid chromatography (HPLC) with electrochemical detection (ECD) for simultaneous determination of three monoamine neurotransmitters and two of their metabolites in infants' urine. We also identify the metabolite MHPG as a potential biomarker for the early diagnosis of brain damage for infants.

Um método conveniente para extração e análise com a cromatografia líquida de alta pressão de neurotransmissores catecolaminas e seus metabólitos

The extraction and analysis of catecholamine neurotransmitters in biological fluids is of great importance in assessing nervous system function and ...

A New Straightforward Method for Lipophilicity (logP) Measurement using 19F NMR Spectroscopy

Fluorination has become an effective tool to optimize physicochemical properties of bioactive compounds. One of the applications of fluorine introduction is to modulate the lipophilicity of the compound. In our group, we are interested in the study of the impact of fluorination on lipophilicity of aliphatic fluorohydrins and fluorinated carbohydrates. These are not UV-active, resulting in a challenging lipophilicity determination. Here, we present a straightforward method for the measurement of lipophilicity of fluorinated compounds by 19F NMR spectroscopy. This method requires no UV-activity. Accurate solute mass, solvent and aliquot volume are also not required to be measured. Using this method, we measured the lipophilicities of a large number of fluorinated alkanols and carbohydrates.

A New Straightforward Method for Lipophilicity logP Measurement using 19F NMR Spectroscopy

A novel and straightforward variation of the shake-flask method was developed for accurate lipophilicity measurement of fluorinated compounds by 19F NMR spectroscopy.

Um novo método simples para a medição de Lipofilicidade (logP) usando 19espectroscopia RMN de F

Fluorination has become an effective tool to optimize physicochemical properties of bioactive compounds. One of the applications of fluorine introduction ...

Extraction of Lignin with High &#946;-O-4 Content by Mild Ethanol Extraction and Its Effect on the Depolymerization Yield

Lignin valorization strategies are a key factor for achieving more economically competitive biorefineries based on lignocellulosic biomass. Most of the emerging elegant procedures to obtain specific aromatic products rely on the lignin substrate having a high content of the readily cleavable &#946;-O-4 linkage as present in the native lignin structure. This provides a miss-match with typical technical lignins that are highly degraded and therefore are low in &#946;-O-4 linkages. Therefore, the extraction yields, and the quality of the obtained lignin are of utmost importance to access new lignin valorization pathways. In this manuscript, a simple protocol is presented to obtain lignins with high &#946;-O-4 content by relatively mild ethanol extraction that can be applied to different lignocellulose sources. Furthermore, analysis procedures to determine the quality of the lignins are presented together with a depolymerization protocol that yields specific phenolic 2-arylmethyl-1,3-dioxolanes, which can be used to evaluate the obtained lignins. The presented results demonstrate the link between lignin quality and potential for the lignins to be depolymerized into specific monomeric aromatic chemicals. Overall, the extraction and depolymerization demonstrates a trade-off between the lignin extraction yield and the retention of the native aryl-ether structure and thus the potential of the lignin to be used as the substrate for the production of chemicals for higher-value applications.

Here, we present a protocol to perform ethanol extraction of lignin from several biomass sources. The effect of the extraction conditions on the lignin yield and &#946;-O-4 content are presented. Selective depolymerization is performed on the obtained lignins to obtain high aromatic monomer products.

Extração da lignina com alto teor de β-O-4 por extração de etanol suave e seu efeito sobre o rendimento de despolimerização

Lignin valorization strategies are a key factor for achieving more economically competitive biorefineries based on lignocellulosic biomass. Most of the ...