A clonagem por recombinação homóloga, ou recombinamento, melhorou muito a capacidade dos pesquisadores de conduzir engenharia genética de alto rendimento. A clonagem molecular clássica requer digestão de vetores e inserções com as mesmas enzimas de restrição para gerar extremidades compatíveis para "recombinação", mas especialmente quando se tenta isolar uma região de uma sequência mais longa, como um trecho de DNA genômico, nem sempre há enzimas de restrição que cortarão exclusivamente ao redor da região de interesse, e não dentro da região ou em outros lugares da sequência. Ao evitar a necessidade desses locais de restrição, o recombineer fornece uma maneira muito mais eficiente e econômica de fazer construções de engenharia genética.

Neste vídeo, introduziremos os princípios da recombinação genética, forneceremos um protocolo geral para recombinar um vetor de direcionamento genético e discutiremos várias aplicações dessas tecnologias.

Primeiro, vamos discutir o que é recombinação e como ela pode ser aplicada.

A recombinação genética implica a troca de informações entre moléculas de DNA. Em "recombinação homólogo", trechos relativamente grandes de sequências de DNA semelhantes ou idênticas são trocados. As células usam esse processo para reparar quebras duplas de fios, e eucariotes de reprodução sexual também realizam isso entre cromossomos homólogos durante a meiose para aumentar a diversidade genética.

A recombinação homóloga foi aproveitada para uma série de propósitos experimentais, incluindo a modificação de loci endógeno específico nas células — chamada de "segmentação genética". Também é aplicado à engenharia de construções genéticas, um processo chamado "recombineer", que é especialmente útil para fazer modificações em grandes trechos de DNA para direcionamento ao genoma de um organismo. Para isso, os pesquisadores podem fazer uso de "bibliotecas genômicas", ou conjuntos de vetores cada um contendo fragmentos longos de DNA genômico. Vários tipos de bibliotecas com diferentes capacidades, geralmente propagadas em clones bacterianos, foram criadas e podem ser encomendadas a partir de repositórios comerciais ou sem fins lucrativos. Um dos tipos mais usados de biblioteca genômica é chamado de cromossomo artificial bacteriano ou BAC, que pode transportar um tamanho de inserção entre 150-350 quilobases.

Para recombinar uma construção, os cientistas precisam de um organismo no qual ocorre uma recombinação homologos. A levedura Saccharomyces cerevisiae é naturalmente "competente em recombinação" e pode prontamente realizar uma recombinação homóloga entre um vetor e uma inserção. Outro sistema comumente aplicado utiliza as proteínas "Vermelhas" da bacteriophage lambda, que é reconstituída na bactéria E. coli. Vetores podem ser recombinados em cepas bacterianas previamente estabelecidas, ou em componentes do sistema vermelho de codificação plasmida podem ser co-transformados com os substratos recombinentes nas bactérias.

Agora, vamos passar por um protocolo para criar um vetor de alvo genético recombinando.

O objetivo deste protocolo é criar um rato geneticamente modificado com alterações direcionadas a um gene específico. Resumidamente, as modificações desejadas ao gene de interesse são feitas em um BAC; a sequência modificada é "recuperada" em um vetor de alvo, e este vetor é transfectado em células-tronco embrionárias para direcionamento genético. As células-tronco podem então ser usadas para gerar o animal geneticamente modificado. Para obter instruções sobre este procedimento final, consulte o vídeo "Engenharia Genética de Organismos Modelos" da JoVE Science Education.

Para começar, um clone BAC contendo a sequência genômica de interesse é identificado e ordenado. Em seguida, são projetados os braços de elogia, ou oligonucleotídeos contendo as regiões homólogos de 30-50 bases. Estes oligonucleotídeos são usados como primers em reações pcr para gerar as "fitas" de DNA usadas para modificar o gene de interesse. Essas fitas normalmente contêm, por exemplo, genes de resistência a antibióticos que podem atuar como marcadores de seleção, que podem ser facilmente amplificados de muitos plasmídeos disponíveis publicamente. O clone bacteriano BAC é então transformado, por exemplo, por eletroporação, com uma codificação plasmida dos componentes do sistema Vermelho, seguido pelas fitas de controle de escoologia. As bactérias são então incubadas na temperatura apropriada para induzir a recombinação.

Para recuperar a sequência modificada do BAC, um vetor de "recuperação" é linearizado e amplificado usando primers contendo braços de escoologia que cobrem várias quilobases ao redor do local da modificação. Esta espinha dorsal vetorial é transformada no clone bacteriano BAC, e o recombineamento é induzido novamente. O vetor será "reparado por lacunas" ao "recuperar" a sequência apropriada do BAC. Isso resulta em um vetor de direcionamento genético contendo a sequência modificada de interesse, bem como regiões que são homólogas ao DNA genômico em torno da sequência modificada. Este vetor pode então ser purificado, linearizado e introduzido em células-tronco embrionárias onde o maquinário de recombinação endógeno atingirá a sequência modificada ao lócus correspondente, alterando assim o genoma hospedeiro.

Vamos agora olhar para algumas aplicações de técnicas de engenharia baseadas em recombinação.

Primeiro, os pesquisadores podem usar o recombineer para projetar rapidamente e facilmente o genoma bacteriano, por exemplo, para estudar complexos proteicos. Aqui, um codificando uma tag de afinidade de peptídeo sequencial, bem como um marcador de seleção de resistência à kanamicina foi projetado para ser recombinado na extremidade de 3 centavos do gene de interesse. Este vetor foi então introduzido em E. coli"competente em recombinação" vermelha, e recombinantes bem sucedidos foram isolados usando mídia seletiva. Os complexos proteicos marcados foram bioquimicamente purificados usando proteínas que se ligam fortemente às etiquetas, e analisados pela espectrometria de massa para identificar os parceiros de interação da proteína de interesse.

O recombineering e o direcionamento genético também podem ser usados para modificar o genoma de organismos parasitários, como o parasita intracelular obrigatório Toxoplasma gondii,que causa a toxoplasmose da doença. Neste estudo, um vetor direcionado foi recombinado em leveduras, onde sequências genômicas que flanqueavam o gene de interesse foram colocadas em torno de um marcador de seleção. O vetor foi então linearizado e eletroporado nos parasitas. Limitando o revestimento de diluição em mídias seletivas foi usado para isolar recombinantes bem sucedidos, nos quais o maquinário de recombinação homólogo do parasita substituiu a sequência genômica pela sequência projetada, excluindo assim o gene de interesse. A PCR da região alvo confirmou eventos positivos de recombinação.

Finalmente, foi elaborado um procedimento conhecido como subcloning plus insertion, ou SPI, no qual o reparo de lacunas e a inserção de ocorrem simultaneamente, tornando o processo de recombineamento mais simples e flexível. Crítico para o sucesso desse processo é o design adequado dos múltiplos braços de homologia, que, em até 180 bp, são mais longos do que na recombineering convencional, de modo a aumentar a eficiência de recombinação. Depois de incorporar os braços de homologia no plasmídeo subcloning e inserir por PCR, eles foram transformados juntos em um clone bac expresso vermelho, e a recombineamento foi induzida. Construções recombineadas com sucesso foram então identificadas por PCR ou análise de digestão de restrição.

Você acabou de assistir o vídeo de JoVE sobre recombineir. Neste vídeo, discutimos os princípios da recombinação e como eles podem ser usados na engenharia genética, um protocolo para um projeto de recombineer e, finalmente, várias aplicações dessas técnicas. Como sempre, obrigado por assistir!