Este trabalho é apoiado pela pesquisa de NIH (A1R03AI120027 (RN) e 1R21AI20012 (RN)), concessão de pesquisa institucional (RN), start-up conceder (RN) e semente de MD Anderson CIC concede (RN).

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) do Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center e institucional Cuidado Animal.
1. preparação de peptídeo para a vacina
<ol><li>Dissolver o liofilizado peptídeo com fosfato salino (PBS) para a concentração adequada e vórtice para 30 s. Nota: Para hgp10025–33, a concentração final é de 1 mg/mL e para óvulos257–264, a concentração final é de 0,5 mg/mL. Reconstitua o peptídeo antes da injeção. Não guarde após reconstituição.</li>
</ol>2. isolamento de Splenocytes de rato transgénico
Nota: O isolamento de células do baço deve ser executado de forma estéril.
<ol><li>
Eutanásia o rato transgénico OT-1 usando o método de asfixia aprovado CO2 e remover o baço. Nota: Rato transgénico apropriado é utilizado nesta etapa específico para o peptídeo de escolha.<ol>
<li>Coloque o mouse do seu lado direito. Pulverize o lado esquerdo do mouse com 70% de etanol (EtOH). Puxe a pele usando fórceps e cortar a pele com uma tesoura cirúrgica; o baço será visível dentro da cavidade peritoneal. Delicadamente abri a cavidade peritoneal para acessar o baço. Remova o baço usando fórceps.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Desagregar o baço por colocá-lo em um filtro de 70 µm em uma placa de Petri com 2 mL de meio A (PBS com 1% de soro fetal bovino (FBS)) e o esmagamento do baço com o fim de um êmbolo.
	<ol>
<li>Recolha os splenocytes da placa de Petri e coloque em um tubo cónico de 50 mL. Lave o tubo de ensaio com 5 mL de meio A duas vezes para coletar todas as células. Adicionar meio um up de 25 mL e centrifugar as células durante 5 min à temperatura ambiente a 475 x g.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aspirar as células e ressuspender em 1 mL / por tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC) baço. Incubar em temperatura ambiente por 5 min. adicionar 10 mL de meio A centrífuga à temperatura ambiente em 475 x g. resuspenda o pellet em 10 mL de meio A e remover detritos filtrando a suspensão de células através de um filtro de 70 µm em um limpo 50ml cónico.</li>
	<li>
Contar as células usando trypan azul e um hemocytometer. Ressuspender as células em PBS para uma concentração final de 106 -6 de 100 células/mL. Para óvulos257–264 específicos matando, resuspenda em 106 células/mL e para hgp10025–33 específicos matando, resuspenda em 1006 células/mL.
	<ol>
<li>Girar as células restantes à temperatura ambiente durante 5 min à 475 g. x aspirar o sobrenadante e ressuspender em 15 mL PBS fria para lavar as células. Repita a etapa de lavagem mais uma vez. Girar as células à temperatura ambiente durante 5 min à 475 g. x aspirar o sobrenadante e ressuspender em PBS fria de acordo com o volume final determinado na etapa 2.4.</li>
		<li>Suspensão de célula única de transferência para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL e manter no gelo até injeção no destinatário C57/BL6 rato.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. injeção de Splenocytes de ratos transgênicos
<ol><li>Coloque destinatário C57/BL6 rato em uma retenção com o lado dorsal. Pulverizar a superfície de base de cauda de injeção com álcool isopropílico a 70%. Administre 100 µ l de suspensão de célula única (secção 2) por via intravenosa na veia de cauda, utilizando uma agulha 27G com o lado de bisel voltado para cima.</li>
</ol>4. Covax administração
Nota: Se as células são injetadas no período do tarde, covax deve ser administrado na manhã seguinte até 18 horas após injeção de célula.
<ol><li>Coloque o mouse em uma caixa clara anestesia com isoflurano 1-3%. Depois que os ratos são totalmente anestesiados, transferi os ratos para os cones de nariz ligados ao colector da câmara de anestesia. Manter os ratos contidos com o lado dorsal acima. Nota: Anesthetization é confirmado por uma pitada de dedo breve para verificar se que uma resposta de retirada não é eliciada. A lei federal limita o uso de isoflurano na ordem de um veterinário licenciado.</li>
	<li>Pulverizar a superfície de base de cauda de injeção com álcool isopropílico a 70%. Injetar 100 µ l de solução de peptídeo (da seção 1) por via subcutânea com uma agulha de 27G com a seringa penetrando 4-5 mm na região base da cauda, a agulha cónica virados para cima. Nota: Os ratos são vacinados em um flanco com injeção subcutânea na base da cauda10.</li>
	<li>Injete 100 µ l anti-CD40 anticorpo (0,5 mg/mL de caldo) lateralmente o local da injeção de vacina.</li>
	<li>Aplique cuidadosamente imiquimod creme 50 mg/rato sobre os locais de vacinação. Esfregue o creme de imiquimod na superfície até que o creme não é mais visível e é totalmente absorvido.</li>
	<li>Injetar 100 µ l de proteína de 100.000 UI/mL rhIL-2 intraperitonealmente (i.p.) na região abdominal inferior. Observe os ratos por 5 min após eles recuperarem totalmente da anestesia. Nota: Experimento é uma pausa neste ponto por 3 dias.</li>
</ol>5. isolamento dos Splenocytes alvo para etiquetar com CFSE
Nota: O isolamento de células do baço deve ser executado de forma estéril.
<ol><li>Abater os camundongos C57BL/6 de acordo com o método de asfixia aprovado CO2 . Remova spleen(s) como na etapa 2.1.1. Desagregar o baço e lavar splenocytes como em passos 2.2.1 - 2.2.3. Lyse pilhas de sangue vermelhas como em etapas 2.3 - 2.3.2.</li>
	<li>Remova as células para a contagem usando um hemocytometer e calcular para uma concentração final de células em 106 células/mL em solução CFSE-rotulagem (descrita na etapa 7). Gire as células remanescentes à temperatura ambiente durante 5 min à 475 x sobrenadante de aspirado de g..</li>
</ol>6. o peptídeo pulsando de alvo Splenocytes
Nota: Peptídeo pulsando deve ser executada de maneira estéril.
<ol><li>Ressuspender as células em 106 células/mL em mídia completa (RPMI 1640 mídia com 10% FBS, 1% L-glutamina (Gln-L), 1% penicilina/estreptomicina (caneta/Strep)). Divida as células em 2 tubos (cônicas de 15 mL). Rotule cada tubo como pulsado ou unpulsed.</li>
	<li>
Adicione o peptídeo para o tubo rotulado pulsada. Para óvulos257–264 pulsando, adicionar 1 µ g/mL e para hgp10025–33 pulsando, adicionar 2 µ g/mL. Nota: As células unpulsed submeter-se a incubação mesma como as células pulsadas só que sem a adição do peptide.<ol>
<li>Incube as células + peptídeo a 37 ° C por 1h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicionar 10 mL de mídia completa (RPMI 1640 mídia com 10% FBS, 1% L-glutamina (Gln-L), 1% penicilina/estreptomicina (caneta/Strep)) para cada tubo de lavar ambos pulsado e unpulsed nas células-alvo. Gire as células remanescentes à temperatura ambiente durante 5 min à 475 x sobrenadante de aspirado de g..</li>
</ol>7. preparação de CFSE para etiquetar Splenocytes alvo
<ol><li>
Preparar a solução de criação de etiquetas CFSE durante a célula lavar na etapa 6.3; as células pulsadas serão rotuladas como CFSEOi e o unpulsed como CFSEEis. Prepare-se 1 mL de solução CFSE-rotulagem de 106 células. Nota: CFSE é sensível à luz e deve ser protegido da luz em todos os momentos.<ol>
<li>Preparar CFSEOi -rotulagem mídia adicionando 1 uL/mL CFSE (solução de 5 mM) para uma concentração final de 5 µM/mL na mídia RPMI 1640 com 2% FBS.</li>
		<li>Preparar CFSEEis -rotulagem mídia adicionando 1 uL/mL CFSE (solução 0,5 mM) para uma concentração final de 0,5 mídia µM/mL RPMI 1640 com 2% FBS.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. rotulagem dos Splenocytes alvo com CFSE
Nota: CFSE rotulagem deve ser executada de maneira estéril.
<ol><li>Ressuspender as células alvo pulsado e unpulsed (da etapa 6.3) em 106 células/mL CFSE-rotulagem meios de comunicação. Ressuspender as células pulsadas com preparados CFSEOi-rotular a mídia e as células unpulsed com preparados CFSEEis-rotulagem mídia.</li>
	<li>Mistura de células e mídia CFSE-rotulagem por inversão suave ou agitação. Não misture num Vortex. Incubar as células e mídia CFSE-rotulagem a 37 ° C durante 15 min. Remix as células cada 5 min.</li>
	<li>Adicione 10 mL de mídia completa de células de suspensão e girar cada célula em temperatura ambiente por 5 min a 475 x g.</li>
	<li>Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 10 mL de PBS frio. Gire as células a 4 ° C por 5 min a 475 x g.</li>
	<li>Repita a etapa 8.4.</li>
	<li>Contar as células e a mistura do peptide-pulsado, CFSEOi-rotulado com unpulsed, CFSElo-rotulado células na proporção de 1:1 para injeção em ratos destinatários. Manter uma alíquota de 1 x 106 misturada de células a ser usado para uma avaliação de citometria de fluxo da linha de base (seção 11). Nota: O volume final para injeção é de 100 µ l por rato. A contagem de células final é 10e6 células. Perda do volume na seringa e agulha precisa ser levado em conta e deve ser estimada em 500 µ l.</li>
</ol>9. injeção de células-alvo
Nota: Mantenha células CFSE-etiquetadas, protegidas da luz, antes e durante a injeção, tanto quanto possível.
<ol><li>Coloque destinatários camundongos C57BL/6 em uma retenção com o lado dorsal. Pulverizar a superfície de base de cauda de injeção com álcool isopropílico a 70%. Administre 100 µ l de suspensão de célula única por via intravenosa na veia da cauda com o lado de bisel voltado para cima.</li>
</ol>10. re-isolamento de células-alvo
Nota: O timing desta etapa é crítica e dependente da citotoxicidade CTL e a força do antígeno para a estimulação. Para avaliação de matar um alvo264 -pulsado óvulos257–, as células precisam ser colhido 4-6 h após a injeção. Desde que as células CFSE-etiquetados são luz sensíveis, processos baços no escuro.
<ol><li>Eutanásia os destinatários camundongos C57BL/6 de acordo com o método de asfixia aprovado CO2 .</li>
	<li>Remova spleen(s) como na etapa 2.1.1. Desagregar o baço e lavar splenocytes como em passos 2.2.1 - 2.2.3. Lyse pilhas de sangue vermelhas como em etapas 2.3 - 2.3.2.</li>
	<li>Ressuspender as células em uma célula de fluorescência ativada 1 mL classificação Reserva (FACs) (1% de BSA + PBS) para avaliação por citometria de fluxo.</li>
</ol>11. retenção de lógica para determinar a atividade CTL por citometria de fluxo
<ol><li>
Realize a avaliação da atividade CTL usando um protocolo de citometria de fluxo padrão. Adquira as células usando o canal FITC em um citômetro de fluxo com um 488 nm laser para excitação11.
	<ol>
<li>Portão em linfócitos ao vivo usando os parâmetros de dispersão (SSC) dispersão direta (FSC) vs lado. Subjulgá dentro do portão de linfócitos ao vivo para a população total de CFSE-positivo. Nota: As células injetadas CFSE-rotulado comporão um pequeno subconjunto dos linfócitos totais presentes no baço. As células de CSFE-positivo devem aparecer como duas populações distintas sobre a escala logarítmica.</li>
		<li>Use um formato de histograma para determinar a porcentagem do unpulsed (esquerdo pico, CFSEEis) e pulsado (certo pico, CFSEOi) populações. Perda das CFSEOi células indica atividade CTL antígeno-específicas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+quantification+of+T+cell-mediated+cytotoxicity+using+cell-permeable+fluorogenic+caspase+substrates.">Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates.</a> Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).</li><li>Wherry, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+relationship+and+protective+immunity+of+memory+CD8+T+cell+subsets.">Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets.</a> Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+flow+cytometry-based+cytotoxic+T-lymphocyte+assay+through+detection+of+cleaved+caspase+3+in+target+cells.">A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells.</a> J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).</li><li>Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+rapid+in+vivo+killing+by+memory+CD8+T+cells.">Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells.</a> J Immunol. 171 (1), 27-31 (2003).</li><li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorescent+target+arrays+for+assessment+of+T+cell+responses+in+vivo.">The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo.</a> J Vis Exp. (88), e51627 (2014).</li><li>Johansson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell+education+in+mice+with+single+or+multiple+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules.">Natural killer cell education in mice with single or multiple major histocompatibility complex class I molecules.</a> J Exp Med. 201 (7), 1145-1155 (2005).</li><li>Hailemichael, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+antigen+at+vaccination+sites+induces+tumor-specific+CD8(+)+T+cell+sequestration,+dysfunction+and+deletion.">Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion.</a> Nat Med. 19 (4), 465-472 (2013).</li><li>Overwijk, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+regression+and+autoimmunity+after+reversal+of+a+functionally+tolerant+state+of+self-reactive+CD8++T+cells.">Tumor regression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells.</a> J Exp Med. 198 (4), 569-580 (2003).</li><li>Cho, H. I., Celis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+peptide+vaccines+eliciting+extensive+CD8+T-cell+responses+with+therapeutic+antitumor+effects.">Optimized peptide vaccines eliciting extensive CD8 T-cell responses with therapeutic antitumor effects.</a> Cancer Res. 69 (23), 9012-9019 (2009).</li><li>Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+for+pre-clinical+study+of+human+cancer+immunotherapy.">Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy.</a> Curr Protoc Immunol. 108, 21-43 (2015).</li><li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types.">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li><li>Durward, M., Harms, J., Splitter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+specific+killing+assay+using+CFSE+labeled+target+cells.">Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells.</a> J Vis Exp. (45), (2010).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Enquanto este protocolo é simples, existem alguns passos críticos que devem ser executados com cuidado. A escorva covax após injeção da antígeno-específicas células T sendo testada é necessária ver qualquer matança dos alvos pulsados. Embora seja possível que a vacinação covax à base de água cria uma condição inflamatória aguda, para a fase inflamatória crônica, substituindo a formulação de curta duração à base de água com uma abordagem baseada em óleo de liberação lenta-antigénio pode prod...

Múltiplos protocolos existem para avaliar o potencial (CTL) citolítica de um CD8+ ou CD4+ células T. Esta avaliação pode ser facilmente feita em vitro sob condições controladas1,2,3. Além disso, modelos de doenças infecciosas, tais como LCMV, classicamente têm examinado a função CTL através do uso de diferencialmente CFSE (5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetato succinimidil éster) rotulada nas células-alvo onde o CFSEOi-pilhas etiquetadas são pulsado com um peptídeo e CFSEEis-etiquetado alvo, as células são deixadas unpulsed. As células são então injetadas na proporção de 1:1 e avaliados em relação à perda do CFSEOi-etiquetados pulsados alvos por citometria de fluxo4. Modelos de vacina e rejeição também usaram estratégias semelhantes para avaliação do na vivo matando por ambos os CD8+ e CD4+ T células bem como NK células5,6. Isto é um ensaio poderoso, mas requer o uso de agentes infecciosos que encha o sistema imunológico antes da injeção do alvo.
Este protocolo, por outro lado, não requer nenhuma infecção prévia do host e em vez disso, utiliza uma estratégia de vacinação para prime o sistema imunológico antes da injeção do alvo. Esta vacinação é composta por uma formulação à base de água de vacina de peptídeo que exige a prestação de um cocktail de immunostimulatory chamado covax7, consistindo de um receptor Toll-like 7 (TLR7) agonista (imiquimod creme), uma agonística anti-CD40 anticorpo e a interleucina-2 (IL-2) levando a combinação sinérgica de immunostimulatory agentes para o levantamento de escorva de peptídeo específico e robusta resposta imune. Como tal, este ensaio fornece uma leitura rápida da função CTL como a vacina é administrada junto com as células para avaliação da função de apenas três dias antes da injeção das células alvo. Além disso, a preparação de covax é forte o suficiente para que a capacidade de abate da célula T antígeno-específicas aprontada pode ser vista entre 4 e 24 h após a injeção.
A principal limitação do presente protocolo é identificar o cronograma na vivo para a detecção de matança de destino que é apropriada para o antígeno e a hipótese a ser testada. Cuidadosa avaliação deve ser realizada, como variações na força de antígeno, bem como alterações genéticas sendo testado em células T pode resultar em função CTL diferencial que exigiria uma detecção de temporização diferente de matar alvo. Além disso, enquanto que a concentração adequada de peptídeo para vacinação foi otimizada para melanoma humano antígeno glicopeptídeo 100 (hgp10025-33) e ovalbumina257-264 (óvulos257-264)8,9 , uso de outro modelo de antígeno que pode ser mais apropriado para um determinado estudo exigiria mais validação. Por causa de diferenças antecipadas na capacidade dos antígenos um alvo para estimular a função efetora CTL em combinação com o covax como adjuvante, otimização da frequência de concentração e dose de dose IL-2 pode ser essencial para atingir o objetivo desejado. Em geral, este protocolo permite uma avaliação rápida de matar função na vivo e pode ser adaptado a qualquer determinado antígeno.

<table style="border-collapse:collapse;width:523pt" width="697">
	<colgroup>
		<col style="width:199pt" width="265" />
		<col style="width:110pt" width="146" />
		<col style="width:89pt" width="119" />
		<col style="width:125pt" width="167" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">6- to 12-week old female C57BL/6 mice&#160;</td>
			<td class="xl69" style="width:110pt" width="146">Charles River</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">027</td>
			<td style="width:125pt" width="167">C57 Black 6 mice</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">OT-1 6-12-week old female mice&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Jackson Labs</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">003831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24" style="height:18.0pt">
			<td height="24" style="height:18.0pt">hgp10025&#8211;33&#160;</td>
			<td class="xl69">CPCScientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">834139</td>
			<td>KVPRNQDWL</td>
		</tr>
		<tr height="24" style="height:18.0pt">
			<td height="24" style="height:18.0pt">OVA 257&#8211;264&#160;</td>
			<td class="xl69">CPCScientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">MISC-012</td>
			<td>SIINFEKL</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="height:15.0pt">Imiquimod cream 5%&#160;</td>
			<td class="xl69">Fougera</td>
			<td class="xl73">51672-4145-6</td>
			<td>Aldara Cream</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="height:15.0pt">CD40-specific mAb&#160;</td>
			<td class="xl69">BioXcell</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">BE0016-2</td>
			<td>clone FGK4.5</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="height:15.0pt">rhIL-2 protein&#160;</td>
			<td class="xl69">Hoffman LaRoche Inc</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">136</td>
			<td>Recombinant human IL-2 protein</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="height:15.0pt">70% isopropyl alcohol Prep&#160;</td>
			<td class="xl69">Kendall</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">S-17474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="height:15.0pt">PBS</td>
			<td class="xl69">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">10010-023</td>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">FBS</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">26140-079</td>
			<td>fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">RBC lysis buffer&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">A10492-01</td>
			<td>red blood cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">RPMI 1640 Media</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">11875119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">L-Glutamine&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">Pen/Strep</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">15140122</td>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">CFSE</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">C34554</td>
			<td>5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Sigma&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">1.5 mL MCT graduated natural&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Fisher</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">05-408-129</td>
			<td>microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">70% ethanol</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Fisher</td>
			<td class="xl73">BP8201500</td>
			<td>EtOH</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">Trypan blue solution, 0.4%&#160;&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">Hemocytometer</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Fisher</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">27 gauge needle</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">BD</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">1 mL syringe</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">BD</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">309659</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo assay for detection of antigen-specific t-cell cytolytic function using a vaccination model

Metodologias atuais para matar antígeno-específicas são limitadas para uso em vitro ou utilizadas em modelos de doenças infecciosas. No entanto, há não um protocolo especificamente concebido para medir o antígeno-específicas matança sem uma infecção. Este protocolo é projetado e descreve métodos para superar essas limitações, permitindo a detecção de antígeno-específicas matando de uma célula-alvo por CD8+ T células na vivo. Isso é realizado através da fusão de um modelo de vacinação com um alvo marcado CFSE tradicional matando o ensaio. Esta combinação permite que o pesquisador avaliar o potencial CTL antígeno-específicas diretamente e rapidamente como o ensaio não é dependente do crescimento do tumor ou infecção. Além disso, a leitura é baseada em citometria de fluxo e assim deve ser facilmente acessível para a maioria dos pesquisadores. A principal limitação do estudo é identificar o cronograma na vivo que é apropriado para a hipótese a ser testada. Variações na força de antigénio e mutações nas células T que podem resultar em função citolítica diferencial precisam ser cuidadosamente avaliada para determinar o momento ideal para colheita da pilha e avaliação. A concentração apropriada de peptídeo de vacinação foi otimizada para hgp10025-33 e óvulos257-264, mas ainda mais validação seria necessária para outros peptídeos que podem ser mais adequados para um determinado estudo. Em geral, este protocolo permite uma avaliação rápida de matar função na vivo e pode ser adaptado a qualquer determinado antígeno.

Antes da injeção de células-alvo CFSE-etiquetadas, a mistura de 1:1 célula é executada em um citômetro de fluxo para determinar as frequências de linha de base de ambos o CFSEOi e CFSEEis nas células-alvo. Figura 1 A mostra a estratégia associada para detectar mudanças nas populações CFSE, um portão inicial é feito usando parâmetros de FSC e SSC. As células CFSE positivo totais então são subgated antes ...

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In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

O objetivo do presente protocolo é permitir detecção de in vivo matando de uma célula-alvo em um modelo murino de antígeno-específicas.

Na Vivo Ensaio para detecção de células T antígeno-específicas função citolítica usando um modelo de vacinação

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

in-vivo-assay-for-detection-antigen-specific-t-cell-cytolytic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

9.8K visualizações.  University of Texas MD Anderson Cancer Center. O objetivo do presente protocolo é permitir detecção de in vivo matando de uma célula-alvo em um modelo murino de antígeno-específicas.

Vídeo: In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation. This labeling has classically been used to study proliferation and migration. In the method presented here, we have shortened the timeline after adoptive transfer to look at survival and killing of epitope specific CFSE labeled target cells4-6. The level of specific killing of a CD8 + T cell clone can indicate the quality of the response, as their quantity may be misleading. Specific CD8+ T cells can become functionally exhausted over time with a decline in cytokine production and killing7,8. Also, certain CD8 + T cell clones may not kill as well as others with differing TCR specificities9. For effective Cell Mediated Immunity (CMI), antigens must be identified that produce not only adequate numbers of responding T cells, but also functionally robust responding T cells. Here we assess the percent cell specific killing of two peptide specific T cell clones in BALB/c mice.

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Many infections elicit a strong CTL response, but occasionally, the quantity of responding cells does not correlate to control of the pathogen1. One measure of CTL quality is their ability to kill specifically2. CFSE labeling of target cells can be used to investigate this CTL response quality in vivo3,4.

Specific Antigen In Vivo Ensaio Killing usando células CFSE rotuladas Alvo

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

Imunologia e Infecção

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

Indução de enxerto-versus-hospedeiro de Doenças e<em&gt; Em Vivo</em&gt; Monitoramento celular T Usando um modelo murino de MHC de correspondência

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Trans-vivo Delayed Type Hypersensitivity Assay for Antigen Specific Regulation

Delayed-type hypersensitivity response (DTH) is a rapid in vivo manifestation of T cell-dependent immune response to a foreign antigen (Ag) that the host immune system has experienced in the recent past. DTH reactions are often divided into a sensitization phase, referring to the initial antigen experience, and a challenge phase, which usually follows several days after sensitization. The lack of a delayed-type hypersensitivity response to a recall Ag demonstrated by skin testing is often regarded as an evidence of anergy. The traditional DTH assay has been effectively used in diagnosing many microbial infections.
Despite sharing similar immune features such as lymphocyte infiltration, edema, and tissue necrosis, the direct DTH is not a feasible diagnostic technique in transplant patients because of the possibility of direct injection resulting in sensitization to donor antigens and graft loss. To avoid this problem, the human-to-mouse "trans-vivo" DTH assay was developed 1,2. This test is essentially a transfer DTH assay, in which human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and specific antigens were injected subcutaneously into the pinnae or footpad of a na&iuml;ve mouse and DTH-like swelling is measured after 18-24 hr 3. The antigen presentation by human antigen presenting cells such as macrophages or DCs to T cells in highly vascular mouse tissue triggers the inflammatory cascade and attracts mouse immune cells resulting in swelling responses. The response is antigen-specific and requires prior antigen sensitization. A positive donor-reactive DTH response in the Tv-DTH assay reflects that the transplant patient has developed a pro-inflammatory immune disposition toward graft alloantigens.
The most important feature of this assay is that it can also be used to detect regulatory T cells, which cause bystander suppression. Bystander suppression of a DTH recall response in the presence of donor antigen is characteristic of transplant recipients with accepted allografts 2,4-14. The monitoring of transplant recipients for alloreactivity and regulation by Tv-DTH may identify a subset of patients who could benefit from reduction of immunosuppression without elevated risk of rejection or deteriorating renal function.
A promising area is the application of the Tv-DTH assay in monitoring of autoimmunity15,16 and also in tumor immunology 17.

We describe a valuable diagnostic assay that could potentially be used to decide the withdrawal of immunosuppression after transplant without elevated risk of graft rejection. The assay uses the principles of Delayed Type Hypersensitivity and provides accurate assessment of both donor specific effector and regulatory immune responses mounted by recipients.

Trans-vivo Atraso Tipo Ensaio Hipersensibilidade para o Antigen Regulamento Específico

Delayed-type hypersensitivity response (DTH) is a rapid in vivo manifestation of T cell-dependent immune response to a foreign antigen (Ag) that the host ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of immunotherapies. Here we describe the use of fluorescent target array (FTA) technology, which utilizes vital dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), violet laser excitable dyes (CellTrace Violet: CTV) and red laser excitable dyes (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD) to combinatorially label mouse lymphocytes into &#62;250 discernable fluorescent cell clusters. Cell clusters within these FTAs can be pulsed with major histocompatibility (MHC) class-I and MHC class-II binding peptides and thereby act as target cells for CD8+ and CD4+ T cells, respectively. These FTA cells remain viable and fully functional, and can therefore be administered into mice to allow assessment of CD8+ T cell-mediated killing of FTA target cells and CD4+ T cell-meditated help of FTA B cell target cells in real time in vivo by flow cytometry. Since &#62;250 target cells can be assessed at once, the technique allows the monitoring of T cell responses against several antigen epitopes at several concentrations and in multiple replicates. As such, the technique can measure T cell responses at both a quantitative (e.g.&#160;the cumulative magnitude of the response) and a qualitative (e.g.&#160;functional avidity and epitope-cross reactivity of the response) level. Herein, we describe how these FTAs are constructed and give an example of how they can be applied to assess T cell responses induced by a recombinant pox virus vaccine.

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in detail in vivo is important for the development of our understanding of the immune response. Here we describe the use of fluorescent target arrays (FTAs) in an in vivo T cell assay that assesses &#62;250 parameters simultaneously by flow cytometry.

O Uso de fluorescentes alvo Matrizes para a Avaliação de respostas de células T<em&gt; In vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

Um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo de um Ataque de T-Cell dirigiu-Oligodendrocyte em Agudos fatias de cérebro

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Imaginologia todo animal e técnicas de citometria de fluxo para CD8 + respostas de células T Análise do antigénio específico da Nanoparticle após vacinação

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

Avaliando Retinal microglia fagocítica Função<em&gt; In Vivo</em&gt; Usando um ensaio baseado em citometria de fluxo

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

Gerando<em&gt; De Novo</em&gt; Antígeno-específica T Humano receptores celulares por Transdução retroviral de Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.

A simple yet effective method that employs magnetic nanoparticles to detect and enrich antigen-reactive B cells for functional and phenotypic analysis is described.

Detecção e enriquecimento da Rare células B antígeno-específica para a análise do fenótipo e função

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in human sera and in separate preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin (IVIg). The protocol describes the methodological steps involved in sample preparation, printing of arrays, assay procedure, and data analysis. In addition, this protocol could be further developed to incorporate diverse clinical samples including plasma and cell culture supernatants. We show how protein microarray can be used to determine a combination of isotype (IgG, IgA, IgM), subclass (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), and strain-specific antibodies to highly purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087), toxin B from a C. difficile toxin-B-only expressing strain (CCUG 20309), a precursor form of a B fragment of binary toxin, pCDTb, ribotype-specific whole surface layer proteins (SLPs; 001, 002, 027), and control proteins (tetanus toxoid and Candida albicans). During the experiment, microarrays are probed with sera from individuals with C. difficile infection (CDI), individuals with cystic fibrosis (CF) without diarrhea, healthy controls (HC), and from individuals pre- and post-IVIg therapy for the treatment of CDI, combined immunodeficiency disorder, and chronic inflammatory demyelinating polyradiculopathy. We encounter significant differences in toxin neutralization efficacies and multi-isotype specific antibody levels between patient groups, commercial preparations of IVIg, and sera before and following IVIg administration. Also, there is a significant correlation between microarray and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for antitoxin IgG levels in serum samples. These results suggest that microarray could become a promising tool for profiling antibody responses to C.difficile antigens in vaccinated or infected humans. With further refinement of antigen panels and a reduction in production costs, we anticipate that microarray technology may help optimize and select the most clinically useful immunotherapies for C. difficile infection in a patient-specific manner.

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

This article describes a simple protein microarray method for profiling humoral immune responses to a 7-plex panel of highly purified Clostridium difficile antigens in human sera. The protocol can be extended for the determination of specific antibody responses in preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin.

Um ensaio de Microarray da proteína para determinação sorológica do antígeno-específicas anticorpo respostas seguintes Clostridium difficile infecção

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in ...