Este estudo foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde conceder 1K22AI097291-01 e pelo Centro Nacional para a Promoção da Ciência Translational dos Institutos Nacionais de Saúde sob Award Número UL1TR000433. Nós também reconhecemos Prof. Darrell Irvine no MIT e Prof. Matthias Stephan no Fred Hutchinson Cancer Center por sua contribuição no trabalho inicial sobre as nanopartículas de vacinas e camundongos transgênicos OT-I / Luc.

Todas as experiências descritas neste protocolo foi aprovado pelo Comitê Universidade de uso e cuidados dos Animais (UCUCA) na Universidade de Michigan e realizado de acordo com as políticas e diretrizes estabelecidas. 1. Síntese e Caracterização de ICMVs Co-carregado com proteína Antígeno e Adjuvante Moléculas <ol><li> Mistura 1: 1 de razão molar de 1,2-dioleoyl- sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) e 1,2-dioleoyl--sn-glicero-3-phosphoethanolamine- N - [4- (p -maleimidophenyl) butiramida] (MPB) em clorofórmio, mantendo-se a quantidade total de lípidos em 1,26 umol por lote (isto é, 500 jig de DOPC e 630 ug de MPB) em um frasco de vidro de 20 ml (diâmetro = 28 mm e altura = 61 mm). </li><li> Adicionar fármacos lipofílicos, tais como monofosforil lípido A (MPLA) ou corantes lipofílicos (por exemplo, fez), para a solução de lípido na concentração desejada. Cuidadosamente remover o solvente orgânico por purga com nitroge extra-secon gás e colocando as amostras sob vácuo O / N. </li><li> Hidratar a película de lípidos pela adição de 200 ul de 10 mM de bis-Tris propano (BTP, pH 7,0) contendo fármacos solúveis em água (por exemplo, antigénios de proteína). Vortex durante 10 segundos cada 10 minutos durante 1 h à TA. </li><li> Transferir o conteúdo do frasco de vidro para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, as amostras lugar num banho de gelo-água, e sonicar continuamente durante 5 min, utilizando a intensidade de 40% em uma configuração de 125 W / 20 kHz sonda de sonicador de ponta. </li><li> Adicionar 4 mL de 150 mM de ditiotreitol (DTT) para cada lote (concentração de trabalho de 2,4 mM), vortex, e centrifuga-se brevemente utilizando um tampo de microcentrífuga. </li><li> Adicionar 40 ul de 200 mM CaCl 2 e misturar-se com a pipeta (concentração de trabalho de 33 mM). Incubar as amostras a 37 ° C durante 1 hora para permitir a reticulação da MPB contendo camadas lipídicas com DTT. </li><li> Centrifugar as amostras a 20.000 xg durante 15 min, remover o sobrenadante e ressuspender em 200 ul de ddiH 2 O. </li><li> Repetir o passo de 1,7 e centrifuga-se novamente após a segunda ddiH 2 O lavagem para remover de CaCl2, que não reagiu, DTT, não encapsulados e materiais de carga a partir do sobrenadante. </li><li> Prepare a 10 mg / ml de 2 kDa polietileno glicol-tiol (PEG-SH) em ddiH 2 O. Ressuspender cada amostra ICMV em 100 ul de solução de PEG-SH e incubar a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Execute duas ddiH 2 O lavagens (passo 1.7) e ressuspender o sedimento ICMV final em PBS e armazenar a 4 ° C. Antes de usar, misturar a suspensão ICMV, como partículas podem assentar no fundo após um armazenamento prolongado. </li><li> Para a caracterização de partículas, remover uma pequena alíquota (~ 10%) de ICMVs de cada lote individualmente e diluir num volume total de 1 ml de ddiH 2 O. Colocar uma única amostra num Zetasizer tamanho celular e medida da partícula, o índice de polidispersidade, e potencial zeta das amostras usando um sistema de medição de DLS e potencial zeta (de acordo com o protocolo do fabricante). </li></ol> 2. O exame do Linfonodo Drenagem de ICMVs Fluorescência-marcado com microscopia confocal <ol><li> Preparação de ICMVs carregado com antigénio marcado com fluoróforo e corante fluorescente lipof ílico <ol><li> Prepare a proteína marcada com fluororo, tal como ovalbumina feito reagir com éster de Alexa Fluor 555-succinimidilo, de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Para preparar ICMVs marcados com fluoróforo no invólucro lipídico, adicionar corante fluorescente lipof ílico, (por exemplo, 1,1&#39;-dioctadecil-3,3,3 &#39;, 3&#39;-Tetramethylindodicarbocyanine, (DID)) durante a preparação da película de lípido (Passo 1.2) na quantidade de 0,05% molar de lípido. Para a hidratação do lípido filme (Passo 1,3), tampão de utilização contendo o antigénio marcado com fluoróforo, e a síntese completa ICMV como descrito nas etapas 1,4-1,11. </li></ol></li><li> A administração subcutânea de nanoparticulas na base da cauda <ol><li> Anestesiar rato usando um vaporizador fluxo controlado equipado com uma câmara de indução utilizing 3% de isoflurano e 1,5 L / min de fluxo de oxigênio de acordo com um protocolo aprovado do IACUC animal. Uma vez que o mouse estiver inconsciente, execute os seguintes passos rapidamente antes da anestesia desgastar fora para permitir o acesso ideal para o local da injeção e minimizar o desconforto para o animal. Como alternativa, use um bom encaixe cone do nariz para manter a anestesia. Se os ratos são anestesiados por mais de 5 minutos, aplicar lubrificante ocular necessário para minimizar a irritação após o procedimento. </li><li> Pulveriza-se a base da cauda com etanol a 70% para higienizar e molhar a pele Parte o cabelo molhado para expor um pequeno pedaço de pele visível, que pode ser usado para visualizar a agulha sob a pele. </li><li> Prepare a suspensão de injecção de partículas, contendo a quantidade desejada de antigénio e adjuvante por 100 ul de dose de vacinação em PBS (por exemplo, 10 ug de OVA e 0,3 ug MPLA por 100 ul de dose injectada foi usado no passado 6,9). </li><li> Desenhe a suspensão de partículas intOA seringa com uma agulha de 27-29 G e inserir a agulha na base da cauda (~ 5 mm da linha fina) com o chanfro voltado para cima e injectar 50 ul da suspensão de partículas 22. </li><li> Aguarde alguns segundos para que a pressão para igualar para evitar back-fluxo excessivo e retire a agulha. Repetir a injecção do outro lado da base da cauda, ​​para atingir ambos os linfonodos de drenagem inguinais. </li></ol></li><li> Preparação de criosecções nódulos linfáticos e análise com microscopia confocal. <ol><li> Eutanásia o rato com asfixia com CO 2, seguida por pneumotórax produzido de acordo com um protocolo aprovado do IACUC animal. Extrair LNs inguinais acordo com o protocolo demonstrada em Bedoya 23 e lavar o sangue, colocando os tecidos em 1 mL de PBS a 4 ° C. </li><li> Absorve o PBS a partir dos tecidos com os tecidos e colocar o tecido no cryomolds tecido (10 x 10 x 5 mm3) pré-cheia para o topo com meio de congelação 24 de outubro. Snap congelar a tissue bloco em nitrogênio líquido por 30 s. Alternativamente, coloque bloco de tecido em gelo seco durante 30 minutos. Armazenar tecido congelado em freezer -80 ° C. </li><li> Os cortes de tecido de 5-10 mm de espessura num crióstato fixada em -20 ° C 24. </li><li> Se necessário, execute rotulagem de imunofluorescência, e examinar o tecido com microscopia confocal como demonstrado anteriormente 24. </li></ol></li></ol> 3. Monitoração de Expansão de antígeno específico da, luciferase expressando células T CD8 + após Nanoparticle vacinação com Whole animal de imagem <ol><li> Isolamento de OVA 257-264 -específica, células que expressam luciferase T CD8 + a partir de ratinhos transgénicos OT-I / Luc <ol><li> Euthanize um rato transgénico OT-I / Luc com asfixia com CO2 e induzir um pneumotórax de acordo com um protocolo aprovado do IACUC animal. Colher o baço de forma estéril através do acesso a cavidade peritoneal e separar cuidadosamente o tecido do pâncreas 23, elugar em 5 ml de PBS a 4 ° C + 2% FBS para a transferência de capuz de cultura de tecidos. </li><li> Inserir o baço sobre um filtro de nylon de 70? M ao longo de um tubo de centrífuga cónico de 50 ml (até 3 baços de cada vez). Utilizando um êmbolo de uma seringa de 3 ml, moer as células através do filtro. </li><li> Lavar o êmbolo e o filtro com PBS + 2% FBS e descartar. Levar o volume total a 10 ml / baço no tubo de 50 ml, levar uma pequena amostra da suspensão de células para contagem com um hemocitómetro, e centrifuga-se durante 10 min a 300 x g. </li><li> Utilizando um kit de selecção negativa magnética comercialmente disponível, isolar a população de células T CD8 +, seguindo as instruções do fabricante. </li><li> Depois de lavar as células com PBS, contar o número de células T CD8 + isoladas. Para avaliar a pureza das células T CD8 + isoladas, incubar ~ 20.000-30.000 células em 20 ul de rato CD16 / 32 anticorpo (0,025 mg / ml) durante 10 min, em seguida, adicionar 20 ul de anticorpo αCD8-APC (0,005 mg / ml) e incubar durante 30 min. Perform todas as incubações a 4 ° C em PBS + 1% w / v BSA. Realizar análise de citometria de fluxo 25. </li></ol></li><li> A transferência adoptiva de células T CD8 + isoladas e visualização da sua vacinação pós expansão <ol><li> Realizar a transferência adoptiva de células isolado OT-I / Luc T CD8 + em naïve C57BL / 6 ratos por administração de 1-10 x 10 5 células em um volume de 200 ul de PBS por via de injecção intravenosa na veia da cauda 22 (dia -1). Considerando que as manchas da pele e da pele preta em camundongos C57BL / 6 podem interferir com o sinal bioluminescente, albinos raspada camundongos C57BL / 6 são ideais para esses estudos. </li><li> Depois de um dia (dia 0), administrar a vacina como previamente descrito (secção 2.2). </li><li> Administrar 150 mg de luciferina por kg de peso corporal do ratinho por via intraperitoneal num volume de 300 ul de PBS. Após 10 min, anestesiar os ratos com isoflurano (como no passo 2.2.1) e visualizar as células AT-I / Luc T CD8 + através da aquisição do sinal de bioluminescência durante 5-10 min wom um sistema de imagem animal inteiro (IVIS; referem-se a Wilson 26 para instruções detalhadas). Repita conforme necessário para os estudos longitudinais. </li></ol></li></ol> As células T CD8 + 4. péptido-MHC Tetrâmero Coloração de PBMC para análise do antigénio específico da- Nota: O procedimento seguinte protocolo pode ser realizada utilizando tanto ratinhos C57BL / 6 com células transferidas adoptivamente OT-I / Luc T CD8 + ou ratinhos C57BL / 6, sem a transferência adoptiva. <ol><li> Num ponto de tempo desejado após a vacinação, recolher aproximadamente 100 mL de sangue (4-6 gotas) a partir de ratinhos por sangramento submandibular técnica 27 dentro de um tubo revestido com K2EDTA e gire várias vezes para evitar a coagulação. </li><li> Transferir 100 uL de sangue para um tubo de microcentrífuga, adicionar 1 ml de tampão de lise, e incubar durante 2 a 3 minutos, a fim de remover as células vermelhas do sangue (RBC). Centrifugar as amostras durante 5 min a 1500 x g e eliminar o sobrenadante. Se o sedimento ainda umppears vermelho (indicando remoção incompleta de hemácias), repita o passo de lise com uma breve incubação (&lt;1 min) de lise. </li><li> Lavam-se as PBMC restantes com 1 ml de tampão de FACS (PBS + 1% p / v de BSA) e centrifugar a 1500 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender a amostra em 20 ul de rato CD16 / 32 anticorpo (0,025 mg / ml) para bloquear o anticorpo não específico e FcR-mediada de ligação. Incubar durante 10 min à TA. </li><li> Células transferir de microtubos em 4 ml tubos de FACS de fundo redondo. Adicionar 20 ul de H-2K b solução de OVA SIINFEKL Tetrâmero-PE de acordo com as especificações do fabricante para cada amostra e incubar durante 30 min em gelo. </li><li> Preparar a mistura de anticorpos (por exemplo, αCD8-APC, αCD44-FITC, e αCD62L-PECy7 anticorpos (0,005, 0,005, e 0,002 mg / ml de concentração, respectivamente)). Adicionar 20 ul de cada amostra experimental, e incubar durante 20 min em gelo. Preparar controlos fluoróforo individuais por labeling células com cada tetrâmero marcado com fluoróforo ou o anticorpo na concentração indicada acima. </li><li> Lavar duas vezes com tampão FACS e ressuspender o sedimento final em tampão FACS contendo 2 mg / ml de DAPI. As células são agora pronto para a análise de citometria de fluxo (detalhes e exemplos podem ser encontrados em Scheffold 25). </li></ol>

Perkin Elmer, desde que o custo de produção incorridos durante a publicação deste artigo.

O protocolo fornecido neste artigo descreve a síntese e caracterização de um novo sistema de nanopartículas à base de lípidos, denominado ICMVs, e fornece o processo de validação da eficácia de formulações de vacinas à base de nanopartículas para induzir respostas de CD8 +, células T específicas de antigénio. ICMV síntese é completada em todas as condições aquosa, o que é uma grande vantagem em comparação com outros sistemas habitualmente utilizados nanopartículas poliméricas (por exemplo,</...

Desenvolvimento tradicional vacina tem utilizado, principalmente, a abordagem empírica de tentativa-e-erro. No entanto, com o recente desenvolvimento de uma grande variedade de biomateriais e descoberta de determinantes moleculares de activação imunitária, é agora possível conceber racionalmente formulações de vacinas com pistas biofísicas e bioquímicas derivados de patogénios 1,2. Em particular, várias plataformas de entrega de droga de partículas foram examinados como transportadores de vacinas uma vez que podem ser co-carregadas com antigénios de subunidade e agentes imunoestimulantes, proteger os componentes da vacina contra a degradação, e aumentar a sua co-entrega a células apresentadoras de antigénio (APCs), residente em linfa nodos (LNs), maximizando assim a estimulação e activação imunitária 3-5. Neste relatório, descreve-se a síntese de um sistema de nanopartículas &quot;-imitando agente patogénico&quot;, denominados interbilayer reticulado vesículas multilamelares (ICMVs), que tenham sido previamente demonstrado como uma vacina potente Platform para elicitação de robusto de linfócitos T citotóxicos (CTL) e respostas imunitárias humorais em ambos os compartimentos dos tecidos das mucosas e sistémicas 6-9. Em particular, a vacinação com ICMVs alcançado substancialmente melhorada níveis de IgG no soro contra um antigénio da malária, em comparação com a vacinação com adjuvantes convencionais (por exemplo, alúmen e Montanide 7) e também induziu respostas CTL potentes contra células tumorais e modelos de desafio virais em ratinhos 9. Aqui, usando ICMVs como um sistema de nanopartículas vacina modelo, descrevem métodos para caracterização de nano-vacinais formulações, incluindo tamanho de partícula e medições de potencial zeta e monitoramento do tráfico de partículas para linfonodos drenantes (dLNs) utilizando confocal imagem de tecidos criosseccionada 7. Além disso, apresenta-se um método baseado no de imagem inteira em animais de análise de expansão de respostas por CTL em ratinhos após a transferência adoptiva de células específicas para o antigénio T CD8 + que expressam luciferase 9,10. Finalmente, deescriba tetrâmero coloração de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) para quantificação longitudinal de respostas de células T endógenas em ratinhos vacinados com nanopartículas 6,9. ICMVs são uma formulação de nanopartículas à base de lípidos sintetizados por fusão controlada de lipossomas simples em estruturas multilamelares, que são então estabilizadas quimicamente por grupos de cabeça de fosfolípidos de reticulação funcionalizado com maleimida dentro camadas lipídicas com ditiol reticuladores 6. Uma vez ICMVs são sintetizados, uma pequena fracção de nanopartículas podem ser usadas para determinar o tamanho de partícula e potencial zeta (isto é, carga de superfície das partículas), com um sistema de dispersão de luz dinâmica (DLS), e um analisador de potencial zeta. DLS medidas de mudanças na dispersão de luz em suspensões de partículas, permitindo a determinação do coeficiente de difusão e o tamanho hidrodinâmico de partículas 11. Atingir o tamanho de partícula consistente de lote para lote é crítica sínteseuma vez que o tamanho de partícula é um dos principais factores que influenciam a drenagem linfática das partículas de vacinas para dLNs e subsequente absorção celular por APCs 12,13. Além disso, o potencial zeta pode ser obtido por medição da velocidade das partículas, quando uma corrente eléctrica é aplicada, o que permite a determinação da mobilidade electroforética das partículas e superfície das partículas de carga 11. Assegurar valores de potencial zeta consistentes de partículas é importante uma vez que a carga superficial das partículas determina a estabilidade coloidal, o que tem um impacto directo sobre a dispersão das partículas durante o armazenamento e após a administração in vivo 14,15. A fim de controlar a localização das partículas para dLNs, ICMVs pode ser marcado com fluoróforos desejados, incluindo corantes lipofílicos e antigénios covalentemente marcados. A seguir à imunização, os ratos podem ser sacrificados em vários pontos temporais, dLNs ressecado, criosseccionada, e analisados ​​com microscopia confocal. Esta técnica permite a visualização de drai linfáticoNing de ambos os veículos de vacina para antigénio de nanopartículas e dLNs. As secções de tecido podem ser adicionalmente coradas com anticorpos marcado por fluorescência e utilizada para obter mais informação, tais como tipos de células associadas com o antigénio e a formação de centros germinais como mostrámos anteriormente 7. Uma vez que a síntese de partículas é optimizada e tráfico para os dLNs é confirmada, é importante para validar elicitação de expansão de CTL in vivo. A fim de analisar a elicitação de células específicas para o antigénio T CD8 + em resposta à vacinação de nanopartículas, nós utilizamos um modelo de antigénio, ovalbumina (OVA), 257-264 péptido com OVA (SIINFEKL) epítopo imunodominante de células T CD8 +, o que permite que as análises imunológicas detalhados de respostas de células T específicas para o antigénio para o desenvolvimento de vacinas inicial 16,17. Em particular, para interrogar a dinâmica de expansão e migração de células específicas para o antigénio T CD8 +, que geraram ummodelo de ratinho transgénico duplo da luciferase do pirilampo por cruzamento de ratinhos transgénicos que expressam (Luc) com OT-I ratinhos transgénicos que possuem células T CD8 + com o receptor de células T (TCR) específico para SIINFEKL (em associação com H-2K b). A partir destes ratinhos OT-I / Luc, que expressam luciferase, as células AT-I T CD8 + pode ser isolado e preparado para transferência adoptiva para naive C57BL / 6. Uma vez semeadas, a imunização bem sucedida com nanopartículas contendo OVA resultará na expansão das células T transferidas, que podem ser controladas através da monitorização do sinal de bioluminescência com um sistema de imagem de animais 9,10 todo. Esta técnica de imagem não invasiva de corpo inteiro foi usado com outros antigénios virais ou tumorais no passado 18-20, processos envolvidos na expansão das células T em tecidos linfóides e difusão para os tecidos periféricos de um modo longitudinal revelando. Complementar para análise de adoptivamente células específicas de antigénio transferidos T CD8 +, endógenoas respostas das células T após vacinação nos pode ser examinado com o complexo de péptido-histocompatibilidade principal (MHC) de ensaio de tetrâmero 21, em que um complexo péptido-MHC de tetrâmero, que consiste de quatro marcado com fluoróforo do MHC de classe I de moléculas carregadas com epítopos de péptidos, é empregue TCR se ligar e marcar as células T CD8 + de um modo específico do antigénio. O ensaio de tetrâmero de péptido-MHC pode ser realizada tanto em estudos de necropsia terminais para identificar as células T CD8 + específicas para o antigénio em linfóides e tecidos periféricos ou em estudos longitudinais com células mononucleares do sangue periférico (PBMC) obtidas a partir de sangue em série chama. Após a coloração de linfócitos com péptido-MHC de tetrâmero, análise de citometria de fluxo é realizada por análises detalhadas sobre o fenótipo dos CTL ou quantificação da sua frequência entre as células T CD8 +.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. Synthesis and characterization of ICMVs co-loaded with protein antigen and adjuvant molecules</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, INC.</td>
			<td>870012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, INC.</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD&#8482;) (MPLA)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, INC.</td>
			<td>699800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass vials</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>0334125D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Symphny Vacuum Oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin (OVA)</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>3054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris Propane (BTP)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q125 Sonicator (125W/20kHz)</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q125-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 kDa Thiolated Polyethylene Glycol (PEG-SH)</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>MPEG-SH-2000-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern ZetaSizer Nano ZSP&#160;</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer Cuvettes</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Examination of lymph node draining of fluorescence-tagged ICMVs with confocal microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D-7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A37571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT freezing medium&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Cryomolds</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Monitoring expansion of antigen-specific, luciferase-expressing CD8+ T cells after nanoparticle vaccination with whole animal imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albino C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>000058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-1 C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>003831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m nylon strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep&#8482; Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>19853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS&#174; whole animal imaging system</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. Peptide-MHC tetramer staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for flow cytometric analysis of antigen-specific CD8+ T cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2EDTA tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>365974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysis buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10492-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD16/32 Fc Block</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>14-0161-86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H-2Kb OVA Tetramer</td>
			<td>MBL</td>
			<td>TS-5001-1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD8-APC</td>
			<td>BD</td>
			<td>553031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD44-FITC</td>
			<td>BD</td>
			<td>553133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD62L-PECy7</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>25-0621-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D8417-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyAn Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-animal imaging and flow cytometric techniques for analysis of antigen-specific cd8+ t cell responses after nanoparticle vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

Os passos envolvidos na síntese de ICMVs estão ilustrados na Figura 1 6. Resumidamente, uma película de lípido contendo quaisquer fármacos lipofílicos ou corantes fluorescentes é hidratado na presença de drogas hidrofílicas. Os catiões divalentes, tais como Ca 2+, são adicionados à unidade de fusão de lipossomas aniónicos em vesículas multilamelares. Ditiol agente de reticulação, tal como DTT, é adicionado a &quot;staple&quot; lípidos funcionalizado com maleimida...

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Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Imaginologia todo animal e técnicas de citometria de fluxo para CD8 + respostas de células T Análise do antigénio específico da Nanoparticle após vacinação

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

whole-animal-imaging-flow-cytometric-techniques-for-analysis-antigen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.1K visualizações.  University of Michigan. We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Vídeo: Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

Isolamento e análise de citometria de fluxo de células imunes do cérebro isquêmico Rato

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Imunologia e Infecção

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Citometria de fluxo e assassinas naturais celular Lytic Actividade em sangue total humano

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

Isolamento e Citometria de Fluxo Analysis of Human Endocervical Gama Cells Delta T

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in B-cell and plasma-cell production of antibodies, and detecting and eliminating cancer cells. The development of MHC-tetramer staining of antigen-specific T cells analyzed by flow cytometry has revolutionized our ability to study and understand the immunobiology of T cells. While extremely useful for determining the quantity and phenotype of antigen-specific T cells, flow cytometry cannot determine the spatial localization of antigen-specific T cells to other cells and structures in tissues, and current disaggregation techniques to extract the T cells needed for flow cytometry have limited effectiveness in non-lymphoid tissues. In situ MHC-tetramer staining (IST) is a technique to visualize T cells that are specific for antigens of interest in tissues. In combination with immunohistochemistry (IHC), IST can determine the abundance, location, and phenotype of antigen-specific CD8 and CD4 T cells in tissues. Here, we describe a protocol to stain and enumerate antigen-specific CD8 T cells, with specific phenotypes located within specific tissue compartments. These procedures are the same that we used in our recent publication by Li et al., entitled &#34;Simian Immunodeficiency Virus-Producing Cells in Follicles Are Partially Suppressed by CD8+ Cells In Vivo.&#34; The methods described are broadly applicable because they can be used to localize, phenotype, and quantify essentially any antigen-specific CD8 T cell for which MHC tetramers are available, in any tissue.

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

Here, we describe a method that combines in situ MHC-tetramer staining with immunohistochemistry to determine localization, phenotype, and quantity of antigen-specific T cells in tissues. This protocol is used to determine the spatial and phenotypic characteristics of antigen-specific CD8 T cells relative to other cell type and structures in tissues.

In Situ MHC-tetrâmero manchando e análise quantitativa para determinar a localização, abundância e fenótipo de células T de CD8 antígeno-específicas em tecidos

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

Na Vivo Ensaio para detecção de células T antígeno-específicas função citolítica usando um modelo de vacinação

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, influenza, diphtheria, and viral hemorrhagic fevers. We have demonstrated that plasmid-DNA (pDNA) vaccine delivery into the skin elicits robust humoral responses in the guinea pig. However, the use of this animal to model immune responses was somewhat limited in the past due to the lack of available reagents and protocols to study T cell responses. T cells play a pivotal role in both immunoprophylactic and immunotherapeutic mechanisms. Understanding T cell responses is crucial for the development of infectious disease and oncology vaccines and accommodating delivery devices. Here we describe an interferon-gamma (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay for guinea pig peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The assay enables researchers to characterize vaccine-specific T-cell responses in this important rodent model. The ability to assay cells isolated from the peripheral blood provides the opportunity to track immunogenicity in individual animals.

The development of the interferon-gamma ELISpot assay for guinea pig PBMCs allows the characterization of T-cell responses in this highly relevant model for studying infectious diseases. We have applied the assay to measure T cell responses associated with intradermal delivery of DNA vaccines.

Ensaio de ELISpot otimizado de Interferon-gama às respostas de célula T medida no modelo de porquinho da Índia após a vacinação

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...

Simultaneous Quantification of Anti-vector and Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I Tetramer Staining After Vaccination with a Viral Vector

Upon viral infection, antigen-specific CD8+ cytotoxic T cells (CTLs) arise and contribute to the elimination of infected cells to prevent the spread of pathogens. Therefore, the frequency of antigen-specific CTLs is indicative of the strength of the T cell response against a specific antigen. Such analysis is important in basic immunology, vaccine development, cancer immunobiology and the adaptive immunology. In the vaccine field, the CTL response directed against components of a viral vector co-determines how effective the generation of antigen-specific cells against the antigen of interest (i.e., transgene) is. Antigen-specific CTLs can either be detected by stimulation with specific peptides followed by intracellular cytokine staining or by the direct staining of antigen-specific T cell receptors (TCRs) and analysis by flow cytometry. The first method is rather time-consuming since it requires sacrificing of animals to isolate cells from organs. Also, it requires isolation of blood from small animals which is difficult to perform. The latter method is rather fast, can be easily done with small amounts of blood and is not dependent on specific effector functions, such as cytolytic activity. MHC tetramers are an ideal tool to detect antigen-specific TCRs.
Here, we describe a protocol to simultaneously detect antigen-specific CTLs for the immunodominant peptides of the viral vector VSV-GP (LCMV-GP, VSV-NP) and transgenes (OVA, HPV 16 E7, eGFP) by MHC I tetramer staining and flow cytometry. Staining is possible either directly from blood or from single cell suspensions of organs, such as spleen. Blood or single cell suspensions of organs are incubated with tetramers. After staining with antibodies against CD3 and CD8, antigen-specific CTLs are quantified by flow cytometry. Optionally, antibodies against CD43, CD44, CD62L or others can be included to determine the activation status of antigen-specific CD8+T cells and to discriminate between na&#239;ve and effector cells.

Simultaneous Quantification of Anti-vector and Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I Tetramer Staining After Vaccination with a Viral Vector

Here, we present a protocol for the ex vivo qualitative detection of antigen-specific CD8+ T cells. Analysis is possible with single cell suspensions from organs or from small amounts of blood. A broad range of studies require the analysis of cytotoxic T cell responses (vaccination and cancer immunotherapy studies).

Quantificação simultânea de vetor anti e Antiespecíficas do transgene CD8+ T células Via MHC tetrâmero coloração após a vacinação com um vetor Viral

Upon viral infection, antigen-specific CD8+ cytotoxic T cells (CTLs) arise and contribute to the elimination of infected cells to prevent the spread of ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte (CTL) responses elicited against tumor- and pathogen-derived peptides. They offer several advantages over traditional killing assays. First, they permit the monitoring of CTL-mediated cytotoxicity within architecturally intact secondary lymphoid organs, typically in the spleen. Second, they allow for mechanistic studies during the priming, effector and recall phases of CTL responses. Third, they provide useful platforms for vaccine/drug efficacy testing in a truly in vivo setting. Here, we provide an optimized protocol for the examination of concomitant CTL responses against more than one peptide epitope of a model tumor antigen (Ag), namely, simian virus 40 (SV40)-encoded large T Ag (T Ag). Like most other clinically relevant tumor proteins, T Ag harbors many potentially immunogenic peptides. However, only four such peptides induce detectable CTL responses in C57BL/6 mice. These responses are consistently arranged in a hierarchical order based on their magnitude, which forms the basis for TCD8 &#8220;immunodominance&#8221; in this powerful system. Accordingly, the bulk of the T Ag-specific TCD8 response is focused against a single immunodominant epitope while the other three epitopes are recognized and responded to only weakly. Immunodominance compromises the breadth of antitumor TCD8 responses and is, as such, considered by many as an impediment to successful vaccination against cancer. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular factors and mechanisms that dictate or shape TCD8 immunodominance. The protocol we describe here is tailored to the investigation of this phenomenon in the T Ag immunization model, but can be readily modified and extended to similar studies in other tumor models. We provide examples of how the impact of experimental immunotherapeutic interventions can be measured using in vivo cytotoxicity assays.

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

We describe here a flow cytometry-based in vivo killing assay that enables examination of immunodominance in cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses to a model tumor antigen. We provide examples of how this elegant assay may be employed for mechanistic studies and for drug efficacy testing.

Adaptando os ensaios de citotoxicidade in vivo para estudar Imunodominância em respostas de células T CD8+ específicas do tumor

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the key steps to investigate TRMs. There are slight variations in lymphocyte isolation protocols for different organs. Kidney is an essential non-lymphoid organ with numerous immune cell infiltration especially after pathogen exposure or autoimmune activation. In recent years, multiple labs including our own have started characterizing kidney resident CD8+ T cells in various physiological and pathological settings in both mouse and human. Due to the abundance of T lymphocytes, kidney represents an attractive model organ to study TRMs in non-mucosal or non-barrier tissues. Here, we will describe a protocol commonly used in TRM-focused labs to isolate CD8+ T cells from mouse kidneys following systemic viral infection. Briefly, using an acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection model in C57BL/6 mice, we demonstrate intravascular CD8+ T cell labeling, enzymatic digestion, and density gradient centrifugation to isolate and enrich lymphocytes from mouse kidneys to make samples ready for the subsequent flow cytometry analysis.

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Following viral infection, kidney harbors a relatively large number of CD8+ T cells and offers an opportunity to study non-mucosal TRM cells. Here, we describe a protocol to isolate mouse kidney lymphocytes for flow cytometry analysis.

Isolamento das células CD8+ T residentes em rim do rato para análise de citometria de fluxo

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice

The cell cycle of antigen-specific T cells in vivo has been examined by using a few methods, all of which possess some limitations. Bromodeoxyuridine (BrdU) marks cells that are in or recently completed S-phase, and carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) detects daughter cells after division. However, these dyes do not allow identification of the cell cycle phase at the time of analysis. An alternative approach is to exploit Ki67, a marker that is highly expressed by cells in all phases of the cell cycle except the quiescent phase G0. Unfortunately, Ki67 does not allow further differentiation as it does not separate cells in S-phase that are committed to mitosis from those in G1 that can remain in this phase, proceed into cycling, or move into G0.
Here, we describe a flow cytometric method for capturing a &#34;snapshot&#34; of T cells in different cell cycle phases in mouse secondary lymphoid organs. The method combines Ki67 and DNA staining with major histocompatibility complex (MHC)-peptide-multimer staining and an innovative gating strategy, allowing us to successfully differentiate between antigen-specific CD8 T cells in G0, in G1 and in S-G2/M phases of the cell cycle in the spleen&#160;and draining lymph nodes of mice after vaccination with viral vectors carrying the model antigen gag of human immunodeficiency virus (HIV)-1.
Critical steps of the method were the choice of the DNA dye and the gating strategy to increase the assay sensitivity and to include highly activated/proliferating antigen-specific T cells that would have been missed by current criteria of analysis. The DNA dye, Hoechst 33342, enabled us to obtain a high-quality discrimination&#160;of the G0/G1 and G2/M DNA peaks, while preserving membrane and intracellular staining. The method has great potential to increase knowledge about T cell response in vivo and to improve immuno-monitoring analysis.

Clonal expansion is a key feature of antigen-specific T cell response. However, the cell cycle of antigen-responding T cells has been poorly investigated, partly because of technical limitations. We describe a flow cytometric method to analyze clonally expanding antigen-specific CD8 T cells in spleen and lymph nodes of vaccinated mice.

Um ensaio de citometria de fluxo baseado em DNA/Ki67 para análise do ciclo celular de células CD8 T específicas de antígeno em camundongos vacinados

The cell cycle of antigen-specific T cells in vivo has been examined by using a few methods, all of which possess some limitations. Bromodeoxyuridine ...