O ensaio de migração transwell é uma técnica clássica que permite aos cientistas quantificar o movimento celular. A migração refere-se à capacidade de uma célula de se mover individualmente ou em clusters. Os movimentos celulares são possíveis através da reestruturação precisa de seu citoesqueleto e a migração geralmente ocorre em resposta a estímulos que agem como pistas.
Hoje, discutiremos o ensaio de migração transwell, que utiliza uma simples configuração de câmara para avaliar a migração em resposta à atração de pistas.
Começaremos fornecendo informações sobre a câmara transwell.
O aparelho foi projetado pela primeira vez pelo Dr. Stephen Boyden em 1961, que o usou para estudar a migração de leucócitos. Portanto, este método também é conhecido como ensaio da câmara de Boyden.
Em uma simples câmara de Boyden, a parede externa é dos poços, como os de uma placa de 96 poços. Dentro de cada poço, um transwell, que é uma inserção cilíndrica, é colocado. A inserção tem uma membrana de policarbonato de tamanho de poros definido. Quando colocado no poço, divide a câmara em dois compartimentos. O compartimento superior é onde as células cujo comportamento migratório deve ser estudado serão semeadas, e o reservatório inferior é onde a solução de quimioattractant é colocada. Por definição, um quimioattractant é uma molécula que tem a capacidade de promover a motilidade celular por "atrair células".
Devido a essas forças atraentes, as células no compartimento superior migram através dos poros para o reservatório inferior. Se as células tiverem propriedades aderentes, como algumas células de melanoma, seguindo o movimento elas "grudam" na parte inferior da membrana. Neste caso, a membrana pode ser fixada, manchada e as células podem ser contadas sob o microscópio. Por outro lado, células não aderentes, como o esperma, migrarão para o reservatório inferior. Neste caso, as células da solução do reservatório podem ser contadas com a ajuda de um hemócito.
Embora a configuração para este ensaio seja simples, há várias coisas que você precisa considerar antes do experimento. Vamos rever alguns deles.
Começando com a solução de semeadura, você tem que ter certeza de que a densidade é otimizada para observar a migração celular. Poucas células podem resultar em migração indetectável, e maiores densidades superpovoarão a membrana, dificultando a migração. A segunda consideração é o tamanho dos poros da pastilha. Deve ser cuidadosamente escolhido dependendo do tipo de célula. Se o tamanho dos poros for muito pequeno, as células não poderão passar.
Alternativamente, se o tamanho dos poros for muito grande, as células cairão, o que não é migração. Por fim, deve-se estar atento à concentração de quimioattractant e ao tempo de incubação para a migração, pois estes são interdependentes. A concentração ideal com o tempo de incubação adequado durante o qual o gradiente de concentração é mantido entre os compartimentos, induz a migração celular devido à quimio-atração. Por outro lado, incubações prolongadas podem ser acompanhadas de um equilíbrio de quimioattractant em toda a câmara levando à perda de gradiente químico, o que pode confundir a análise dos resultados obtidos.
Com essas considerações em mente, vamos discutir um protocolo usado para medir a migração de células aderentes.
As células a serem avaliadas são preparadas em um meio livre de protease, uma vez que as proteases podem desnaturar receptores de membrana importantes e, em última instância, afetar a migração. Após a preparação das células, a suspensão deve ser diluída para uma densidade de semeadura ideal. Para preparar a câmara, transwells são colocados em poços em uma placa multiwell. A suspensão celular deve ser pipetada no transwell sem tocar na membrana ou introduzir bolhas de ar.
A solução de quimioattractant é pipetada no reservatório inferior, certificando-se de que a solução toque na membrana da inserção. O tempo de incubação para a migração dependerá das considerações experimentais. Após a incubação, as membranas são fixadas mergulhando a inserção em 70% de etanol. Depois de permitir que a inserção seque, a solução de coloração celular é adicionada.
Em seguida, as células são incubadas por aproximadamente 30 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, as pastilhas são lavadas com a ajuda do tampão de lavagem. Finalmente, a membrana pode ser extirpada e colocada em um slide de microscópio. As células na parte inferior da membrana representam o número de células que migraram na presença e ausência de quimioattractants.
Já que, agora que você tem uma sensação para o protocolo, vamos dar uma breve olhada em como os pesquisadores estão usando esse método em suas explorações.
Uma das aplicações mais comuns deste ensaio é avaliar propriedades quimioattractant de compostos desconhecidos. Aqui, os cientistas estavam interessados em examinar caminhos de natação de espermatozoides de sapos na presença de alusão, que é uma substância secretada por ovos anfíbios. Para fazer isso, eles primeiro pipetted esperma de sapo ativo para o topo das pastilhas transwell. Ao fundo, eles adicionaram alusão. Depois de permitir que as células migrassem, elas contaram esperma na solução do reservatório sob um microscópio. Usando essa técnica, eles foram capazes de gerar uma curva de concentração-resposta representando o efeito da concentração de alusão na migração de espermatozoides.
Quando uma célula é atacada por patógenos, ela envia quimioattractants para recrutar células imunes que migram, anexam e, posteriormente, resolvem a infecção. Para testar esse fenômeno, esses cientistas cultivaram células epiteliais na parte inferior das pastilhas. Posteriormente, infectaram essas células com diferentes cepas de bactérias. Finalmente, eles introduziram células imunes na câmara superior. Sabe-se que as células infectadas produzem vários quimioattractants que induzem a migração de células imunes. Os resultados deste experimento demonstraram diferentes graus de migração de neutrófilos em resposta a diferentes tipos de infecção bacteriana.
Por fim, a invasão de células cancerígenas e a metástase através da matriz extracelular sempre intrigaram biólogos celulares. Aqui, os cientistas queriam determinar como os quimioattractants específicos podem contribuir para essa migração através de uma matriz 3D. Eles geneticamente projetaram duas piscinas separadas de células: uma expressando fluorescente verde, e outra fluorescente vermelha, proteína. Eles então pipetted uma matriz extracelular imitação para o topo de transwells.
Uma vez solidificados, eles inverteram o transwell e semearam duas piscinas de células na parte inferior da membrana. Em seguida, eles substituíram a inserção na placa multiwell e pipetted a solução quimioattractant para a câmara superior. Isso fez com que as células na parte inferior se movessem para cima e através da matriz 3D. Com a ajuda da imagem confocal, esses pesquisadores reconstruíram a migração celular em 3D, e distinguiram os padrões de migração de dois grupos de células.
Você acabou de assistir o vídeo de JoVE sobre o ensaio de migração transwell. Com a compreensão dos componentes e o protocolo deste método, agora você sabe por que é tão amplamente utilizado por biólogos celulares. Apesar da simplicidade desta configuração, a gama de configurações que este método pode adaptar torna-o indispensável para estudos de motilidade celular. Como sempre, obrigado por assistir!
