Espécies reativas de oxigênio produzidas nas células foram implicadas em homeostase tecidual, envelhecimento celular e estados de doenças como o câncer. Como o nome deles indica, essas moléculas surgem do oxigênio, que naturalmente existe como uma molécula estável de dioxígeno, já que todos os seus elétrons são emparelhados. A adição de um elétron não remassado torna-o instável, e leva à formação do ânion de superóxido — uma forma de espécie de oxigênio reativo ou ROS. Além do ânion de superóxido, existem vários tipos de espécies reativas com elétrons não relacionados, cujos níveis a célula pretende controlar firmemente.

Neste vídeo, vamos aprender como espécies de oxigênio reativo estão relacionadas ao metabolismo celular e doenças, explorar os princípios por trás de um ensaio para sua detecção usando uma sonda fluorescente, e vamos passar por cima de um protocolo generalizado para este ensaio. Por último, investigaremos como os cientistas estão implementando este método em experimentos hoje.

Primeiro, vamos discutir como espécies reativas de oxigênio são produzidas, e considerar sua influência no metabolismo celular e doenças.

Uma fonte significativa de espécies de oxigênio reativa celular são as mitocôndrias. Normalmente, durante o metabolismo celular, os elétrons são transportados através de uma cadeia de complexos proteicos, culminando na redução do oxigênio molecular para a água e na geração simultânea de ATP. Apesar da extraordinária regulação desse processo, os elétrons vazam, resultando na formação de ânion de superóxido.

A presença de ânion de superóxido rapidamente dá origem a outras formas de espécies reativas de oxigênio, como peróxido de hidrogênio e radical hidráxil. Esses radicais, que possuem um elétron não reactivetivo não resseco, podem danificar oxidativamente membranas, DNA e proteínas. Para neutralizar, a célula mantém seu próprio estoque antioxidante de enzimas como o superóxido dismutase, ou moléculas como a vitamina C, que reduzem os radicais livres. Qualquer desequilíbrio neste sistema de defesa pode resultar em um ciclo de feedback positivo potencialmente fatal, resultando em uma condição de espécies de oxigênio reativas excessivas conhecidas como estresse oxidativo.

Espécies reativas de oxigênio foram implicadas na iniciação e progressão do câncer. Outro efeito nocivo dessas moléculas é a indução do envelhecimento celular, também conhecida como senescência. A "Teoria Radical Livre do Envelhecimento" propõe que espécies reativas de oxigênio produzidas nas células durante o metabolismo normal evocam senescência celular e morte.

Até agora, discutimos os aspectos negativos dessas moléculas altamente reativas, mas elas também têm papéis positivos na fisiologia celular. Durante as respostas imunológicas quando os fagocitos engolfam patógenos, as células montam uma "explosão respiratória" durante a qual quantidades excessivas de espécies reativas de oxigênio são geradas para degradar oxidativamente patógenos. Além disso, são intermediários necessários e reguladores de uma variedade de vias de sinalização celular, e podem até mesmo sinalizar a morte de células que se tornaram cancerosas.

Para quantificar esses oxidantes celulares influentes, os cientistas exploram moléculas que, após a oxidação, tornam-se fluorescentes. Uma sonda comumente usada para detectar a espécie de oxigênio reativo é H₂DCFDA ou dihidro-fluorescete, um análogo não fluorescente de fluoresceína. Quando adicionada às células, sua natureza permeante celular permite que ela se difunda passivamente.

Em seguida, esterases intracelulares catalisam uma reação de hidrólise, o que resulta em fissura de grupos de acetato. Isso torna o composto mais polar, de modo que ele é retido dentro da célula. Após a oxidação, que envolve a remoção de átomos de hidrogênio por uma ampla gama de espécies de oxigênio reativa, o H2DCFDA não fluorescente é convertido para o altamente fluorescente dicloro-fluoresceína, ou DCF. Isso pode ser lido e quantificado por um leitor de placas, citômetro de fluxo ou microscopia de fluorescência.

Agora que você sabe como este ensaio funciona, vamos ver como ele é realizado em um ambiente de laboratório.

Comece transferindo células cultivadas em soro fisiológico tamponado de cultura para fosfato, seguido de centrifugação para lavá-las. Remova o supernasce e adicione a solução H₂DCFDA da sonda fluorescente. Incubar as células carregadas de corante no escuro para evitar fotobleaching. Após a incubação, lave as células para remover o corante descarregado e transfira as células para uma placa. Neste ponto, podem ser adicionados indutores experimentais de estresse oxidativo.

Quando prontas para análise, as células podem ser inseridas no leitor de placas. Os comprimentos de onda de excitação e emissão são definidos para fluoresceína. Após a leitura das placas, os valores podem ser analisados. Os resultados revelam a quantidade relativa de espécies reativas de oxigênio entre amostras em determinados pontos de tempo.

Agora que examinamos o protocolo real, vamos ver como ele está sendo aplicado em experimentos hoje.

Os pesquisadores frequentemente usam esse método para investigar a mecânica da fagocitose. Este grupo de cientistas queria estudar a capacidade do zebrafish de montar uma resposta imune em diferentes estágios de desenvolvimento. Como mencionado anteriormente, a fagocitose resulta na geração de espécies de oxigênio reativas elevadas, ou "uma explosão respiratória", que é usada para matar patógenos. Uma vez que a enzima NADPH oxidase é um importante produtor de ROS em células fagocíticas, esses cientistas induziram a resposta explosiva tratando zebrafish com um indutor DE NADPH. Os resultados demonstraram que entre os embriões de zebrafish cuja resposta "estourada" havia sido provocada, aqueles em 72 horas após a fertilização mostraram maior desenvolvimento de espécies reativas de oxigênio do que aqueles em 48 horas após a fertilização.

A disfunção mitocondrial devido ao aumento da espécie de oxigênio reativo é uma característica patológica de muitas doenças. Portanto, os pesquisadores podem identificar disfunção mitocondrial medindo o nível de estresse oxidativo. Aqui, os cientistas carregaram H2DCFDA em neurônios, e então montaram as amostras em um microscópio de fluorescência. Na adição de um estressor oxidativo, como o peróxido de hidrogênio, os corpos celulares apresentaram um aumento repentino na fluorescência, o que poderia ser uma indicação de disfunção mitocondrial.

Os astrócitos foram sugeridos para proteger os neurônios do sistema nervoso central do estresse oxidativo. Por causa dessa significância, esses pesquisadores buscaram desenvolver um ensaio para detectar estresse oxidativo em astrócitos na presença de um indutor externo. Eles fizeram isso incubando astrócitos com peróxido de hidrogênio e a sonda fluorescente para detecção reativa de espécies de oxigênio. A fluorescência subsequente gerada foi analisada utilizando-se um citômetro de fluxo. Os astrócitos ativados para o estresse oxidativo foram observados para cair dentro de uma região de maior intensidade de fluorescência, visto deslocado para a direita.

Você acabou de assistir ao vídeo do JoVE sobre a detecção de espécies reativas de oxigênio ou ROS. Resumindo, neste vídeo discutimos a ligação entre espécies reativas de oxigênio, metabolismo celular e doenças. Examinamos então o princípio e o procedimento de um ensaio para detecção reativa de espécies de oxigênio. Finalmente, exploramos como os pesquisadores estão aplicando esse método às suas investigações. A análise dos papéis ainda enigmáticos das espécies reativas de oxigênio é de grande interesse para os biólogos celulares, e a medição confiável com sondas fluorescentes está se mostrando inestimável. Como sempre, obrigado por assistir!