As amostras bioquímicas normalmente têm altas concentrações de buffer que podem interromper o processamento e análise a jusante. A diálise é uma técnica comum e barata usada para separar moléculas baseadas na difusão. O método utiliza uma membrana semi-permeável que permite o movimento de certos componentes, com base no tamanho. Este vídeo mostrará os conceitos de diálise, um procedimento geral e alguns de seus usos na bioquímica.

O aspecto mais importante da diálise é uma membrana semi-permeável, que tem poros que impõem um corte de peso molecular, permitindo que moléculas abaixo de um certo tamanho passem. Por exemplo, uma membrana de 10k geralmente retém moléculas maiores que 10 kilodaltons. No entanto, o corte de peso molecular não é um limite discreto ou preciso. A membrana normalmente contém uma ampla gama de tamanhos de poros, de modo que uma pequena fração de moléculas perto do limite pode ser perdida.

Uma vez que o corte de peso molecular é definido usando proteínas globulares, moléculas lineares de massa semelhante, como DNA ou RNA, podem escapar. As membranas são tipicamente escolhidas de meio a um terço do peso molecular da molécula desejada.

Para realizar o procedimento, uma amostra é colocada na membrana, que por sua vez é adicionada a um grande volume de solução, chamado dialise. Com o tempo, moléculas menores se difundirão livremente através da membrana entre a amostra e o dialise, enquanto as biomoléculas maiores são mantidas dentro. Diálise é um processo lento. É comum permitir que ele seja executado durante a noite, ou mesmo em vários dias.

Se o dialise é água pura, a concentração total de tampão diminuirá, um processo conhecido como dessaciação. Se a solução contiver outras partículas pequenas, algumas se moverão para a amostra, levando à troca de buffer. Como a diálise é um processo de equilíbrio, o diálise pode ser atualizado várias vezes para deslocar ainda mais pequenas moléculas. Uma vez concluído o processo, a amostra é recolhia para posterior processamento.

Agora que você já viu o básico da diálise, vamos dar uma olhada em um procedimento geral.

Antes de iniciar o procedimento, a membrana é pré-diálise. Isso facilita o uso e remove quaisquer conservantes. Uma vez pronta, a amostra é coletada, tipicamente com uma seringa e, em seguida, adicionada ao recipiente de diálise. Isso pode ser tubos nus, ou contidos dentro de uma fita. O excesso de ar é removido da configuração da diálise para maximizar a área de superfície da amostra com a membrana. A configuração é então colocada no dialise com agitação para maximizar a difusão. Deve flutuar para não inibir a agitação.

O dialise é alterado em intervalos relevantes à medida que o equilíbrio entre a amostra e o dialise é atingido. Após a última mudança, a reação é normalmente deixada para funcionar durante a noite. Após um período de tempo suficiente, a amostra sem buffer ou trocada é removida do. Uma vez coletada, a amostra pode ser analisada ou processada posteriormente, dependendo da natureza do experimento.

Agora que olhamos para um procedimento geral de diálise, vamos ver algumas das maneiras que esta técnica é usada na bioquímica.

Gradientes de densidade são uma maneira comum de separar amostras biológicas complexas. Este conceito se baseia na distribuição de pequenas partículas, tipicamente íons de sacarose ou cloreto de césio. Uma vez concluídos, esses reagentes normalmente precisam ser removidos antes que a amostra coletada possa ser processada. A diálise permite utilizar a amostra purificada para análise futura.

Certas proteínas são encontradas dentro da bicamada lipídica de uma célula, e geralmente são estudadas intercalando-as em vesículas lipídicas esféricas conhecidas como lipossomos. As proteínas e lipídios são extraídos pela primeira vez com um detergente. A diálise pode ser usada para remover lentamente o detergente, formando proteoliposomes.

Após a purificação, algumas proteínas são desdobradas, ou desnaturadas, levando a uma perda de funcionalidade. Os compostos que causam essas mudanças na estrutura podem ser removidos com diálise, levando à reforma dos analitos funcionais.

Você acabou de ver o vídeo do JoVE em diálise. Agora você deve entender este método baseado em difusão, um procedimento experimental simples e o uso desta técnica.

Obrigado por assistir!