Agradecemos a CAPES-Brasil, Brasil-CNPq, FAP/DF para apoio financeiro. Nós estamos gratos ao Dr. Hugo Costa Paes para a revisão do manuscrito.

1. soluções e meios de comunicação
<ol><li>Prepare 2 X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suporte, tampão fosfato salino (PBS), caldo de Sabouraud dextrose e ágar de Sabouraud dextrose conforme tabela 1.</li>
</ol>2. condições de crescimento do inóculo fúngicas
<ol><li>Armazene todas as estirpes fúngicas como estoques congelados em glicerol de 35% a-80 ° C, até que seja necessário.</li>
	<li>Execute as seguintes etapas antes de cada experimento.<ol>
<li>Por cepas de Candida albicans :<ol>
<li>Descongelar um frasco de estoque e transferir 200 µ l a 10 mL de caldo de Sabouraud dextrose em um tubo de polipropileno estéril 50 mL com tampa e cultura durante a noite a 30 ° C, com agitação (200 rpm). Lembre-se de inclinar o tubo e deixar a tampa um pouco aberta para melhor aeração da cultura.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Para cepas de Cryptococcus neoformans :<ol>
<li>Raspe a superfície congelada de um frasco de estoque. As células em placas de ágar Sabouraud dextrose da placa e incubar durante 48 h a 30 ° C. Depois visível crescimento de colônias isoladas, manter as placas no frigorífico (4 ° C) selado com película de parafina para até 15 dias.</li>
			<li>Recolher uma colônia isolada de médio porte da placa usando um palito estéril ou ansa inoculando estéril e inocular 10 mL de caldo de Sabouraud dextrose em um tubo cônico estéril 50 mL. Incube durante aproximadamente 24 horas a 30 ° C, sob agitação (200 rpm).</li>
			<li>Não exceda a incubação de 24 h. Lembre-se de inclinar o tubo e deixar a tampa um pouco aberta para melhor aeração. É sempre bom padronizar a fase de crescimento das células antes de cada ensaio, já que este é um fator importante que afecta a resistência antimicrobiana. Nota: Ambos os fungos foram cultivados a 30 ° C, de rápida propagação em nossos experimentos, mas a temperatura pode ser alterada para refletir os objetivos do estudo, o tratamento por exemplo clínico (37 ° C). Mais importante, este tempo de incubação inicial deve ser previamente estabelecido para cada isolado fúngico e mantido ao longo de todos os testes para garantir a reprodutibilidade.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após o crescimento de fungos, colete as células por centrifugação dos tubos cónicos a 1.200 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Desprezar o sobrenadante e adicionar 10 mL de PBS.</li>
	<li>Ressuspender as células e centrifugar novamente a 1.200 x g durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Repeti a lavagem PBS e centrifugação mais duas vezes. Após a terceira lavagem, Ressuspender as células em 5 mL (de acordo com o tamanho da pelota) de 2 X RPMI-1640 médio.</li>
	<li>Prepare-se 1 mL de uma diluição de 1: 100 ou 1:1,000 em um tubo de microcentrifugadora (dependendo da turvação de suspensão de células).</li>
	<li>Alíquota 10 µ l desta diluição, coloque-o em uma câmara de hemocytometer e conte o número total de células nos quadrantes quatro canto sob o microscópio. Calcular a concentração pela fórmula: (total de número de celular/4) x diluição fator x 104 (constante de diluição de câmara).<ol>
<li>Considere uma viabilidade de 100% se condições de viabilidade contagens e crescimento têm sido sistematicamente correlacionadas para o isolado a ser estudado. Nota: A padronização e controle de qualidade das contagens de viabilidade podem ser feitos por trás-chapeamento de acordo com o Comité Europeu de antifúngicos método de concentração inibitória mínima (CIM) teste de susceptibilidade aos antimicrobianos (EUCAST) para leveduras10 .</li>
		<li>Se a correlação de crescimento/viabilidade não foi estabelecida para o isolado sob estudo, medir a viabilidade de fungosa pela contagem de células vivas em um hemocytometer com o auxílio de corantes que cor seletivamente as células mortas, como Floxina B11, trypan azul 12, ou Janus verde13. Use as células fúngicas para este protocolo somente se a viabilidade da população neste momento é de 90% ou acima. Nota: Corantes mortos/vivos podem não funcionar bem com o fungo de escolha. Por favor, teste-os antes de usar. Por exemplo, o corante azul de Tripan não funciona bem com o c. neoformans.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Depois disso, preparar as suspensões celulares em 2 X RPMI-1640 médias (2 X ajustado inóculo em meio RPMI-1640). Para placas de 96 poços, considere um volume de 5 mL por cada placa.<ol>
<li>Para todas as cepas de c. albicans , prepare uma suspensão de célula estoque de 4 x 103 células/mL. Esta concentração é 2x da concentração celular final em cada poço (2 x 103 células/mL).</li>
		<li>Para cepas de c. neoformans , prepare uma estoque cultura de células de 2 x 104 células/mL. Esta concentração é duas vezes a concentração celular final em cada poço (1 x 104 células/mL).</li>
		<li>Para outros fungos, teste com um antifúngico conhecido qual concentração será ideal para o estudo particular em relação ao tempo de incubação. Tempo de duplicação e metabolismo do fungo em consideração.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. peptídeos (agente desconhecido)
<ol><li>Armazenar os peptídeos liofilizados a-20 ° C e dissolvê-los em água desionizada antes de cada experimento. O tempo máximo de armazenamento, uma vez dissolvido em água vai depender da natureza de cada peptídeo.</li>
	<li>Prepare alíquotas de duas vezes a maior concentração final testados no ensaio (2 X). Idealmente, prepare um pequeno número de alíquotas com suficiente peptídeo para uma utilização evitar ciclos de congelamento e descongelamento. Nota: A escolha da concentração deve ser baseada na literatura e as propriedades do peptide. Recomenda-se iniciar as diluições de série com cerca de 100 µM do peptide e, em seguida, diminuir ou aumentar este intervalo de concentração dependendo dos resultados obtidos.</li>
</ol>4. referência antifúngicos (controles positivos)
<ol><li>Para aqueles diluído em água: preparar uma solução X 2 de maior concentração da análise (ver secção 5: ensaio antifúngicos para as etapas de diluição).<ol>
<li>Por cepas de c. albicans , prepare uma solução de 128 µ g/mL de fluconazol ou 128 µ g/mL de caspofungina. A concentração de placa para ambos será 64 µ g/mL.</li>
		<li>Por cepas de c. neoformans , prepare uma solução de 32 µ g/mL de anfotericina B (solução hidrossolúvel). A concentração de placa será 16 µ g/mL. Nota: Normalmente anfotericina B é diluído em dimetilsulfóxido (DMSO), desde que este antifúngicos é pouco solúvel em água. No entanto, existem preparações hidrossolúveis anfotericina B disponível comercialmente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para antifúngicos diluídos em um solvente orgânico: preparar uma 100 X solução estoque em DMSO e, em seguida, diluir a 10 X na água para uso. Nota: Assim, no poço, a concentração final de DMSO não exceda 1%. Um poço onde o fungo irá crescer em meios contendo 1% DMSO como controle é necessário, dado que alguns fungos não toleram bem esta concentração do solvente. Lembre-se que o DMSO é fotossensível, então cubra o prato com papel alumínio ou coloque-o em uma câmara escura para a duração do período de incubação.</li>
</ol>5. antifúngico ensaio
Nota: Os ensaios In vitro antifungais são executados com base no teste de susceptibilidade de caldo como de orientações Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 com algumas modificações.
<ol><li>Preparar uma diluição serial dupla de cada peptídeo e antifúngico em microplacas de poliestireno de 96 poços para um volume final de 50 µ l de controle.<ol>
<li>Usando uma pipeta Adicione 100 µ l do peptide/antifúngico na concentração X 2 da mais alta desejada concentração final nas colunas 1-3, em linha A.</li>
		<li>Usando uma pipeta multicanal, adicionar 50 µ l de água estéril em outros poços, nas linhas B-H.</li>
		<li>Remover 50 µ l de poços com a maior concentração (linha A), transferir para o próximo bem da próxima concentração (linha B) e homogeneizar.</li>
		<li>Repita os passos acima até o poço com a menor concentração e descartar 50 µ l desta bem (linha H). Deixe colunas 11 e 12 (linhas A, B, C) com água apenas para controle em branco ou controle negativo/crescimento.</li>
		<li>Adicionar 50 µ l do 2 X inóculo ajustado em meio RPMI-1640 a cada poço (colunas 1-3 plus coluna 11 (controle negativo/crescimento)); a concentração final para c. albicans será 2 x 103 células/mL e a concentração final para cepas de c. neoformans será 104 células/mL.</li>
		<li>Prepare-se controles em branco (50 µ l água + 50 µ l 2 X RPMI-1640 meio sem células) e controle negativo/crescimento (50 µ l água + 50 µ l ajustado inóculo 2 X RPMI-1640 médio sem antifúngico) e carga na placa bem como descrito acima.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Repita o procedimento para cada composto a ser testado e o controle de antifúngico escolhido (colunas 4-10). Nota: As diluições de série podem ser feitas verticalmente como o experimento abaixo, ou horizontalmente na placa (ou seja, se o número de diluições de determinado composto/extracto que precisam ser testados é de oito ou mais).<ol>
<li>Se os compostos, referência drogas, ou qualquer dos seus componentes são fotossensíveis, realizar o ensaio em luz reduzida, cobrir as placas com papel alumínio ou coloque em uma câmara escura, durante a incubação do.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Considere as seguintes recomendações opcionais.<ol>
<li>Selo da placa com uma placa de tampa transparente que permite a troca gasosa, como este ajuda a reduzir a evaporação.</li>
		<li>Coloque a placa em uma câmara úmida; Isso também ajudará a reduzir a evaporação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incube as placas a 37 ° C por 24 h ou 48h para todas as cepas de c. albicans e por 48 h com 200 rpm agitação por c. neoformans. O volume final inferior (100 µ l) garante que não há repercussões ocorre. Nota: Nenhuma diferença significativa foi observada entre as leituras de MIC em 24 h e 48 h para cepas de c. albicans . No entanto, leituras em 48 h são mais fáceis de Visualizar.</li>
	<li>Observe todos os poços, com o auxílio de um microscópio óptico invertido, antes do período de incubação e depois verificar as alterações na morfologia, bem como para verificar se há sinais de contaminação. Nota: As leituras podem ser feitas visualmente e fotografadas no final do experimento. Antes de cada leitura, homogeneizar ligeiramente a placa. As leituras também podem ser realizadas medindo seu OD em 600 nm, se agrupa de célula ou filamentação não são observados.</li>
	<li>Realizar os experimentos que pelo menos três vezes em datas distintas.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Armstrong-James, D., Meintjes, G., Brown, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neglected+epidemic:+fungal+infections+in+HIV/AIDS.">A neglected epidemic: fungal infections in HIV/AIDS.</a> Trends Microbiol. 22 (3), 120-127 (2014).</li><li>Romani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+to+fungal+infections.">Immunity to fungal infections.</a> Nat Rev Immunol. 11 (4), 275-288 (2011).</li><li>Pfaller, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+drug+resistance:+mechanisms,+epidemiology,+and+consequences+for+treatment.">Antifungal drug resistance: mechanisms, epidemiology, and consequences for treatment.</a> Am J Med. 125 (1 Suppl), S3-S13 (2012).</li><li>Hancock, R. E., Diamond, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cationic+antimicrobial+peptides+in+innate+host+defences.">The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences.</a> Trends Microbiol. 8 (9), 402-410 (2000).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snake+cathelicidin+from+Bungarus+fasciatus+is+a+potent+peptide+antibiotics.">Snake cathelicidin from Bungarus fasciatus is a potent peptide antibiotics.</a> PLoS One. 3 (9), e3217 (2008).</li><li>Du, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AaeAP1+and+AaeAP2:+novel+antimicrobial+peptides+from+the+venom+of+the+scorpion,+Androctonus+aeneas:+structural+characterisation,+molecular+cloning+of+biosynthetic+precursor-encoding+cDNAs+and+engineering+of+analogues+with+enhanced+antimicrobial+and+anticancer+activities.">AaeAP1 and AaeAP2: novel antimicrobial peptides from the venom of the scorpion, Androctonus aeneas: structural characterisation, molecular cloning of biosynthetic precursor-encoding cDNAs and engineering of analogues with enhanced antimicrobial and anticancer activities.</a> Toxins (Basel). 7 (2), 219-237 (2015).</li><li>Benincasa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungicidal+activity+of+five+cathelicidin+peptides+against+clinically+isolated+yeasts.">Fungicidal activity of five cathelicidin peptides against clinically isolated yeasts.</a> J Antimicrob Chemother. 58 (5), 950-959 (2006).</li><li>CLSI. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibiliy Testing of Yeasts; Approved Standard -Third Edition. CLSI document M27-A3. , (2008).</li><li>Guilhelmelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+Scorpion+Venom-Derived+Antifungal+Peptides+against+Planktonic+Cells+of+Candida+spp.+and+Cryptococcus+neoformans+and+Candida+albicans+Biofilms.">Activity of Scorpion Venom-Derived Antifungal Peptides against Planktonic Cells of Candida spp. and Cryptococcus neoformans and Candida albicans Biofilms.</a> Front Microbiol. 7, 1844 (2016).</li><li>Roongruangsree, U. T., Kjerulf-Jensen, C., Olson, L. W., Lange, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+Tests+for+Thick+Walled+Fungal+Spores+(ex:+Oospores+of+Peronospora+manshurica).">Viability Tests for Thick Walled Fungal Spores (ex: Oospores of Peronospora manshurica).</a> Journal of Phytopathology. 123 (3), 244-252 (1988).</li><li>Boedijn, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+as+stain+for+fungi.">Trypan blue as stain for fungi.</a> Stain Technol. 31 (3), 115-116 (1956).</li><li>Goihman-Yahr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+plating+efficiency+and+estimation+of+viability+of+suspensions+of+Paracoccidioides+brasiliensis+yeast+cells.">Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells.</a> Mycopathologia. 71 (2), 73-83 (1980).</li><li>Tati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histatin+5-spermidine+conjugates+have+enhanced+fungicidal+activity+and+efficacy+as+a+topical+therapeutic+for+oral+candidiasis.">Histatin 5-spermidine conjugates have enhanced fungicidal activity and efficacy as a topical therapeutic for oral candidiasis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 58 (2), 756-766 (2014).</li><li>Petrou, M. A., Shanson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+of+Cryptococcus+neoformans+by+the+NCCLS+microdilution+and+Etest+methods+using+five+defined+media.">Susceptibility of Cryptococcus neoformans by the NCCLS microdilution and Etest methods using five defined media.</a> J Antimicrob Chemother. 46 (5), 815-818 (2000).</li><li>Zaragoza, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+analysis+of+variables+for+standardization+of+antifungal+susceptibility+testing+of+nonfermentative+yeasts.">Process analysis of variables for standardization of antifungal susceptibility testing of nonfermentative yeasts.</a> Antimicrob Agents Chemother. 55 (4), 1563-1570 (2011).</li><li>Rodriguez-Tudela, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+shaking+on+antifungal+susceptibility+testing+of+Cryptococcus+neoformans:+a+comparison+of+the+NCCLS+standard+M27A+medium,+buffered+yeast+nitrogen+base,+and+RPMI-2%+glucose.">Influence of shaking on antifungal susceptibility testing of Cryptococcus neoformans: a comparison of the NCCLS standard M27A medium, buffered yeast nitrogen base, and RPMI-2% glucose.</a> Antimicrob Agents Chemother. 44 (2), 400-404 (2000).</li><li>Beggs, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+phase+in+relation+to+ketoconazole+and+miconazole+susceptibilities+of+Candida+albicans.">Growth phase in relation to ketoconazole and miconazole susceptibilities of Candida albicans.</a> Antimicrob Agents Chemother. 25 (3), 316-318 (1984).</li><li>Alcouloumre, M. S., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Selsted, M. E., Edwards, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungicidal+properties+of+defensin+NP-1+and+activity+against+Cryptococcus+neoformans+in+vitro.">Fungicidal properties of defensin NP-1 and activity against Cryptococcus neoformans in vitro.</a> Antimicrob Agents Chemother. 37 (12), 2628-2632 (1993).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Como testes podem analisar a potencial atividade antifúngica de um alvo composto usando pequenas quantidades do composto e ao mesmo tempo testá-lo em uma gama de concentrações. Nesse sentido, o presente protocolo é recomendado como um primeiro passo na triagem para potenciais novos compostos antifúngicos. O protocolo aqui apresentado é baseado no protocolo M27-A3, inicialmente projetado para auxiliar na seleção da terapia antifúngica em clínicas e pode ser adaptado a uma variedade de novos compostos antifúngi...

Infecções fúngicas tornaram-se uma preocupação médica importante nas últimas décadas, tendo aumentado consideravelmente principalmente devido a um aumento do número de indivíduos imunocomprometidos, tais como aqueles submetidos a tratamento de câncer e aqueles que vivem com HIV/AIDS ou transplante de órgãos,1,2. No entanto, um conjunto muito limitado de drogas antifúngicas disponíveis e o número crescente de relatórios sobre resistência fúngica-lhes contribuam para os grandes problemas em relação a terapêutica de micoses sistêmicas3.
Uma potencial fonte de novos compostos antifúngicos são peptídeos antimicrobianos (AMPs), pequenos peptídeos catiônicos produzidos por muitos organismos como parte de sua resposta imune inata para infecção4. No entanto, o método de triagem para testar estes compostos contra patógenos fúngicos não é padronizado. Diferentes procedimentos têm sido utilizados para avaliar a atividade antifúngica de AMPs, às vezes para o mesmo modelo microorganismo5,6,7. Essas diferenças e a falta de detalhes em alguns protocolos complicam comparações entre compostos e dificulta a reprodutibilidade.
Uma forma de padronizar os testes de novos candidatos a fármacos é seguir diretrizes usadas para definir a susceptibilidade em ambientes clínicos, tais como o clínico e orientações Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3. No entanto, estes testes de sensibilidade antifúngica são demasiado restritivas e não leva em variação de consideração no metabolismo em toda a espécie, como eles foram criados apenas para alguns agentes selecionados. Por exemplo, eles não levam em conta as necessidades metabólicas de leveduras não-fermentação.
Este protocolo permite a avaliação da atividade dos compostos antifúngicos em potencial e é implementado aqui para a procura de peptídeos antifúngicos. Ele se baseia o teste de sensibilidade como caldo de orientações CLSI M27-A3 com modificações que otimizam a exibição de novos compostos8,9. Estas alterações permitem o uso de pequenas quantidades de composto, variações de temperatura ou inóculo inicial e de diferentes meios de comunicação para o crescimento ideal do pré-teste, enquanto padronizar os resultados com o uso de antifúngicos de referência como controles. Esse método, com o uso de placas de cultura multi bem, torna possível para um grande número de compostos de tela de forma rápida e confiável.
Devido à sua flexibilidade inerente, este protocolo pode ser usado com diferentes classes químicas de compostos e contra outros microorganismos, com algumas adaptações.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Media and Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium with l-glutamine, without sodium bicarbonate</td><td>Thermo Fisher</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>3-(&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-morpholino) propane sulfonic acid&lt;em&gt; (MOPS) (o que a gente usa tem um s&amp;oacute;dio, completa o nome dele please)&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Use to buffer 2X RPMI medium</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Din&amp;acirc;mica</td><td>1528-1</td><td>137 mM for Phosphate buffered saline (PBS)</td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>J.T.Baker</td><td>3040-01</td><td>2.7 mM for Phosphate buffered saline (PBS)</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V000129</td><td>10 mM for Phosphate buffered saline (PBS)</td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60230</td><td>2 mM for Phosphate buffered saline (PBS)</td></tr><tr><td>BD Difco Sabouraud dextrose broth</td><td>BD</td><td>238230</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco Sabouraud Dextrose Agar</td><td>BD</td><td>210950</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V000123</td><td>35% for (solu&amp;ccedil;&amp;atilde;o de estoque? Criopreserva&amp;ccedil;&amp;atilde;o?)</td></tr><tr><td>Sterile water</td><td></td><td></td><td>Para dilui&amp;ccedil;&amp;atilde;o das drogas na dilui&amp;ccedil;&amp;atilde;o seriada</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antifungal drugs&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Fluconazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8929</td><td></td></tr><tr><td>Caspofungin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1160</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Plastics&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Dish petri</td><td>J.Prolab</td><td>0304-5</td><td></td></tr><tr><td>96 well plate</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Solution Reservoir</td><td>KASVI</td><td>K30-208</td><td>Use to pippet the solutions using the multichannel pippet</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment and other materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optical microscope</td><td>Nikon</td><td>E200MV</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugue</td><td>Thermo Fisher</td><td>MegaFuge 16R</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Ethik Technology</td><td>403-3D</td><td>Set to 37&amp;deg; C</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Excella E25</td><td>Set to 37&amp;deg; C, 200 RPM</td></tr><tr><td>Cell counting chamber, Neubauer</td><td>BOECO Germany</td><td>BOE 13</td><td></td></tr><tr><td>Multichannel pipette</td><td>HTL</td><td>5123</td><td></td></tr></tbody></table>

broth microdilution in vitro screening: an easy and fast method to detect new antifungal compounds

Infecções fúngicas tornaram-se uma importante condição médica nas últimas décadas, mas o número de drogas antifúngicas disponíveis é limitado. Nesse cenário, a busca de novos medicamentos antifúngicos é necessária. O relatado aqui detalha um método péptidos de tela para suas propriedades antifúngicas. Ele se baseia o teste de sensibilidade como caldo de orientações Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 com modificações de acordo com a pesquisa de peptídeos antimicrobianos como potenciais novos antifúngicos. Este protocolo descreve um ensaio funcional para avaliar a atividade dos compostos antifúngicos e pode ser facilmente modificado para se adequar a qualquer classe particular de moléculas sob investigação. Desde que os ensaios são realizados em placas de 96 poços, usando volumes pequenos, uma triagem em larga escala pode ser concluída em um curto espaço de tempo, especialmente se realizado em um ambiente de automação. Este procedimento ilustra como um protocolo clínico padronizado e ajustável pode ajudar a busca de trabalho-banco de novas moléculas para melhorar a terapia de doenças fúngicas.

O MIC é definido como a menor concentração de compostos antimicrobianos que inibe completamente o crescimento fúngico visível no final do período de incubação. Desde que o objectivo do presente protocolo é ter um método rápido de antifúngicos potencial de tela, qualquer bem com clara mídia similar aos poços em branco é considerado um resultado positivo, Considerando que qualquer bem com turbidez análoga dos poços de controle negativo/crescimento considerados negativos. No...

Watch this Scientific Journal Video about Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds at JoVE.com

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

Um fácil e adaptável como caldo para a seleção de extratos e compostos antifúngicos.

Como caldo em Vitro rastreio: um método fácil e rápido para detectar novos compostos antifúngicos

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this ...

broth-microdilution-vitro-screening-an-easy-fast-method-to-detect-new

Research

JoVE Journal

Biology

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

18.7K visualizações.  University of Brasília. Um fácil e adaptável como caldo para a seleção de extratos e compostos antifúngicos.

Vídeo: Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third most common infection in US hospitals. Different manifestations of candidiasis are associated with biofilm formation, both on host tissues and/or medical devices (i.e. catheters). Biofilm formation carries negative clinical implications, as cells within the biofilms are protected from host immune responses and from the action of antifungals. We have developed a simple, fast and robust in vitro model for the formation of C. albicans biofilms using 96 well microtiter-plates, which can also be used for biofilm antifungal susceptibility testing. The readout of this assay is colorimetric, based on the reduction of XTT (a tetrazolium salt) by metabolically active fungal biofilm cells. A typical experiment takes approximately 24 h for biofilm formation, with an additional 24 h for antifungal susceptibility testing. Because of its simplicity and the use of commonly available laboratory materials and equipment, this technique democratizes biofilm research and represents an important step towards the standardization of antifungal susceptibility testing of fungal biofilms.

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

We describe a simple, rapid and robust method for the formation of Candida albicans biofilms using 96 well microtiter plates and its utility in antifungal susceptibility testing of cells within biofilms.

A 96 Bem microtitulação Método da Placa com base para a Formação Monitoramento e Teste de susceptibilidade antifúngica de Candida albicans Biofilmes

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

Imunologia e Infecção

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection in US hospitals1. These opportunistic infections pose a growing threat for an increasing number of compromised individuals, and carry unacceptably high mortality rates. This is in part due to the limited arsenal of antifungal drugs, but also to the emergence of resistance against the most commonly used antifungal agents. Further complicating treatment is the fact that a majority of manifestations of candidiasis are associated with the formation of biofilms, and cells within these biofilms show increased levels of resistance to most clinically-used antifungal agents2. Here we describe the development of a high-density microarray that consists of C. albicans nano-biofilms, which we have named CaBChip3. Briefly, a robotic microarrayer is used to print yeast cells of C. albicans onto a solid substrate. During printing, the yeast cells are enclosed in a three dimensional matrix using a volume as low as 50 nL and immobilized on a glass substrate with a suitable coating. After initial printing, the slides are incubated at 37 &deg;C for 24 hours to allow for biofilm development. During this period the spots grow into fully developed "nano-biofilms" that display typical structural and phenotypic characteristics associated with mature C. albicans biofilms (i.e. morphological complexity, three dimensional architecture and drug resistance)4. Overall, the CaBChip is composed of ~750 equivalent and spatially distinct biofilms; with the additional advantage that multiple chips can be printed and processed simultaneously. Cell viability is estimated by measuring the fluorescent intensity of FUN1 metabolic stain using a microarray scanner. This fungal chip is ideally suited for use in true high-throughput screening for antifungal drug discovery. Compared to current standards (i.e. the 96-well microtiter plate model of biofilm formation5), the main advantages of the fungal biofilm chip are automation, miniaturization, savings in amount and cost of reagents and analyses time, as well as the elimination of labor intensive steps. We believe that such chip will significantly speed up the antifungal drug discovery process.

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

We have developed a high-density microarray platform consisting of 3D nano-biofilms of C. albicans called CaBChip. The susceptibility profile of drugs tested on a CaBChip is comparable to the conventional 96-well plate model, suggesting that the fungal chip is ideally suited for true high-throughput screening of antifungal drugs.

Candida albicans biofilme Chip (Ca BChip) para seleção de alto rendimento antifúngico

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Bioengenharia

Measuring Volatile and Non-volatile Antifungal Activity of Biocontrol Products

The protocol described is based on a plug-transfer technique that allows accurate determination of microorganism quantities and their developmental stages. A specified number of spores are spread on an agar plate. This agar plate is incubated for a defined period to allow the fungi to reach the expected developmental stage, except for spores where incubation is not required. Agar plugs covered by spores, hyphae, or mycelium are next withdrawn and transferred onto agar media containing the antifungal compound to be tested either placed at a distance from the fungi or in contact. This method is applicable to test both liquid extracts and solid samples (powders). It is particularly well suited for quantifying the relative contributions of volatile and non-volatile agents in bioactive mixtures and for determining their effects, specifically on spores, early hyphae, and mycelium.
The method is highly relevant for the characterization of the antifungal activity of biocontrol products, notably plant-derived products. Indeed, for plant treatment, the results can be used to guide the choice of mode of application and to establish the trigger thresholds.

We describe a modified agar-based method designed to quantify the antifungal effects of plant-derived products. Both volatile and non-volatile contributions to the antifungal activity can be assessed through this protocol. In addition, efficacy against fungi can be measured at key developmental stages in a single experimental setup.

Medindo atividade antifúngica volátil e não volátil de produtos de biocontrole

The protocol described is based on a plug-transfer technique that allows accurate determination of microorganism quantities and their developmental ...

Ambiente

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, which are expressed as minimum inhibitory concentrations (MICs) are used in research for antimicrobial development and monitoring of resistance development and in the clinical setting for antimicrobial therapy guidance. Dalbavancin is a semi-synthetic lipoglycopeptide antimicrobial agent that was approved in May 2014 by the Food and Drug Administration (FDA) for the treatment of acute bacterial skin and skin structure infections caused by Gram-positive organisms. The advantage of dalbavancin over current anti-staphylococcal therapies is its long half-life, which allows for once-weekly dosing. Dalbavancin has activity against Staphylococcus aureus (including both methicillin-susceptible S. aureus [MSSA] and methicillin-resistant S. aureus [MRSA]), coagulase-negative staphylococci, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus anginosus group, &#946;-hemolytic streptococci and vancomycin susceptible enterococci. Similar to other recent lipoglycopeptide agents, optimization of CLSI and ISO broth susceptibility test methods includes the use of dimethyl sulfoxide (DMSO) as a solvent when preparing stock solutions and polysorbate 80 (P80) to alleviate adherence of the agent to plastic. Prior to the clinical studies and during the initial development of dalbavancin, susceptibility studies were not performed with the use of P-80 and MIC results tended to be 2-4 fold higher and similarly higher MIC results were obtained with the agar dilution susceptibility method. Dalbavancin was first included in CLSI broth microdilution methodology tables in 2005 and amended in 2006 to clarify use of DMSO and P-80. The broth microdilution (BMD) procedure shown here is specific to dalbavancin and is in accordance with the CLSI and ISO methods, with step-by-step detail and focus on the critical steps added for clarity.

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.

Um método de microdiluição em caldo de referência para Dalbavancin<em&gt; In Vitro</em&gt; Teste à Susceptibilidade de bactérias que crescem aeròbia

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

High Throughput, em tempo real, Teste Dual-leitura dos intracelular Actividade Antimicrobiana e citotoxicidade celular eucariótica

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

Sistema de Eficácia e citotoxicidade Rastreio de inibidores Segmentação intracelular<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

<meta charset="utf8"></head><body>Ensaio de triagem de alto rendimento para Mycobacterium abscessus usando repórteres duplos

Assay Development for High-Throughput Drug Screening Against Mycobacteria

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. Treatments are extremely ineffective and based on a multi-drug regimen, resulting in low patient compliance. Consequently, the scientific community is urged to identify new and effective drugs to treat these infections. One of the strategies employed to this end is drug repurposing - the process of identifying new therapeutic opportunities for existing drugs in the market, circumventing the time required to establish pharmacokinetic and safety profiles of new drugs. With most studies on drug development against Mab relying on traditional and time-consuming methods, an assay for high-throughput drug screening was developed against mycobacteria using an in house developed double-reporter strain of Mab. Using liquid-handling robotics, automated microscopy, and analysis, alongside in house developed double reporter strains, bacterial viability can be rapidly measured using two different readouts, luminescence and fluorescence, without adding reagents or performing any extra steps. This reduces time and variability between assays, a major advantage for high-throughput screenings. The described protocol was validated by screening a library of 1280 compounds. The obtained results were corroborated by the literature, with efficient detection of active compounds. Thus, this work fulfilled the aim of supplying the field with a new tool to help fight this extremely drug-resistant bacteria.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Protocolo de triagem de drogas escalável para descoberta eficiente de tratamentos com M. abscessus

This study developed an assay for high-throughput screening against Mycobacterium abscessus with a&#160;recently created double reporter strain, using fluorescence and luminescence to assess bacterial viability quickly. This protocol will be relevant for researchers aiming to screen new drugs against this drug-resistant bacteria.

Desenvolvimento de ensaio para triagem de medicamentos de alto rendimento contra micobactérias

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. ...

Quantifying the Antifungal Activity of Peptides Against Candida albicans

Traditional methods for performing antifungal susceptibility testing for Candida albicans are time-consuming and lack quantitative results. For example, a common approach relies on plating cells treated with different concentrations of antifungal molecules on agar plates and then counting the colonies to determine the relationship between molecule concentration and growth inhibition. This method requires many plates and substantial time to count the colonies. Another common approach eliminates the plates and counting of colonies by visually inspecting cultures treated with antifungal agents to identify the minimum concentration required to inhibit growth; however, visual inspection produces only qualitative results, and information on growth at subinhibitory concentrations is lost. This protocol describes a method for measuring the susceptibility of C. albicans to antifungal peptides. By relying on optical density measurements of cultures, the method reduces the time and materials needed to obtain quantitative results on culture growth at different peptide concentrations. The incubation of the fungus with peptides is performed in a 96-well plate using an appropriate buffer, with controls representing no growth inhibition and complete growth inhibition. Following the incubation with the peptide, the resulting cell suspensions are diluted to reduce peptide activity and then grown overnight. After overnight growth, the optical density of each well is measured and compared to the positive and negative controls to calculate the resulting growth inhibition at each peptide concentration. The results using this assay are comparable to the results using the traditional method of plating the cultures on agar plates, but this protocol reduces plastic waste and the time spent on counting colonies. Although the applications of this protocol have focused on antifungal peptides, the method will also be applicable to testing other molecules with known or suspected antifungal activity.

Quantifying the Antifungal Activity of Peptides Against Candida albicans

This protocol describes a method for obtaining quantitative data on the antifungal activity of peptides and other compounds, such as small-molecule antifungal agents, against Candida albicans. Its use of optical density rather than counting colony-forming units to quantify growth inhibition saves time and resources.

Quantificando a atividade antifúngica de peptídeos contra Candida albicans

Traditional methods for performing antifungal susceptibility testing for Candida albicans are time-consuming and lack quantitative results. For example, a ...

Como caldo em Vitro rastreio: um método fácil e rápido para detectar novos compostos antifúngicos

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

A 96 Bem microtitulação Método da Placa com base para a Formação Monitoramento e Teste de susceptibilidade antifúngica de Candida albicans Biofilmes

Candida albicans biofilme Chip (Ca BChip) para seleção de alto rendimento antifúngico

Medindo atividade antifúngica volátil e não volátil de produtos de biocontrole

Um método de microdiluição em caldo de referência para Dalbavancin

High Throughput, em tempo real, Teste Dual-leitura dos intracelular Actividade Antimicrobiana e citotoxicidade celular eucariótica

Sistema de Eficácia e citotoxicidade Rastreio de inibidores Segmentação intracelular

Desenvolvimento de ensaio para triagem de medicamentos de alto rendimento contra micobactérias

Desenvolvimento de ensaio para triagem de medicamentos de alto rendimento contra micobactérias

Desenvolvimento de ensaio para triagem de medicamentos de alto rendimento contra micobactérias

Quantificando a atividade antifúngica de peptídeos contra Candida albicans