Agradecemos a Ron Davis, Adam Deutschbauer, eo laboratório HOP toda HIP da Universidade de Toronto para discussões e aconselhamento. CN é suportado por concessões do National Human Genome Research Institute (Grant Número HG000205), RO1 HG003317, CIHR MOP-84305, e Canadian Cancer Society (# 020380). JO foi apoiado pelo Programa de Formação de Stanford Genome (Grant Número T32 HG00044 do National Human Genome Research Institute) e os Institutos Nacionais de Saúde (Grant Número GH000205 P01). GG é suportado pelo RO1 NHGRI HG003317 e da Sociedade Canadense do Câncer, Grant # 020380, TD e do Centro de Seqüenciamento Donnelly é suportado, em parte por doações da Fundação Canadense para Inovação, para as Dras. Brenda e Jack Andrews Greenblatt. AMS é apoiado por uma Universidade de Toronto Fellowship Open.

<ol>
	<li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome.">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418, 387-391 (2002).</li><li>Baba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+the+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Molecular systems biology. 2, 2006.0008-2006.0008 (2006).</li><li>Claus, H., Frosch, M., Vogel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+hotspot+for+transformation+of+Neisseria+meningitidis+by+shuttle+mutagenesis+using+signature-tagged+transposons.">Identification of a hotspot for transformation of Neisseria meningitidis by shuttle mutagenesis using signature-tagged transposons.</a> Mol Gen Genet. 259, 363-371 (1998).</li><li>Hava, D. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+identification+of+serotype+4+Streptococcus+pneumoniae+virulence+factors.">Large-scale identification of serotype 4 Streptococcus pneumoniae virulence factors.</a> Molecular microbiology. 45, 1389-1406 (2002).</li><li>Costanzo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genetic+Landscape+of+a+Cell.">The Genetic Landscape of a Cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li><li>Tong, A. 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J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+387.">Chapter 387.</a> Yeast Gene Analysis. , 387-414 (2007).</li><li>Pierce, S. E., Davis, R. W., Nislow, C., Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+barcoded+Saccharomyces+cerevisiae+gene-deletion+mutants+in+pooled+cultures.">Genome-wide analysis of barcoded Saccharomyces cerevisiae gene-deletion mutants in pooled cultures.</a> Nature protocols. 2, 2958-2974 (2007).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning : a laboratory manual. , (2001).</li><li>Smith, A. 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J., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Error-correcting+barcoded+primers+for+pyrosequencing+hundreds+of+samples+in+multiplex.">Error-correcting barcoded primers for pyrosequencing hundreds of samples in multiplex.</a> Nature. 5, 235-237 (2008).</li><li>Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-Level+Analysis+of+Genes+and+Functions+Affecting+Survival+During+Nutrient+Starvation+in+Saccharomyces+cerevisiae.">System-Level Analysis of Genes and Functions Affecting Survival During Nutrient Starvation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 187, 299-317 (2011).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Aqui, esboçamos um protocolo que, com a alteração modesta, pode ser facilmente adaptado a uma ampla gama de colecções existentes de código de barras coleções mutantes de microorganismos diferentes para criar coleções tag mutantes. Ressaltamos que, embora tenhamos relatado um protocolo sobre a mutagênese transposon marcadas para a levedura patogênica C. albicans, um protocolo muito semelhante poderia ser adaptado a uma grande variedade de fungos unicelulares. Modificada, este protocolo funciona bem em bactérias 13 e, atualmente, coleções para um número adicional de genomas de fungos e bactérias estão em construção. Atualmente, este ensaio fornece a única abrangente, a tela do genoma imparcial para interações gene-pequena molécula. Um aspecto particularmente atraente do ensaio é que nenhum conhecimento prévio do gene ou molécula pequena é necessária. Apesar do alcance e do poder destes ensaios, a sua transferência para outros laboratórios tem sido dificultada pelo pouco investimento de capital inicial e as ferramentas de informática para a análise dos resultados. Com a adoção de uma leitura próxima geração seqüência combinada com ferramentas robustas para análise, esperamos a sua aprovação a aumentar.

<table border="1"><tbody><tr><td> Antibióticos </td><td> Número de fornecedores e catálogo </td></tr><tr><td> Carbenicilina </td><td> Sigma, parte # C1613 </td></tr><tr><td> Canamicina </td><td> Sigma, parte # K1876 </td></tr><tr><td> espectinomicina </td><td> Sigma, parte # S0692 </td></tr><tr><td> Cloranfenicol </td><td> Sigma, parte # C0378 </td></tr><tr><td> DNA Clean-up e kits de concentração </td><td></td></tr><tr><td> QIAprep rotação Miniprep Kit </td><td> Qiagen, parte # 27106 </td></tr><tr><td> Kit Maxi HiSpeed ​​Plasmid </td><td> Qiagen, parte # 12663 </td></tr><tr><td> QIAquick Kit de Purificação PCR </td><td> Qiagen, parte # 28106 </td></tr><tr><td> QIAquick Gel Extraction Kit </td><td> Qiagen, parte # 28704 </td></tr><tr><td> PCR e reagentes eletroforese </td><td></td></tr><tr><td> Taq DNA polimerase (Mg-free) do buffer </td><td> New England Biolabs, parte # M0320L </td></tr><tr><td> Mix Solução desoxinucleotídeo </td><td> New England Biolabs, parte # N0447L </td></tr><tr><td> 25 mM MgCl 2 </td><td> Sigma, parte # 63036 </td></tr><tr><td> Agarose, corante e ácido nucléico mancha adequado para eletroforese em gel </td><td> Vários </td></tr><tr><td> Tampão TAE 10X </td><td> Sigma, parte # T8280 </td></tr><tr><td> 1 Kb DNA Ladder Mais </td><td> Invitrogen, parte # 10787026 </td></tr><tr><td> YPD caldo </td><td></td></tr><tr><td> 10 g de extrato de levedura </td><td> Sigma, parte # Y1625 </td></tr><tr><td> 20 g de peptona Bacto </td><td> BD Biosciences, parte # 211677 </td></tr><tr><td> 20 g de dextrose </td><td> Sigma, parte # D9434 </td></tr><tr><td> Material de laboratório </td><td></td></tr><tr><td> Pipetas multicanal (1000, 200 e 20 mL) </td><td> Vários </td></tr><tr><td> Descartáveis ​​reservatórios pipetagem </td><td> Vários </td></tr><tr><td> 15 e 50 mL tubos de centrífuga </td><td> Vários </td></tr><tr><td> 96 - e 384-poço profundo Placas Bem </td><td> Axygen Scientific, parte # P-2ML-SQ-CS &amp; P-384240SQCS </td></tr><tr><td> De 96 poços e 384 placas de bem-PCR e filme de vedação </td><td> Vários </td></tr><tr><td> Rolo de chapa para a selagem de poços múltiplos placas </td><td> Sigma, parte # R1275 </td></tr><tr><td> 30 ° C e 37 ° C agitando incubadoras para o crescimento de bactérias e leveduras em placas e em tubos </td><td> Vários </td></tr><tr><td> In vitro transposon mutagênese </td><td></td></tr><tr><td> EZ-Tn5 transposase </td><td> Biotecnologias Epicentro, parte # TNP92110 </td></tr><tr><td> Alto rendimento de transformação </td><td></td></tr><tr><td> Seqprep 96 HT Kit Prep Plasmid </td><td> Borda Biosystems, parte # 84359 </td></tr><tr><td> polietileno glicol, peso molecular 3350 </td><td> Vários </td></tr><tr><td> acetato de lítio </td><td> Sigma, parte # 517992 </td></tr><tr><td> 6-bem pratos, estéril </td><td> Corning, parte # 3335 </td></tr><tr><td> 50 mg / mL uridina </td><td> Sigma, parte # U3750 </td></tr><tr><td> 100X solução tampão Tris-EDTA </td><td> Sigma, parte # T9285 </td></tr><tr><td> 1X TE/0.1M LiOAc </td><td> Vários </td></tr><tr><td> salmão testículo DNA </td><td> Sigma, parte # 1626 </td></tr><tr><td> Crescimento das coleções de código de barras </td><td></td></tr><tr><td> 48 placas bem, se crescer culturas em placas </td><td> Greiner, parte # M9437 </td></tr><tr><td> Colantes placa </td><td> ABgene, parte # AB-0580 </td></tr><tr><td> 200 frascos de cultura mL </td><td> Vários </td></tr><tr><td> Espectrofotômetro capaz de absorbância </td><td> Vários </td></tr><tr><td> Temperatura controlada shaker para balões de 250 ml ou espectrofotômetro agitação </td><td> Vários </td></tr><tr><td> Seguro-Lock tubo de microcentrífuga, 2 mL </td><td> Eppendorf, parte # 0030 120.094 </td></tr><tr><td> Equipamentos de hibridização </td><td></td></tr><tr><td> Forno de hibridização 640 </td><td> Affymetrix, parte # 800138 </td></tr><tr><td> GeneChip Fluidic Station 450 </td><td> Affymetrix, parte # 00-0079 </td></tr><tr><td> GeneArray Scanner 3000 </td><td> Affymetrix, parte # 00-0212 </td></tr><tr><td> Banho de água fervente com suporte flutuante </td><td> Vários </td></tr><tr><td> Consumíveis de hibridização </td><td></td></tr><tr><td> Genflex Tag Matriz 16K v2 </td><td> AffymEtrix, parte # 511331 </td></tr><tr><td> Solução Denhardt, a concentrar-50X </td><td> Sigma, parte # D2532 </td></tr><tr><td> Estreptavidina, R-ficoeritrina conjugada (SAPE) </td><td> Invitrogen, parte # S866 </td></tr><tr><td> Seguro-Lock tubo de microcentrífuga de 0,5 mL </td><td> Eppendorf, parte # 0030 123.301 </td></tr><tr><td> Teeny Tough-Spots </td><td> Diversified Biotech, parte # LTTM-1000 </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA </td><td> BioRad, parte # 161-0729 </td></tr><tr><td> 10% Tween </td><td> Sigma, parte # T2700 </td></tr><tr><td> MES monohidrato do ácido livre </td><td> Sigma, parte # M5287 </td></tr><tr><td> MES sal de sódio </td><td> Sigma, parte # M5057 </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> Sigma, parte # 71386 </td></tr><tr><td> 20X SSPE </td><td> Sigma, parte # S2015 </td></tr><tr><td> Água de grau de biologia molecular </td><td> Sigma, parte # W4502 </td></tr><tr><td> Primers hibridação </td><td> Diversos fornecedores (dessalinização standard) </td></tr><tr><td> Uptag </td><td> &quot;GATGTCCACGAGGTCTCT 3 &#39;5 </td></tr><tr><td> Buptagkanmx4 </td><td> 5 &#39;biotina-GTCGACCTGCAGCGTACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Dntag </td><td> 5 &#39;CGGTGTCGGTCTCGTAG 3&#39; </td></tr><tr><td> Bdntagkanmx4 </td><td> 5 &#39;biotina-GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3&#39; </td></tr><tr><td> B213 </td><td> 5 &#39;biotina-CTGAACGGTAGCATCTTGAC 3&#39; </td></tr><tr><td> Uptagkanmx </td><td> 5 &#39;GTCGACCTGCAGCGTACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Dntagkanmx </td><td> 5&#39;GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3 &#39; </td></tr><tr><td> Uptagcomp </td><td> 5&#39;AGAGACCTCGTGGACATC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Dntagcomp </td><td> 5&#39;CTACGAGACCGACACCG 3 &#39; </td></tr><tr><td> Upkancomp </td><td> 5&#39;CGTACGCTGCAGGTCGAC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Dnkancomp </td><td> 5&#39;CGATGAATTCGAGCTCGTTTTC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Seqüenciamento Primers: Plataforma Illumina </td><td> Diversos fornecedores </td></tr><tr><td> UpTag Forward (100um) </td><td> 5 &#39;CAA GGC GAC GAA GCA ATA CGA GCT CTT ATC CCG T GAT GTC GTC GAG CAC TCT 3&#39; </td></tr><tr><td> UpTag Reverse (100um) </td><td> 5 &#39;GAT AAT ACG GCG ACC ACC GAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT ATC CCG T NNNNN GTC GAC CTG CAG CGT ACG 3&#39; </td></tr><tr><td> DownTag Forward (100um) </td><td> 5 &#39;CAA GGC GAC GAA GCA ATA CGA GCT CTT ATC CCG T GAA GAG AAC CTC TTC GAA ATC G 3&#39; </td></tr><tr><td> DownTag Reverse (100um) </td><td> 5 &#39;GAT AAT ACG GCG ACC ACC GAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT ATC CCG T NNNNN CGG TGT CGG TCT CGT AG 3 ` </td></tr><tr><td> Leia um UP-tag cartilha seq (100um) </td><td> 5 &#39;GAC GTC CTG CAG CGT ACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Leia um BAIXO tag-primário seq (100um) </td><td> 5 &#39;CGG TGT CGG TCT CGT AG 3&#39; </td></tr><tr><td> Ler 2 cartilha Seqüenciamento Index (padrão primário Illumina R1) (100um) </td><td> 5 &#39;ACT AC CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT ATC CCG T 3&#39; </td></tr><tr><td> Reagentes adicionais Seqüenciamento / Equipamentos </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen MinElute 96 UF Kit de purificação de PCR </td><td> Qiagen, parte # 29051 </td></tr><tr><td> Bomba de vácuo </td><td> Qualquer fornecedor </td></tr><tr><td> Macherey-Nagel Manifold Vacuum </td><td> Macherey-Nagel, parte # 740 681 </td></tr><tr><td> Invitrogen Quant-iT dsDNA BR Assay Kit </td><td> Invitrogen, parte # Q32853 </td></tr><tr><td> Ensaio Invitrogen tubos Qubit </td><td> Invitrogen, parte # Q32856 </td></tr><tr><td> 40 acrilamida% mais 1% N, N&#39;-metileno-bis-acrilamida, 37.5:1 </td><td> Bio Rad, parte # 161-0148 </td></tr><tr><td> Tris Base de Dados </td><td> Sigma, parte # T1503-1KG </td></tr><tr><td> Ácido bórico </td><td> Sigma, parte # B6768-500G </td></tr><tr><td> EDTA 0,5 M, pH 8,0 </td><td> Teknova, parte # E0306 </td></tr><tr><td> Persulfato de amônio </td><td> Sigma, parte # A3678-25G </td></tr><tr><td> Temed </td><td> Bioshop, parte # TEM001.25 </td></tr><tr><td> Solução de brometo de etídio </td><td> Bioshop, parte # ETB444.10 </td></tr><tr><td> Acetato de amônio 0,5 M </td><td> Teknova, parte # A2000 </td></tr><tr><td> Tetra acetato de magnésio 10mM </td><td> Sigma, parte # M0631-100G </td></tr><tr><td> 1mM EDTA, pH 8,0 </td><td> Ver EDTA 0.5M, pH 8.0 </td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Vários </td></tr><tr><td> Acetato de sódio, pH 5,2 </td><td> Teknova, parte # S0297 </td></tr><tr><td> Vácuo velocidade </td><td> Vários </td></tr><tr><td> Leia Kit Single-Generation Cluster </td><td> Illumina, parte # GD-300-1001 </td></tr><tr><td> 36c Seqüenciamento Kit v4 </td><td>Illumina, parte # FC-104-4002 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table> Receita TBE 10X <table border="1"><tbody><tr><td> Quantidades </td><td> Reagentes </td></tr><tr><td> 108 gramas </td><td> Tris Base de Dados </td></tr><tr><td> 55 gramas </td><td> Ácido bórico </td></tr><tr><td> 40mL </td><td> EDTA 0,5 M (pH 8,0) </td></tr><tr><td colspan="2"> Adicionar dH 2 O para 1L marca </td></tr></tbody></table> 12% da receita em gel de poliacrilamida <table border="1"><tbody><tr><td> Volumes </td><td> Reagentes </td></tr><tr><td> 5,8 ml </td><td> 40 acrilamida% mais 1% N, N&#39;-metileno-bis-acrilamida, 37.5:1 </td></tr><tr><td> 12 ml </td><td> dH 2 O </td></tr><tr><td> 2 ml </td><td> TBE 10X </td></tr><tr><td> 140 mL </td><td> Persulfato de amônio 10% </td></tr><tr><td> Volume total: 20ml </td><td></td></tr></tbody></table> Uptag mistura de iniciadores: Ressuspender Uptag e Buptagkanmx4 cada um em DDH 2 O a 100 mM, em seguida, misture em uma proporção de 1:1 para uma concentração final de 50 mM cada um. Armazenar a -20 ° C. Downtag mistura de iniciadores: Ressuspender Dntag e Bdntagkanmx4 cada um em DDH 2 O a 100 mM, em seguida, misture em uma proporção de 1:1 para uma concentração final de 50 mM cada um. Armazenar a -20 ° C. Oligonucleotides misto: Ressuspender cada um dos seguintes oito oligos (standard já dessalgado) em DDH 2 O a 100 mM: Uptag, Dntag, Uptagkanmx, Dntagkanmx, Uptagcomp, Dntagcomp, Upkancomp, Dnkancomp. Misturar um volume igual de oito oligonucleotídeos para uma concentração final de 12,5 mM cada um. 12X de ações MES: Para 10 ml, dissolver 0,7 g MES monohidrato do ácido livre e 1,93 g de sal de sódio MES em 8 ml de água de grau de biologia molecular. Depois de misturar bem, verificar o pH e se necessário ajustar a um pH 6,5-6,7. Adicionar água a um volume total de 10 ml. Filtro de esterilizar e armazenar a 4 ° C protegido da luz (por exemplo, envolva o tubo em papel alumínio). Substituir se a solução torna-se visivelmente amarelo ou após 6 meses. 2X tampão de hibridação: Para 50 ml, misturar 8,3 ml de 12X MES estoque (de 2.9.14), 17,7 ml de 5 M NaCl, 4,0 ml de 0,5 M EDTA, 0,1 ml de 10% Tween 20 (vol / vol), e 19,9 ml filtrados DDH 2 O. Filtro de esterilizar. Lavar A: Misturar 300 ml 20X SSPE, 1 mL de Tween 10% (vol / vol), 699 ml DDH 2 O. Filtro de esterilizar. Lavar B: Misture 150 ml 20X SSPE, 1 mL de Tween 10% (vol / vol), 849 ml DDH 2 O. Filtro de esterilizar. Seqüenciamento primers de código de barras Em seqüências UP tag-primário a 5 &#39;da cauda (negrito) são seqüências de Illumina adaptador específico incorporado o primer F e R. A seqüência variável (itálico) representa a marca de indexação 5-mer usado em multiplexação / index de leitura. A cauda do 3 &#39;(sublinhado) representa o primer comum de acompanhamento do código de barras uptag e é necessário para ampliar os códigos de barras de levedura. Em Down tag-primário seqüências 5 &#39;cauda é idêntica à 5&#39; cauda de UP-tag primers (seqüência específica Illumina), no entanto, a 3 &#39;cauda (sublinhado) é substituído pelo primers comuns que são usados ​​para amplificar o DOWN- tag barcodes.

competitive genomic screens of barcoded yeast libraries

Em virtude dos avanços em tecnologias de próxima geração de sequenciamento, temos acesso a novas seqüências do genoma quase que diariamente. O ritmo destes avanços está se acelerando, prometendo uma maior profundidade e amplitude. À luz desses avanços extraordinários, a necessidade de rápido, métodos paralelos para definir a função do gene torna-se cada vez mais importante. Coleções de mutantes do genoma exclusão em leveduras e E. coli têm servido como burros de carga para a caracterização funcional da função dos genes, mas esta abordagem não é escalável, atual gene-apagamento abordagens exigem cada um dos milhares de genes que compõem o genoma a ser excluído e verificada. Somente após esse trabalho é completo pode buscamos high-throughput fenotipagem. Durante a última década, nosso laboratório tem refinado uma carteira de competitivo, miniaturizado, do genoma de alto rendimento ensaios que podem ser executadas em paralelo. Esta paralelização é possível por causa da inclusão de &#39;tags&#39; DNA, ou &quot;código de barras,&quot; em cada mutante, com o código de barras que serve como um proxy para a mutação e pode-se medir a abundância de código de barras para avaliar aptidão mutante. Neste estudo, procuramos preencher a lacuna entre seqüência de DNA e código de barras coleções mutante. Para conseguir isso, apresentamos uma abordagem combinada transposon interrupção código de barras, que abre os ensaios de código de barras paralelas para recém seqüenciados, mas mal caracterizada micróbios. Para ilustrar esta abordagem, apresentamos uma nova Candida albicans coleção rompimento com código de barras e descrever a forma como o microarray-based e próxima geração de plataformas baseadas em seqüenciamento pode ser usado para coletar 10.000 - 1.000.000 gene-gene e gene-drogas interações em um único experimento.

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Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

Nós desenvolvemos abrangente, imparcial genome-wide telas para entender gene de drogas e interações gene-ambiente. Métodos para a triagem dessas coleções mutantes são apresentados.

Competitiva Screens Genomic de Bibliotecas Yeast Barcoded

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

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18.1K visualizações.  University of Toronto. Nós desenvolvemos abrangente, imparcial genome-wide telas para entender gene de drogas e interações gene-ambiente. Métodos para a triagem dessas coleções mutantes são apresentados.