Z.C. reconhece o apoio do fundo de inicialização de Dartmouth e o Branco Weiss - sociedade para bolsa de estudos de ciência, administrada pela ETH Zurique. Os autores agradecer Qiaohang Guo, DRS Larry A. Taber, Benjamen A. Filas e Yunfei Shi para debates úteis, bem como os revisores anônimos para comentários. Este material é baseado em trabalho suportado pela nacional Science Foundation pós-graduação bolsa de pesquisa sob Grant no. DGE-1313911. Qualquer opinião, conclusões e conclusões ou recomendações expressadas neste material são as dos autores (s) e não refletem necessariamente as opiniões da National Science Foundation.

1. preparação de meios de cultura de tecido
<ol><li>Use uma garrafa de 0,5 L de meio modificado águia de Dulbecco (DMEM) com 4,5 g/L glicose, bicarbonato de sódio e L-glutamina como base para os meios de cultura.</li>
	<li>Em uma capa de estéril de fluxo laminar, adicione 10 mL de antibióticos para a 0,5 L de DMEM.</li>
	<li>Usando uma pipeta esterilizada, transferi 50 mL da solução de antibióticos de DMEM para um tubo cônico estéril 50 mL.</li>
	<li>Adicione 50 mL de soro de garota para a solução de antibióticos DMEM restante na garrafa 0,5 L de capuz estéril.</li>
	<li>Armazenar a solução final (referida daqui por diante como garota de meios de cultura [CCM]) em alíquotas de 50 mL tubo cônico a-20 ° C.</li>
</ol>2. ovo incubação
<ol><li>Uso delicado toalhetes com álcool 70% para limpar específicos isentos de organismos patogénicos Leghorn branca frango ovos fertilizados. Organize os ovos em uma orientação longitudinal nos suportes.</li>
	<li>Transformar em uma incubadora do ovo para definir uma temperatura-alvo de 37,5 ° C e manter a umidade em 48-55%. A umidade é controlada pela adição de uma quantidade adequada de água para a incubadora.</li>
	<li>Incube os ovos de HH11-13, cerca de 40-44 h.</li>
	<li>Deixe que os ovos esfriarem em temperatura ambiente por cerca de 15-30 min antes da pulverização e limpeza com etanol a 70%.</li>
</ol>3. Puxe a capilares de vidro
<ol><li>Monte um 10 tubos capilares de vidro cm de comprimento com um diâmetro exterior de 1,0 mm e um diâmetro interno de 0,5 mm em um extrator da micropipeta.</li>
	<li>Definir o calor e puxe parâmetros para 750 e 400, respectivamente. Pressione o botão de tração para puxar o tubo capilar em finas agulhas.</li>
</ol>4. filtro de papel método de transportadora
<ol><li>Corte círculos de aproximadamente 3 cm de diâmetro de papel de filtro.</li>
	<li>Corte um retângulo aproximadamente 1 cm por 2 cm do círculo usando um furador. Certifique-se de remover quaisquer salientes ou cantos em ponto.</li>
</ol>5. o embrião da colheita e preparação
<ol><li>Quebrar ovos do fundo, separe o shell suavemente e cuidadosamente depositar o conteúdo em uma placa de Petri 150 x 15 mm. Para garantir que o lado do embrião é acima, mantenha os ovos na mesma orientação que eles foram incubados enquanto estalar os.</li>
	<li>Remova a albumina fina utilizando uma pipeta de Pasteur descartável.</li>
	<li>Separe a gema usando fórceps terminou sem corte a albumina espessa. Certifique-se de que a albumina espessa foi removida raspando levemente a parte superior da gema com a pinça terminou sem corte.</li>
	<li>Use pinça de ponta fina para centralizar e coloque um anel de papel de filtro sobre o embrião, combinando o longo eixo do anel com o longo eixo do embrião.</li>
	<li>Corte a gema ao redor do anel de filtro de papel com uma tesoura.</li>
	<li>Puxe o anel e o embrião fora a gema em uma direção oblíqua em direcção ao local onde a gema primeiro foi cortada.</li>
	<li>Lave os embriões em dois pratos de 100mm sequenciais com temperatura 1 x salina tamponada fosfato (PBS).</li>
	<li>Coloque um anel de papel de filtro em um prato de petri 35mm primeiro. Então coloque o lado dorsal do embrião para o papel de filtro já em 35mm placa de Petri.</li>
	<li>Coloque um anel de aço inoxidável em cima do sanduíche de papel de filtro. Tenha atenção para não danificar o embrião.</li>
	<li>Adicione 3 mL de CCM previamente preparado para cada placa de Petri.</li>
	<li>Remova a VM de cada embrião por desnatação levemente a agulha capilar puxada através da parte superior do embrião e descascando a VM afastado, a partir do final do anterior (mesmo por cima do posencéfalo) e prosseguir para a notocorda (figura 1A).</li>
	<li>Coloque oito pratos de Petri 35mm em um prato de 150 mm que foi forrado com toalhitas de tarefa delicada saturada de água (para manter a umidade).</li>
	<li>Lugar de Petri 150 mm em um saco plástico vedável Então enche o saco com uma mistura de gases composta de 95% O2 e 5% de CO2.</li>
	<li>Feche o saco e coloque-o em uma incubadora de 37,5 ° C.</li>
	<li>Incube os embriões para um adicional 27 h até HH15-HH16 (figura 1B).</li>
</ol>6. indução de tensão superficial
<ol><li>Remover os embriões da incubadora e usar um sistema de tomografia computadorizada (OCT) de coerência óptica para a imagem deles. Usar a OCT para determinar o ângulo de torção do tubo neural (NT) (Figura 2).</li>
	<li>Transferir os embriões para um microscópio de luz e visualizar a ampliação de 10x. Use uma pipeta de 200 microlitro incrementalmente 0,2 mL de mídia retirar o prato de petri.</li>
	<li>Com imagens de brightfield em cada intervalo para observar os efeitos da interface mídia-ar sobre o embrião.</li>
	<li>Remova a mídia até que a tensão de superfície do outro lado do embrião induz a torsão (Figura 1).</li>
	<li>Imagem do embrião, usando o sistema OCT mais uma vez para estabelecer um ângulo de torção final para comparação controlar os embriões.  Nota: As imagens de Bright-campo foram adquiridas usando um microscópio de dissecação. Um sistema de tomografia de coerência óptica com um microscópio anexado foi usado para adquirir pilhas imagem transversal dos embriões ao vivo. Imagens foram obtidas em um domínio de digitalização3 3 x 10 x 3 mm e, em seguida, processadas em um software de imagem. Por último, as modelo físico de imagens foram tiradas com uma single-lens reflex câmera digital.</li>
</ol>7. física modelagem das forças de tensão superficial/VM
<ol><li>Desenvolva uma geometria 3D simplificada que se assemelha a um embrião entre 17-HH14 em software de modelagem comercial (Figura 3A).</li>
	<li>Desenha o molde negativo da geometria 3D em softwares gráficos de computador 3D comercial.</li>
	<li>Uso uma impressora 3D carregada com 1,75 mm acrilonitrila butadieno estireno do filamento para 3D imprimir o molde desenhado, no formato stereolithographic. (STL).</li>
	<li>Para converter o molde, misturar componentes de elastômero de borracha de silicone A e B em partes iguais e despeje a mistura no molde prontamente; conjunto do molde de fundição para curar à temperatura ambiente por 12 h (Figura 3B).</li>
	<li>Marca o modelo físico do embrião ao longo do NT no lado dorsal Visualizar torsão.</li>
	<li>Use uma lamela para replicar a força aplicada para o modelo físico 3D que imita do VM ou tensão superficial (Figura 3D).</li>
	<li>Inserir uma série de fios rígidos de comprimento igual ao lado do modelo físico. Depois que a lamela exerce uma força externa sobre o modelo do cérebro, os fios tornam-se inclinado em um ângulo que depende da localização. Determine o ângulo de rotação por arctan do comprimento projetado sobre o comprimento original de cada fio (Figura 3E).</li>
</ol>8. alterando a direção do Loop coração
<ol><li>Siga as etapas em 3.1 e 3.2 para obter um tubo capilar puxado.</li>
	<li>Siga as etapas no 5.1 através de 5.10 para preparar o embrião.</li>
	<li>Use um par de pinças para virar o papel de filtro para que o embrião se torna ventral-lado para cima.</li>
	<li>Use o tubo capilar puxado para abrir uma fenda na membrana splanchnopleure (SPL).</li>
	<li>Use o tubo capilar para exercer uma força mecânica para empurrar o coração do lado direito para o lado esquerdo.</li>
	<li>Siga as etapas em 5.12 através de 5.15 para observar a mudança na torção.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanics+of+Growth,+Remodeling,+and+Morphogenesis.">Biomechanics of Growth, Remodeling, and Morphogenesis.</a> Appl. Mech. Rev. 48, 487-545 (1995).</li><li>Wyczalkowski, M. A., Chen, Z., Filas, B. A., Varner, V. D., Taber, L. 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Os autores declaram não há conflitos de interesse.

Enquanto fenômenos físicos desempenham um papel integral na morfogênese26,,27,28,29,30, os mecanismos específicos de mecânicos, juntamente com a coordenação de mecânica e mecanismos moleculares, continuam em grande parte inexplorados. É conhecido que a flexão ventral e torção para a direita do cérebro primitivo são dois processos centrais que con...

Biologia do desenvolvimento moderno investigação centra-se em grande parte sobre o desenvolvimento da compreensão do ponto de vista da genética molecular,1,2,3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. é conhecido que fenômenos físicos desempenham um papel central na morfogênese, ou a geração de biológicas forma14,15,16,17; no entanto, os mecanismos mecânicos específicos de desenvolvimento permanecem em grande parte espontâneo. Flexão ventral e torção para a direita do tubo cérebro primitivo após Hamburger-Hamilton palco 11 (11 HH)18 são os dois principais processos que contribuem para a forma embrionária de mudança19,20. Em particular, o mecanismo físico subjacente ao desenvolvimento torcional no cérebro embrionário permanece insuficientemente compreendido.
A torsão embrionária no embrião do pintinho está entre os primeiros eventos morfogenéticas de assimetria de esquerda-direita (L-R) em desenvolvimento. Quando o processo de assimetria L-R é perturbado, defeitos de nascimento como situs inversus, isomerismoou heterotaxia ocorrerá21. Aqui nós apresentamos um protocolo que combina ex-ovo experimentos22,23 com modelagem física para caracterizar as forças mecânicas durante o início do desenvolvimento embrionário do cérebro. O objetivo do método apresentado é identificar as responsável pelo cérebro torção e os fatores que afetam o grau de torção durante o início do desenvolvimento12de forças mecânicas. Baseado na observação experimental de que a membrana vitelínico (VM) restringe o lado dorsal do embrião, formulamos a hipótese que a VM fornece a força necessária para induzir a torsão do cérebro em desenvolvimento. Portanto, neste método, retiramos a parte da VM que cobre a área do cérebro para descobrir os efeitos na torção do cérebro. Além disso, o método de aplicar a tensão de superfície líquido foi usado para confirmar o papel mecânico da VM e fornecer uma estimativa da força necessária para a torção do cérebro, que não tinha sido feita anteriormente. As forças de medição durante a morfogénese embrionária é uma tarefa desafiadora. Notavelmente, em um estudo pioneiro, Campàs e colegas de trabalho24 desenvolveu um novo método para quantificar as tensões celulares usando microdroplets injetado. No entanto, esse método foi limitado a medir forças a nível celular, portanto, não aplicável para sondar as forças ao nível de tecido ou organismo. O protocolo apresentado neste trabalho foi desenvolvido para preencher parcialmente essa lacuna.

<table><tbody><tr><td>Fertilized Specific pathogen-free White Leghorn chicken eggs</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optical Coherent Tomography Microscope</td><td>Thorlabs</td><td>GAN220C1</td><td></td></tr><tr><td>Silicone elastomer</td><td>Smooth-On, Inc.</td><td>EcoFlex 00-50</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>MZ8</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium (DMEM)</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td>Sigma</td><td>P4083</td><td></td></tr><tr><td>Chick serum</td><td>Sigma</td><td>C5405</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>Model P-30</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper</td><td>Whatman</td><td>5202-110</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Comsol MultiPhysics</td><td>Comsol</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3D computer graphics software</td><td>Rhino 5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope attached with OCT</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>FN1</td><td></td></tr><tr><td>Digital single-lens reflex camera</td><td>EOS&amp;nbsp;</td><td>Rebel T3i</td><td></td></tr></tbody></table>

probing the roles of physical forces in early chick embryonic morphogenesis

Desenvolvimento embrionário é tradicionalmente estudado do ponto de vista da genética biomolecular, mas a importância fundamental da mecânica na morfogênese está se tornando cada vez mais reconhecida. Em particular, o tubo de coração e cérebro de garota embrionárias, que passam por drásticas mudanças morfológicas como elas se desenvolvem, estão entre os principais candidatos para estudar o papel das forças físicas na morfogênese. Progressiva de flexão ventral e torção para a direita do cérebro tubular embrionário garota acontecem no estágio mais adiantado de assimetria de esquerda-direita-nível de órgão no desenvolvimento embrionário de garota. A membrana vitelínico (VM) restringe o lado dorsal do embrião e tem sido implicada em fornecer a força necessária para induzir a torsão do cérebro em desenvolvimento. Aqui apresentamos uma combinação de novas experiências de ex-ovo e física de modelagem para identificar a mecânica da torsão do cérebro. Fase de Hamburger-Hamilton 11, os embriões são colhidos e culta ex ovo (nos meios de comunicação). O VM é subsequentemente removido usando um tubo capilar puxado. Controlando o nível do fluido e submetendo o embrião para uma interface líquido-ar, a tensão de superfície líquida dos meios de comunicação pode ser usada para substituir o papel mecânico da VM. Também realizaram-se experimentos de microcirurgia para alterar a posição do coração para encontrar a mudança resultante na quiralidade de torção do cérebro. Os resultados do presente protocolo ilustram as funções fundamentais da mecânica na condução morfogênese.

Neste estudo, a VM do embrião em HH11 foi removida da extremidade anterior para a flexão torácica. Os embriões foram fotografados por um sistema de OCT. Nesta fase, a torção do tubo do cérebro não foi iniciado (figura 1A). Após ser incubadas a HH15-16, embriões com sua VM removido exibiram cerebral reduzido tubo torsão, cerca de 35 graus (figura 1B) comparado comparadas o controle de embriões, que exibem a torsão de ...

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Probing the Roles of Physical Forces in Early Chick Embryonic Morphogenesis

Os papéis de forças físicas no início Chick embrionárias morfogênese de sondagem

Aqui, apresentamos um protocolo introduzindo um conjunto de novas experiências de ex-ovo e abordagens de modelagem física para estudar a mecânica da morfogênese durante a torção de cérebro embrionário precoce garota.

Embryonic development is traditionally studied from the perspective of biomolecular genetics, but the fundamental importance of mechanics in morphogenesis ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.2K visualizações.  Dartmouth College. Aqui, apresentamos um protocolo introduzindo um conjunto de novas experiências de ex-ovo e abordagens de modelagem física para estudar a mecânica da morfogênese durante a torção de cérebro embrionário precoce garota.

Vídeo: Probing the Roles of Physical Forces in Early Chick Embryonic Morphogenesis

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression and activation of signal transduction pathways. This technique allows the delivery of signaling molecules at precisely defined developmental stages for specific times. After this embryos can be harvested and gene expression examined, for example by in situ hybridization, or activation of signal transduction pathways observed with immunostaining.
In this video heparin beads soaked in FGF18 or AG 1-X2 beads soaked in U0126, a MEK inhibitor, are grafted into the limb bud in ovo. This shows that FGF18 induces expression of MyoD and ERK phosphorylation and both endogenous and FGF18 induced MyoD expression is inhibited by U0126. Beads soaked in a retinoic acid antagonist can potentiate premature MyoD induction by FGF18.
This approach can be used with a wide range of different growth factors and inhibitors and is easily adapted to other tissues in the developing embryo.

By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.

Alongamento das Beads em Desenvolvimento de frango Limbs embrião para Identificar caminhos da transdução de sinal que afeta Gene Expression

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

Biologia do Desenvolvimento

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness following surgical intervention are key experimental strengths. Mica plates were the first barriers used to prevent chick limb bud initiation1. Protocols that use aluminum foil as an impermeable barrier to wing bud or leg bud induction and or initiation are described. We combine this technique with bead placement lateral to the barrier to exogenously supply candidate endogenous factors that have been blocked by the barrier. The results are analyzed using in situ hybridization of subsequent gene expression. Our main focus is on the role of retinoic acid signaling in the induction and later initiation of the chick embryo fore and hindlimb. We use BMS 493 (an inverse agonist of retinoic acid receptors (RAR)) soaked beads implanted in the lateral plate mesoderm (LPM) to mimic the effect of a barrier placed between the somites (a source of retinoic acid (RA)) and the LPM from which limb buds grow. Modified versions of these protocols could also be used to address other questions on the origin and timing of inductive cues. Provided the region of the chick embryo is accessible at the relevant developmental stage, a barrier could be placed between the two tissues and consequent changes in development studied. Examples may be found in the developing brain, axis extension and in organ development, such as liver or kidney induction.

Protocols using impermeable barriers to block induction events between tissues of the main body axis and flank in the chick embryo required for limb formation are described. Beads soaked in candidate inductive signals are used to overcome the effect of barrier placement and analysis of gene expression confirms this.

Aplicação de barreiras impermeáveis ​​combinadas com Candidate Fator Beads Soaked para estudar sinais indutores do pintainho

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Monte Whole dupla hibridização in situ de embriões de galinha precoce

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biologia

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

Ensaio para Indução Neural no embrião de galinha

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ideal for experimentation. Currently, the study of these developmental pathways in the chicken embryo is conducted by applying inhibitors and drugs at localized sites and at low concentrations using a variety of methods. In vitro tissue&#160;culturing is a technique that enables the study of tissues separated from the host organism, while simultaneously bypassing many of the physical limitations present when working with whole embryos, such as the susceptibility of embryos to high doses of potentially lethal chemicals. Here, we present an organotypic culturing protocol for culturing the embryonic chicken half head in vitro, which presents new opportunities for the examination of developmental processes beyond the currently established methods.

Here, we present an organotypic culturing protocol to grow embryonic chicken organs in vitro. Using this method, the development of embryonic chicken tissue can be studied, while maintaining a high degree of control over the culture environment.

Cultura de organotypic método para estudar o desenvolvimento de tecidos embrionários de galinha

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Chicken Recombinant Limbs Assay to Understand Morphogenesis, Patterning, and Early Steps in Cell Differentiation

Cell differentiation is the fine-tuned process of cell commitment leading to the formation of different specialized cell types during the establishment of developing tissues and organs. This process is actively maintained in adulthood. Cell differentiation is an ongoing process during the development and homeostasis of organs. Understanding the early steps of cell differentiation is essential to know other complex processes such as morphogenesis. Thus, recombinant chicken limbs are an experimental model that allows the study of cell differentiation and pattern generation under embryonic patterning signals. This experimental model imitates an in vivo environment; it assembles reaggregated cells into an ectodermal cover obtained from an early limb bud. Later, ectoderms are transferred and implanted in a chick embryo receptor to allow its development. This assay was mainly used to evaluate mesodermal limb bud cells; however, it can be applied to other stem or progenitor cells from other organisms.

Recombinant limbs are a powerful experimental model that allows for studying the process of cell differentiation and the generation of patterns under the influence of embryonic signals. This protocol presents a detailed method for generating recombinant limbs with chicken limb-mesodermal cells, adaptable to other cell types obtained from different organisms.

Ensaio de membros recombinantes de frango para entender morfogênese, padronização e primeiros passos na diferenciação celular

Cell differentiation is the fine-tuned process of cell commitment leading to the formation of different specialized cell types during the establishment of ...

Analysis of Cell Differentiation, Morphogenesis, and Patterning During Chicken Embryogenesis Using the Soaked-Bead Assay

A multitude of genetic programs is activated during embryonic development that orchestrates cell differentiation to generate an astounding diversity of somatic cells, tissues, and organs. The precise activation of these genetic programs is regulated by morphogens, diffusible molecules that direct cell fate at different thresholds. Understanding how genetic activation coordinates morphogenesis requires the study of local interactions triggered by morphogens during development. The use of beads soaked in proteins or drugs implanted into distinct regions of the embryo enables studying the role of specific molecules in the establishment of digits and other developmental processes. This experimental technique provides information on the control of cell induction, cell fate, and pattern formation. Thus, this soaked bead assay is an extremely powerful and valuable experimental tool applicable to other embryonic models.

The soaked bead assay involves targeted delivery of test reagent at any developmental time point to study the regulation of cell differentiation and morphogenesis. A detailed protocol, applicable to any experimental animal model, for preparing three different types of soaked beads and implanting these in the interdigit of a chicken embryo is presented.

Análise da diferenciação celular, morfogênese e padronização durante a embriogênese de frango usando o ensaio de contas encharcadas

A multitude of genetic programs is activated during embryonic development that orchestrates cell differentiation to generate an astounding diversity of ...

Uma revisão abrangente dos protocolos de cultura de explante de pele embrionária aviária

Using Avian Skin Explants to Study Tissue Patterning and Organogenesis

The developing avian skin during embryogenesis is a unique model that can provide valuable insights into tissue patterning. Here three variations on skin explant cultures to examine different aspects of skin development are described. First, ex vivo organ cultures and manipulations offer researchers opportunities to observe and study the development of feather buds directly. Skin explant culture can grow for 7 days enabling direct analysis of cellular behavior and 4D imaging at intervals during this growth period. This also allows for physical and molecular manipulations of culture conditions to visualize tissue response. For example, growth factor-coated beads can be applied locally to induce changes in feather patterning in a limited area. Alternatively, viral transduction can be delivered globally in the culture media to up or downregulate gene expression. Second, the skin recombination protocol allows researchers to investigate tissue interactions between the epidermis and mesenchyme that are derived from different skin regions, different life stages, or different species. This affords an opportunity to test the time window in which the epithelium is competent to respond to signals and its ability to form different skin appendages in response to signals from different mesenchymal sources. Third, skin reconstitution using dissociated dermal cells overlaid with intact epithelium resets skin development and enables the study of the initial processes of periodic patterning. This approach also enhances our ability to manipulate gene expression among the dissociated cells before creating the reconstituted skin explant. This paper provides the three culture protocols and exemplary experiments to demonstrate their utility.

Autor em destaque: Insight sobre as atuais metodologias experimentais de explante de pele aviária

Here we describe protocols for three types of avian embryonic skin explant cultures that can be used to examine tissue interactions, 4D imaging timelapse movie (3D plus time), global or local perturbation of molecular function, and systems biology characterization.

Usando explantes de pele aviária para estudar padrões de tecidos e organogênese

The developing avian skin during embryogenesis is a unique model that can provide valuable insights into tissue patterning. Here three variations on skin ...

Os papéis de forças físicas no início Chick embrionárias morfogênese de sondagem

Resumo

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Ensaio para Indução Neural no embrião de galinha

Cultura de organotypic método para estudar o desenvolvimento de tecidos embrionários de galinha

Ensaio de membros recombinantes de frango para entender morfogênese, padronização e primeiros passos na diferenciação celular

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Usando explantes de pele aviária para estudar padrões de tecidos e organogênese

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