Name: rapid nanoprobe signal enhancement by in situ gold nanoparticle synthesis
Uploaded: 2018-03-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis at JoVE.com

Financiamento do Conselho Europeu de investigação no âmbito do sétimo programa-quadro da União Europeia (FP/2007-2013) / ERC Grant acordo n. º 615458, o Conselho Sueco de pesquisa e excelência Pronova centro de tecnologia de proteína (VINNOVA - Sueco Agência governamental para sistemas de inovação) é reconhecida com gratidão.

De acordo com as exigências éticas e legais do país de coleção, ou seja, obtiveram-se amostras de soro humano. com a aprovação de um Comitê de ética (ou similar) e com o consentimento por escrito do doador.
1. preparação da solução reforço:
<ol><li>Prepare um 10 mM de tampão de pH 6 MES, suspendendo o MES, sal de sódio em água desionizada. Ajuste o pH a 6 usando uma solução de NaOH 4m.</li>
	<li>Prepare uma solução de4 HAuCl de 10 mM de tampão de pH 6 MES (solução 1) de 5 mM.</li>
	<li>Prepare uma solução de2 1,027 M H2O em 10 mM de tampão de pH 6 MES (solução 2). Nota: Os volumes da solução 1 e 2 de solução depende o número e tamanho de microarrays para ser aprimorado. Por exemplo, um microarray de 10 x 10 mm requer 100 μL total volume (solução 1 + solução 2) Certifique-se de que a área de microarray é em contacto com a solução de realce. Após a diluição, o H2O2 deve ser usado dentro de aproximadamente 30-45 dias.</li>
</ol>2. preparação de nanopartículas:
<ol><li>Preparar 40 nm AuNPs conforme descrito por Bastús et al. 16 brevemente, Injete 1 mL de precursor de4 HAuCl aquosa 25 mM em uma solução fervente de citrato de sódio 2,2 mM (149 mL). Espere até que uma cor vermelho-vinho é observada. Use esta solução de nanopartículas como sementes para etapas de semente-crescimento.</li>
	<li>A 90 ° C, Injete 1 mL de citrato de sódio 60 mM, seguido por 1 mL de HAuCl4 de 25 mM para a semente que contém a solução. Depois de 30 min, a reação é completa. Repita o passo de semente-crescimento cinco vezes até 40 nm nanopartículas são obtidas, como descrito por Bastús et al. 16
</li>
	<li>Medir a absorvância da solução final de nanopartículas para determinar o tamanho das nanopartículas do UV-vis. 17 como alternativa, micrografias de elétron de transmissão (TEM) podem ser adquiridas e utilizadas para determinar o tamanho das nanopartículas.</li>
	<li>Preparar a 90 nm AgNPs conforme descrito por Rivero et al. 18 brevemente, adicionar dimethylaminoborane (DMAB) para uma solução vigorosamente mexida de poli (ácido acrílico, sal de sódio) (PAA) e AgNO3. O volume final da solução é de 50 mL e a concentração final de DMAB, PAA e AgNO3 são 1, 6mm, 10mm e 3,33 mM, respectivamente. Nota: 100 nm IONPs modificados com grupos carboxila e 50 nm SiNPs modificados com grupos carboxila foram comprados.</li>
	<li>Funcionalizar o AuNPs com anticorpos seguindo o protocolo descrito por Puertas et al. 19 brevemente, adicionar 1 mg de COOH-PEG-SH (5000 g·mol− 1) para uma solução de 1.2x10-9 AuNPs M (10 densidade óptica, OD). Ajuste o pH a 12 com uma solução de 4 M de NaOH.<ol>
<li>Deixe a solução incubar durante a noite, a temperatura ambiente (~ 22 ° C), em condições de agita suaves.</li>
		<li>Retire o excesso de PEG por centrifugação a solução a 13800 x g, durante 15 min.</li>
		<li>Resuspenda o pellet com 500 μL de água desionizada.</li>
		<li>Incubar a AuNPs PEG-modificado com 5 μmol N-(3-Dimethylaminopropyl)-n '-cloridrato de ethylcarbodiimide (EDC) e 7.5 μmol de sal de sódio de N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) em 10mm MES de pH 6 de buffer por 30 min a 37 ° C.</li>
		<li>Remova o excesso de EDC e sulfo-NHS por centrifugação a solução a 13800 x g por 5 min.</li>
		<li>Resuspenda o pellet em 500 µ l de tampão de pH 6 de MES de 10 mM e adicionar 100 g·mL-1 de anticorpo. Deixe a solução incubar durante 2 h a 37 ° C.</li>
		<li>Retirar o excesso de anticorpos por centrifugação a solução a 13800 x g durante 10 minutos, duas vezes e resuspenda o pellet em 500 μL de 10mm de sódio fosfato pH 7,5, buffer de NaCl 0,3 M. Deixe a solução incube durante 30 min a 37 ° C.</li>
		<li>Remover os anticorpos inespecíficos acoplado por centrifugação a solução a 13800 x g durante 10 minutos, duas vezes e resuspenda o pellet em 500 μL de 1% albumina de soro bovino (BSA) em 10 mM de tampão de pH 6 MES. Incube as amostras a 4 ° C durante a noite.</li>
		<li>Lave o excesso de BSA por centrifugação a solução a 13800 x g durante 10 minutos, duas vezes e resuspending a pelota em 500 μL de tampão de pH 6 MES 10 mM.</li>
		<li>Siga as etapas 2.5.1 através de 2.5.9 para a modificação de 5m AgNPs, 0,5 mg de IONPS e 0,5 mg de SiNPs com anticorpo, ajustando as quantidades de EDC e sulfo-NHS adequadamente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. vertical fluxo ensaios baseados em papel:
<ol><li>Prepare os microarrays depositando uma gradiente concentração da proteína G na membrana de nitrocelulose papel com uma impressora robótica. Após a impressão, deixe a microarrays secar durante a noite em temperatura ambiente (~ 22 ° C).</li>
	<li>Realizar o ensaio de fluxo vertical com a fechadas em um suporte de filtro de membrana. Fluxo de uma solução de 8 M de AuNPs IgG-modificado usando uma bomba de seringa ultra a uma taxa de 1 mL·min− 1. Repita esta etapa com uma solução de 17 M IgG-modificado AgNPs, 0.1 mg·mL− 1 SiNPs IgG-modificado e 0.1 mg·mL− 1 IONPs IgG-modificado.</li>
	<li>Deixe os microarrays secar à temperatura ambiente (~ 22 ° C) por 30 min e digitalizá-las em um scanner de mesa com uma resolução de 4800 dpi. Salve as imagens como arquivos TIFF de 24-bits de cores.</li>
</ol>4. referência comerciais ensaios baseados em vidro:
<ol><li>Incube duas lâminas de vidro para 120 min para a deteção de componentes alérgeno com 4 amostras de soro humano diferente à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave os microarrays com água desionizada.</li>
	<li>Incubar um slide com um anticorpo de IgE de anti-humano conjugado fluorescente à temperatura ambiente (~ 22 ° C) por 30 min. Incubar o segundo slide com IgE anti-humano anticorpo-modificado AuNPs por 30 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave os microarrays com água desionizada.</li>
	<li>Medir a intensidade de fluorescência de microarray que foi incubado com anticorpo fluorescente anti-humano IgE com um instrumento de exploração do laser. Digitalizar o microarray que foi incubado com o anti-humano IgE AuNPs anticorpo-modificado com um scanner de mesa para a aquisição do sinal colorimétrico.</li>
	<li>Após a digitalização, incube o microarray com a solução de reforço à temperatura ambiente (~ 22° C) por 5 min.</li>
	<li>Enxágue-o com água desionizada e deixe secar por 10 min à temperatura ambiente (~ 22 ° C).</li>
	<li>Digitalizar o microarray com um scanner de mesa com uma resolução de 4800 dpi para aquisição do sinal colorimétrico. Salve as imagens como cinza de 16 bits, arquivos TIFF.</li>
</ol>5. Microarray incubação com solução de realce:
<ol><li>Pré-misturar a mesma quantidade de solução 1 e 2 de solução ou misturá-los diretamente na superfície do sensor e certifique-se de que a área de interesse sobre o microarray é coberta com a mistura da solução.</li>
	<li>Deixe o sensor incubar a temperatura ambiente com a solução de realce para cima para 5 min. de incubação mais longa, tempo pode render sensibilidade melhorada, bem como maior relação sinal/ruído, especialmente para microarrays baseados em papel.</li>
	<li>Lave o microarray submergindo-o em água desionizada, uma vez por 5 s. deixe-o secar à temperatura ambiente. Nota: O tempo da etapa de secagem depende do material do microarray. Para um microarray baseados em papel, a etapa de secagem requer aproximadamente 30 min. Para um microarray com base em vidro, a etapa de secagem requer aproximadamente 5-10 min.</li>
</ol>6. imagem latente de análise:
<ol><li>Analise as intensidades de fluorescência com a ferramenta de software. Considere todos os resultados que são igual ou superior a 0,3 unidades estandardizar Isac (ISU), seguindo as instruções de uso (DfU) do fabricante do sensor.</li>
	<li>Analise as intensidades colorimétricas, utilizando uma ferramenta de software. Inverta os arquivos de imagem, medir a intensidade de cada ponto e calcular a intensidade média de pixel. Use os valores dos três vias locais para calcular o valor final do sinal como uma média das três intensidades pixel ponto médio.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Holzinger, M., Le Goff, A., Cosnier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomaterials+for+biosensing+applications:+a+review.">Nanomaterials for biosensing applications: a review.</a> Front. Chem. 2, 1 (2014).</li><li>Conde, J., Dias, J. T., Graz&#250;, V., Moros, M., Baptista, P. V., de la Fuente, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+30+years+of+biofunctionalization+and+surface+chemistry+of+inorganic+nanoparticles+for+nanomedicine.">Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine.</a> Front. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+optimization+of+gold+nanoparticle-based+silver-enhanced+immunoassays.">Characterization and optimization of gold nanoparticle-based silver-enhanced immunoassays.</a> Anal. Chem. 79 (10), 3810-3820 (2007).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Atualmente, técnicas de realce de sinal para ensaios com detecção baseada em nano-sonda são ambos enzimáticos12, exigem um segundo conjunto de nanopartículas para a deteção nanosondas21 de destino ou, no caso de técnicas de coloração, são limitadas a o uso de AuNPs ou AgNPs, como detecção de sondas. 22 aqui, um método simples, rápido e livre de enzima é descrito para o realce do sinal dos ensaios de detecção-baseado de nanossondas. Com este método, foi possível melhorar o sinal colorimétrico fornecido por 4 tipos de nanosondas: AuNPs, AgNPs, IONPs e SiNPs.
O fator de amplificação observada para cada conjunto de nanosondas foi de 100-fold, exceto para o SiNPs onde a quantificação do fator de aprimoramento não foi possível devido à falta de sinais de pré-melhoramento. Este factor de intensificação sugere que a eficiência do protocolo é semelhante em todos os tipos de nanossondas. Além disso, quando o protocolo de realce foi executado em um suporte de papel, onde uma série de diluições de uma suspensão de AuNPs das ações foi impresso, observou-se um fator de 10000-fold de amplificação. Anterior ao realce, as manchas visíveis com o menor número de AuNPs foram onde aproximadamente 10000 nanopartículas foram impressos, realce as manchas abrigando nanopartículas de menos de 10 tornou-se visível. 20
As condições estabelecidas para o protocolo de realce aqui apresentado permitiram aproveitando-se da redução da Au3 + Au0 para melhorar o sinal, mantendo-se o ruído de fundo a um mínimo. O reforço pode ser realizado logo após o ensaio é realizado, bem como em Microarrays do que foram armazenados por até vários meses após o ensaio foi realizado. A solução de reforço consiste em uma mistura 1:1 de solução 1 e 2 de solução. Ambas as soluções podem ser previamente misturadas ou misturadas diretamente quando pipetado para o microarray. A diferença entre pré-mistura ou direto mistura afeta apenas a validade da solução de realce. Quando pré-misturados a validade é de 5-7 dias, aumentando para 30-45 dias se não pre-misturada.
Uma análise mais aprofundada dos resultados mostrou que o método de aprimoramento não interfere na análise quantitativa do biosensor. Uma correlação linear entre a intensidade observada e a concentração do analito foi mantida (tabela 1). Os dados obtidos para 4 amostras clínicas pré-caracterizadas usando o imunoensaio de microarray de componente alérgeno com base em vidro, com detecção de fluorescência padrão e Detecção colorimétrica, mostram uma boa concordância entre os dois métodos de detecção. Comparando a intensidade de fluorescência média (IFM) e a média intensidade colorimétrica (MCI), uma média R2 = 0,79 + /-0,08 obteve-se quando os dados são 10-conectado em ambos os eixos. Esta experiência mostrou que o método de reforço pode ser aplicado a um kit comercial se usa as nanosondas para deteção ou pode ser adaptado para detecção baseada em nano-sonda.
A eficácia do método de aprimoramento depende de dois aspectos críticos. É importante garantir que a mistura da solução 1 e 2 de solução é homogênea. Sem uma mistura homogênea, o sensor será em contacto com frações da solução de melhoria onde solução 1 ou 2 é predominante em relação a outras. Isso reduzirá a eficiência da redução da Au3 + Au0, assim, prejudicar a eficiência do reforço. Também é importante ter toda a área de interesse do microarray em contacto com a solução de reforço durante o período de incubação.
Para conseguir ultra-sensível realce de um sinal, um longo tempo de incubação (aproximadamente 5 min) com a solução de melhoria serão necessário. Para evitar o desenvolvimento do ruído de fundo que possa interferir com a aquisição de sinal, a superfície de microarray deve ser previamente bloqueados (por exemplo, BSA, PEG) para evitar a rápida deposição inespecífica de Au0 e consequente formação de um ouro camada.
Uma limitação para o método de realce é a eficácia intrínseca do ensaio. O ensaio requer ter controles positivos e negativos a garantir que o reforço de sinal observado pode ser atribuído ao verdadeiro-positivos resultados. Se houver uma interação não-específica das nanosondas com o alvo, sinais adquiridos após realce não será válido.
Outras técnicas de realce são baseadas em qualquer agregação de nanopartículas ou coloração das nanopartículas com um material que permite a aquisição do sinal melhorado. Promovendo o encontro do número de nanopartículas no local da deteção, a aquisição de sinal será possível também visualmente ou medidas de UV-Vis. 5 estas técnicas de reforço de sinal dependem de um sistema de detecção de duas etapas, a detecção inicial do analito de interesse e uma segunda etapa, onde o repórter é necessário para vincular a detecção inicial de construção. Tais estratégias faltam universalidade devido à exigência de otimização de protocolo acessório específico para cada tipo de ensaio.
As técnicas de realce de coloração, tais como prata, coloração, bem como o protocolo aqui apresentado, permitam o reforço direto das construções de deteção de sinal. No entanto, ao contrário do protocolo que é mostrado aqui, coloração prata só foi mostrado para ser aplicado a AuNPs ou AgNPs. 6 , 7 , 8 , 9
A aplicabilidade desse método provavelmente poderia abranger qualquer ensaio que usa AuNPs, AgNPs, IONPs ou SiNPs, como agentes de deteção. Prosseguir o trabalho está sendo realizado para estudar a aplicação do método em sensores de outras matérias.

A utilização de nanomateriais como nanopartículas de ouro (AuNPs) ou nanopartículas de óxido de ferro (IONPs) permitiu as aplicações em biosensing com versatilidade e sensibilidade melhorada. 1 a pletora de métodos desenvolvidos para a decoração da superfície de nanopartículas com vários ligantes, como tirar proveito de sua superfície elevada à relação do volume, permitiram a concepção de sensores com sensibilidade melhorada. 2 não obstante, uma ferramenta de biosensing é dependente do número de nanosondas necessários para conseguir um sinal detectável. Por exemplo, no caso de 40 nm AuNPs, para adquirir um sinal através de espectroscopia UV-vis, aproximadamente 90 × 106 nanosondas é necessária para detectar eficazmente o alvo de interesse. 3 essa limitação de densidade de nano-sonda pode ser contornada com o uso de amplificação de sinal. Tais estratégias4 pode basear-se na agregação interpartícula ou aglomeração, onde a densidade de nanosondas iniciais é aumentada por acumular um segundo conjunto de nanosondas após o primeiro. 5 aumento do número de nanopartículas em um determinado local na superfície sensor permite visual ou aquisição de sinal de UV-vis. No entanto, a sensibilidade do ensaio será inerentemente ligada à capacidade de direcionamento do segundo conjunto de nanopartículas para o conjunto inicial de nanosondas. Outras estratégias dependem da coloração de ouro e de prata nanosondas. 6 , 7 a coloração é conseguida através da redução de íons de prata para a superfície de nanopartículas, permitindo um visual ou detecção de UV-vis. 8 esses métodos aumentar o sinal de existir ouro ou prata nanosondas por potenciando a plasmon de superfície ressonância do sinal, não dependendo de eventos alvos secundários como métodos de aglomeração interpartícula. No entanto, métodos de coloração prateado só foram relatados com o uso de ouro ou prata nanosondas. 8 , 9
Em 2005, Zayats et al. 10 relataram a redução de íons Au para a superfície de ouro nanosondas para aumentar o sinal de ressonância de plasmon de superfície. Neste trabalho dependente da enzima, peróxido de hidrogênio foi gerado por catálise de glicose oxidase e juntamente com cloreto de cetyltrimethylammonium, permitida a redução do ácido cloroáurico.
Mais recentemente Wang et al. relatou um método de aprimoramento, onde uma camada de ouro é produzida na superfície da nanosondas existentes. 11 estes nanosondas alargadas exibido peroxidase-como a atividade catalítica contra o substrato 3 ', 5, 5 '-tetrametilbenzidina (TMB) que permite a visualização de uma cor azul brilhante olho nu.
Stevens et al . relatado o desenvolvimento de um ensaio de ELISA-baseado plasmônico. 12 após a detecção de um antigénio específico da próstata (PSA) através de uma estratégia de ELISA a tradicional, um anticorpo secundário marcado com catalase foi incubado com o sensor, após o qual o sensor estava imerso em uma solução contendo peróxido de hidrogênio e Ácido cloroáurico. A presença de catalase-modificado anticorpo secundário (resultado positivo) irá promover o consumo de água oxigenada, retardando a redução de Ácido cloroáurico e rendendo quase esférica monodispersas AuNPs com uma cor vermelha. A ausência do anticorpo da catalase-modificado (resultado negativo) permitiu a concentração de peróxido de hidrogênio permaneceu intacto, promovendo assim a redução rápida cloroáurico e rendendo AuNPs com morfologias mal-definidas responsáveis por uma cor azul/roxo . A concentração de peróxido de hidrogênio, determinado pela atividade da catalase, foi mostrada para ser correlacionada com a concentração do analito de interesse. A necessidade de um anticorpo secundário da catalase-modificado e o controle das condições da atividade catalítica são dois fatores que dificultam a universalidade desse método. Além disso, a formação de clusters de ouro, independentes do AuNPs existentes, pode apresentar problemas de ruído de fundo a estratégia de amplificação.
As técnicas acima mencionadas, como também vários outros13,14,15, tornaram possível para biossensores baseados em nano-sonda atingir limites de detecção, a par com as técnicas tradicionais.
Aqui, um método de aprimoramento de ouro romance é demonstrado, onde o sinal de um nano-sonda existente é amplificado por potenciando ou introduzir um sinal de ressonância de plasmon de superfície. Após a deteção é realizada com o uso de ouro, prata, quartzo ou nanopartículas de óxido de ferro, o sensor é permitido para incubar com uma solução de uma mistura de peróxido de hidrogênio e o Ácido cloroáurico em 2-(N-Morpholinos) etanesulfónico ácido tampão de pH 6 (MES). As concentrações dos componentes da solução de realce foram otimizadas para favorecer a deposição de Au0 na superfície da nanosondas existentes. Para todos estudaram tipos de nanossondas, i. e. AuNPs, nanopartículas de prata (AgNPs), nanopartículas de sílica (SiNPs) e IONPs, a formação de uma camada mal-definidas renderam ou aumentada a dispersão da luz, o que resultou em um sinal visível aumento ou detectável. Um aumento de sinal com um fator de amplificação de 100 vezes foi conseguido para nanosondas em microarrays baseada em vidro e papel e o processo leva menos de 5 min para adquirir um sinal. A aquisição de sinal poderia ser feita a olho nu, espectroscopia UV-vis ou imagem ferramentas low-end, tais como uma câmera digital ou um scanner de mesa. Além disso, foi demonstrado que este protocolo de aprimoramento pode ser aplicado facilmente em um ensaio de diagnóstico de alergia comercialmente disponível sem a necessidade de otimização específica.

<table><tbody><tr><td>Chloroauric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>254169 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641 SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylaminoborane&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>476668 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Poly(acrylic acid, sodium salt)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>416037 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Silver nitrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>204390 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>100 nm magnetic nanoparticles</td><td>Ademtech</td><td>021111</td><td></td></tr><tr><td>50 nm silica nanoparticles</td><td>Corposcular</td><td>140510-10</td><td></td></tr><tr><td>COOH-PEG-SH&amp;nbsp;</td><td>RAPP Polymere</td><td>135000-4-32</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.06462&amp;nbsp;EMD MILLIPORE</td><td></td></tr><tr><td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&amp;rsquo;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03449&amp;nbsp;SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56485&amp;nbsp;ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95313 SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250 SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>IgG antibody</td><td>Abcam</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483&amp;nbsp;ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653&amp;nbsp;SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>422351S</td><td></td></tr><tr><td>Protein G</td><td>Thermo Scientific</td><td>21193</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose paper membrane</td><td>Whatman</td><td>10402096</td><td></td></tr><tr><td>Nanoplotter 2.1 robotic printer</td><td>GeSIM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter holder</td><td>Merck</td><td>XX3001200</td><td></td></tr><tr><td>PhD2000 Ultrasyring pump</td><td>Harvard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flatbed scanner CannonScan 9000F Mark II</td><td>Cannon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-human IgE antibody-modified AuNPs&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser scanning LuxScan 10/K</td><td>Capital Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Table-top scanner Image Scanner Epson Expression 1600 pro</td><td>Epson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass slide ImmunoCAP ISAC sIgE 112</td><td>Thermofisher</td><td>81-1011-01</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent-conjugated anti-human IgE antibody&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>81-1011-01</td><td></td></tr><tr><td>Phadia Microarray Image Analyzer MIA 1.2.4&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rapid nanoprobe signal enhancement by in situ gold nanoparticle synthesis

O uso de nanosondas tais como ouro, prata, quartzo ou nanopartículas de óxido de ferro como reagentes de detecção em ensaios bioanalíticos pode permitir alta sensibilidade e conveniente leitura colorimétrica. No entanto, altas densidades de nanopartículas são normalmente necessários para a deteção. Os protocolos disponíveis baseado em síntese realce são nanopartículas ou limitadas a ouro e prata ou dependem de otimização e controle preciso enzimático. Aqui, apresentamos um protocolo para melhorar a leitura colorimétrica de ouro, prata, sílica e óxido de ferro nanosondas. Observou-se que o sinal colorimétrico pode ser melhorado por até um 10000-fold fator. A base para tais estratégias de reforço de sinal é a redução química de Au3 + Au0. Existem várias reações químicas que permitem a redução de Au3 + Au0. No protocolo, do bom buffers e H2O2 são utilizados e é possível favorecer a deposição de Au0 para a superfície da nanosondas existentes, em detrimento da formação de nanopartículas de ouro novas. O protocolo consiste a incubação do microarray com uma solução composta por Ácido cloroáurico e H2O2 no 2-(N-Morpholinos) tampão de pH ácido 6 etanesulfónico após o ensaio de detecção baseada em nano-sonda. A solução de reforço pode ser aplicada a sensores baseados em vidro e papel. Além disso, ele pode ser usado em imunoensaios comercialmente disponíveis como demonstrado pela aplicação do método para um microarray do alérgeno comercial. O desenvolvimento do sinal requer menos de 5 min de incubação com a solução de realce e a leitura pode ser avaliada ao olho nu ou dispositivos de aquisição de imagem low-end como um scanner de mesa ou uma câmera digital.

Depois é realizado um ensaio, usando nanosondas como agentes da deteção, a área de detecção do sensor pode ser preenchida com nanosondas (Figura 1um). Se o número de nanosondas estiver abaixo do limite para uma detecção visual, a detecção do analito será, inicialmente, considerada negativa. Usando o protocolo aqui apresentado (Figura 1b), o sinal das nanosondas é potencializado com a introdução de uma camada mal definida de Au (Figura 1c).
Realizou-se um imunoensaio baseado em papel, concebido para a detecção da proteína G como para mostrar a eficácia do protocolo de reforço (Figura 2). AuNPs, AgNPs, SiNPs e IONPs foram modificados com anticorpos IgG e usados e deteção de agentes. Microarrays de papel foram preparados quanto ter um gradiente de um número de moléculas de proteína G para cada local.
Depois que o ensaio foi realizado, observou-se que IgG AuNPs modificados (IgG-AuNPs) foram capazes de detectar tão baixo como 2 × 105 moléculas por ponto (Figura 2um), IgG AgNPs modificados (IgG-AgNPs) foram capazes de detectar tão baixo como 2 × 104 moléculas por ponto (Figura 2c), IgG modificado IONPs (IgG-IONPs) foram capazes de detectar tão baixo como 2 × 107 moléculas por local (Figura 2e) e IgG modificado SiNPs (IgG-SiNPs) não foram capazes de fornecer um sinal visual ( Figura 2g).
Incubando os microarrays com a solução de realce, foi possível aumentar o sinal pelo 100-fold em todos os tipos de nanopartículas usados. No caso SiNPs, a solução de melhoria, foi possível observar um sinal onde nenhum sinal visual foi observado sem a solução de reforço (Figura 22f 2d, b e 2 h).
Foi avaliada a possibilidade de aplicação do método para um imunoensaio comercial existente. O reforço foi realizado em um imunoensaio de microarray de componente alérgeno com base em vidro. Um conjunto de 4 validado e caracteriza-se amostras de pacientes alérgicos foram avaliadas com o microarray de soro (amostras foram designadas como a, b, c e d). A detecção de fluorométrica padrão deste ensaio foi comparada com coloração com anti-IgE rotulado AuNPs seguido do reforço de sinal (Figura 3). Antes da realce, sem manchas foram detectadas nos microarrays onde a deteção foi realizada com anti-IgE rotulado AuNPs. Depois do realce, vários pontos eram visíveis a olho nu e sua intensidade foi registrada por digitalização de imagem (Figura 3). Com a detecção de fluorescência, uma variedade de pontos foram detectados (Figura 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57297/57297fig1.jpg"> Figura 1 . Ilustração das etapas uma microspot sofre da detecção do analito para sinal avançado. (um) dois anticorpos-modificado nanosondas após a detecção de um analito imobilizada em uma microspot, (b) incubação do microarray com o protocolo de realce e semente-crescimento subsequente do anticorpo-modificado nanosondas e ( c) microspot onde o tamanho das nanosondas aumentado após incubação 5 min com a solução de reforço. Esta figura tem sido dapted de Dias et al. 20 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57297/57297fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57297/57297fig2.jpg"> Figura 2 . Imagens digitalizadas de microarrays para a detecção de proteínas G. À esquerda de cada microarray são o microspots observados antes da melhoria da detecção realizada com (um) IgG-AuNPs, (c) IgG-AgNPs, (e) IgG-IONPs e (g), IgG-SiNPs. À direita de cada microarray são o microspots depois do realce de (b) IgG-AuNPs, (d) IgG-AgNPS, (f) IgG-IONPs e (h), IgG-SiNPs. Cada concentração de proteína G foi depositada sobre o microarray em triplicado. Um cálculo do número de proteínas que g foi feito com base na concentração da proteína impresso em cada microspot. Esta figura tem sido adaptada de Dias et al. 20 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57297/57297fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57297/57297fig3.jpg"> Figura 3 . Correlação entre a intensidade fluorescente e intensidade colorimétrica obtidos para os ensaios realizados com o ensaio de diagnóstico de alergia comercial. Quer dizer a intensidade da fluorescência (IFM) e significa intensidade colorimétrica (MCI), medida para a detecção de alérgenos nas amostras a, b, c e d. inserções são os dados de log 10 transformado nos intervalos onde observou-se uma correlação linear entre os dois métodos. A intensidade da microspots observada para a detecção baseada no anticorpo fluoróforo-modificado (fluoróforo-Ab) é a emissão de fluorescência. O brilho do microspots observada para a detecção baseado no ensaio de Ab-AuNPs foi obtido após a digitalização do microarray e invertendo a imagem com software de imagem. Microarrays são concebidos de forma a ter triplica vertical com controlos positivos para a deteção de fluorescência na parte inferior da extrema-direita. Os outros três cantos são utilizados para avaliação do software. Analisaram-se imagens em escala de cinza de 16 bits. Esta figura tem sido adaptada de Dias et al. 20 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57297/57297fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Realce de prévia do R2</td>
			<td>R2 depois do realce</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG-AuNPs</td>
			<td>8.70E-01</td>
			<td>7.80E-01</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG-AgNPs</td>
			<td>9.10E-01</td>
			<td>9.60E-01</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG-IONPs</td>
			<td>9.17E-01</td>
			<td>9.30E-01</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG-SiNPs</td>
			<td>-</td>
			<td>8.50E-01</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1. R2 valores para detecção da proteína G, antes e depois do realce, usando diferentes conjuntos de nanopartículas. Obtiveram-se os valores de2 R depois correlacionando a intensidade das manchas com a concentração do analito medida.

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Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

Neste trabalho, é apresentado um protocolo para reforço de sinal da biosensing baseado em nano-sonda. O protocolo é baseado na redução do ácido cloroáurico na superfície do nanosondas existentes que consistem em ouro, prata, quartzo ou nanopartículas de óxido de ferro.

Sinal de nanossondas rápida realce pela síntese de nanopartículas de ouro em Situ

The use of nanoprobes such as gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles as detection reagents in bioanalytical assays can enable high sensitivity ...

rapid-nanoprobe-signal-enhancement-situ-gold-nanoparticle

Research

JoVE Journal

Chemistry

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

7.5K visualizações.  KTH Royal Institute of Technology. Neste trabalho, é apresentado um protocolo para reforço de sinal da biosensing baseado em nano-sonda. O protocolo é baseado na redução do ácido cloroáurico na superfície do nanosondas existentes que consistem em ouro, prata, quartzo ou nanopartículas de óxido de ferro.

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Fabricating a UV-Vis and Raman Spectroscopy Immunoassay Platform

Immunoassays are used to detect proteins based on the presence of associated antibodies. Because of their extensive use in research and clinical settings, a large infrastructure of immunoassay instruments and materials can be found. For example, 96- and 384-well polystyrene plates are available commercially and have a standard design to accommodate ultraviolet-visible (UV-Vis) spectroscopy machines from various manufacturers. In addition, a wide variety of immunoglobulins, detection tags, and blocking agents for customized immunoassay designs such as enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) are available.
Despite the existing infrastructure, standard ELISA kits do not meet all research needs, requiring individualized immunoassay development, which can be expensive and time-consuming. For example, ELISA kits have low multiplexing (detection of more than one analyte at a time) capabilities as they usually depend on fluorescence or colorimetric methods for detection. Colorimetric and fluorescent-based analyses have limited multiplexing capabilities due to broad spectral peaks. In contrast, Raman spectroscopy-based methods have a much greater capability for multiplexing due to narrow emission peaks. Another advantage of Raman spectroscopy is that Raman reporters experience significantly less photobleaching than fluorescent tags1. Despite the advantages that Raman reporters have over fluorescent and colorimetric tags, protocols to fabricate Raman-based immunoassays are limited. The purpose of this paper is to provide a protocol to prepare functionalized probes to use in conjunction with polystyrene plates for direct detection of analytes by UV-Vis analysis and Raman spectroscopy. This protocol will allow researchers to take a do-it-yourself approach for future multi-analyte detection while capitalizing on pre-established infrastructure.

Nanoparticle-based optical probes have been designed as a vehicle for detecting antigens using Raman and UV-Vis spectroscopy. Here we describe a protocol for preparing such probes for a UV-Vis/Raman spectroscopy immunoassay in such a way to incorporate future multiplexing capabilities.

A fabricação de um UV-Vis e espectroscopia Raman de plataforma Imuno

Immunoassays are used to detect proteins based on the presence of associated antibodies. Because of their extensive use in research and clinical settings, ...

Bioquímica

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

Síntese Nanostar ouro com um método de crescimento de sementes de Prata Mediated

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Bioengenharia

A Simple Method for the Size Controlled Synthesis of Stable Oligomeric Clusters of Gold Nanoparticles under Ambient Conditions

Reducing dilute aqueous HAuCl4 with sodium thiocyanate (NaSCN) under alkaline conditions produces 2 to 3 nm diameter nanoparticles. Stable grape-like oligomeric clusters of these yellow nanoparticles of narrow size distribution are synthesized under ambient conditions via two methods. The delay-time method controls the number of subunits in the oligoclusters by varying the time between the addition of HAuCl4 to alkaline solution and the subsequent addition of reducing agent, NaSCN. The yellow oligoclusters produced range in size from ~3 to ~25 nm. This size range can be further extended by an add-on method utilizing hydroxylated gold chloride (Na+[Au(OH4-x)Clx]-) to auto-catalytically increase the number of subunits in the as-synthesized oligocluster nanoparticles, providing a total range of 3 nm to 70 nm. The crude oligocluster preparations display narrow size distributions and do not require further fractionation for most purposes. The oligoclusters formed can be concentrated &#62;300 fold without aggregation and the crude reaction mixtures remain stable for weeks without further processing. Because these oligomeric clusters can be concentrated before derivatization they allow expensive derivatizing agents to be used economically. In addition, we present two models by which predictions of particle size can be made with great accuracy.

We describe a simple method for producing highly stable oligomeric clusters of gold nanoparticles via the reduction of chloroauric acid (HAuCl4) with sodium thiocyanate (NaSCN). The oligoclusters have a narrow size distribution and can be produced with a wide range of sizes and surface coats.

Um método simples para o tamanho Síntese controlada de estáveis ​​Oligoméricas Clusters de nanopartículas em condições ambientais

Reducing dilute aqueous HAuCl4 with sodium thiocyanate (NaSCN) under alkaline conditions produces 2 to 3 nm diameter nanoparticles. Stable grape-like ...

Química

Hydroquinone Based Synthesis of Gold Nanorods

Gold nanorods are an important kind of nanoparticles characterized by peculiar plasmonic properties. Despite their widespread use in nanotechnology, the synthetic methods for the preparation of gold nanorods are still not fully optimized. In this paper we describe a new, highly efficient, two-step protocol based on the use of hydroquinone as a mild reducing agent. Our approach allows the preparation of nanorods with a good control of size and aspect ratio (AR) simply by varying the amount of hexadecyl trimethylammonium bromide (CTAB) and silver ions (Ag+) present in the "growth solution". By using this method, it is possible to markedly reduce the amount of CTAB, an expensive and cytotoxic reagent, necessary to obtain the elongated shape. Gold nanorods with an aspect ratio of about 3 can be obtained in the presence of just 50 mM of CTAB (versus 100 mM used in the standard protocol based on the use of ascorbic acid), while shorter gold nanorods are obtained using a concentration as low as 10 mM.

This paper describes a protocol for the synthesis of gold nanorods, based on the use of hydroquinone as reducing agent, plus the different mechanisms for controlling their size and aspect ratio.

Hidroquinona baseada Síntese de ouro Nanorods

Gold nanorods are an important kind of nanoparticles characterized by peculiar plasmonic properties. Despite their widespread use in nanotechnology, the ...

Microfabrication of Nanoporous Gold Patterns for Cell-material Interaction Studies

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, biomedical device coatings, and drug delivery tools. Nanoporous gold (np-Au), produced by a nano-scale self-assembly process, is a relatively new material that exhibits large effective surface area, high electrical conductivity, and catalytic activity. These properties have made np-Au an attractive material to scientific community. Most studies on np-Au employ macro-scale specimens and focus on fundamental science of the material and its catalytic and sensor applications. The macro-scale specimens limit np-Au's potential in miniaturized systems, including biomedical devices. In order to address these issues, we initially describe two different methods to micropattern np-Au thin films on rigid substrates. The first method employs manually-produced stencil masks for creating millimeter-scale np-Au patterns, while the second method uses lift-off photolithography to pattern sub-millimeter-scale patterns. As the np-Au thin films are obtained by sputter-deposition process, they are compatible with conventional microfabrication techniques, thereby amenable to facile integration into microsystems. These systems include electrically-addressable biosensor platforms that benefit from high effective surface area, electrical conductivity, and gold-thiol-based surface bioconjugation. We describe cell culture, immunostaining, and image processing techniques to quantify np-Au's interaction with mammalian cells, which is an important performance parameter for some biosensors. We expect that the techniques illustrated here will assist the integration of np-Au in platforms at various length-scales and in numerous applications, including biosensors, energy storage systems, and catalysts.

We report on techniques to micropattern nanoporous gold thin films via stencil printing and photolithography, as well as methods to culture cells on the microfabricated patterns. In addition, we describe image analysis methods to characterize morphology of the material and the cultured cells using scanning electron and fluorescence microscopy techniques.

Microfabricação de Padrões de Ouro Nanoporosos para celular-primas estudos de interacção

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, ...

Naked-Eye Detection of Rare Point Mutations in DNA

The protocol describes a naked-eye colorimetric test for the detection of somatic point mutations in an excess of wild type DNA. The future foreseen application of the method is the identification of rare mutations in circulating cell-free DNA from liquid biopsies, with a relevance in cancer diagnostics and stratification of oncological patients for personalized therapy. As a proof of concept, the test has been designed to detect the BRAFV600E mutation in the BRAF gene, which is important to identify the sub-group of melanoma patients that can benefit from targeted therapies with BRAF inhibitors. However, this colorimetric test can be easily generalized to other somatic mutations of clinical relevance due to the use of universal detection probes, thus providing strong potential in oncological diagnostics.
The test detects 0.5% of BRAFV600E in an excess of BRAFWT DNA, which matches the sensitivity of some commercial instrumental assays. Such sensitivity is clinically relevant for diagnostic purposes, allowing the early identification of drug-sensitive patients. In contrast to commercial assays based on real-time PCR, this test requires minimal instrumentation and processing, as it can be performed on DNA amplified with a standard PCR (or isothermal techniques) and provides a naked-eye readout with a one-tube reaction of a few steps in only one hour. At present, the test has been used only on synthetic DNA samples. However, the latter have been designed to mimic a real sample amplified from circulating cell-free DNA, to favor the translation of the test to clinical diagnostics.

This protocol permits the naked-eye identification of point mutated DNA in a 200-fold excess of wild type DNA molecules, by exploiting gold nanoparticles and paramagnetic microparticles.

The protocol describes a naked-eye colorimetric test for the detection of somatic point mutations in an excess of wild type DNA. The future foreseen ...

Gold Nanoparticle Synthesis

Gold nanoparticles (Au nanoparticles) that are ~12 nm in diameter were synthesized by rapidly injecting a solution of 150 mg (0.15 mmol) of tetrachloroauric acid in 3.0 g (3.7 mmol, 3.6 mL) of oleylamine (technical grade) and 3.0 mL of toluene into a boiling solution of 5.1 g (6.4 mmol, 8.7 mL) of oleylamine in 147 mL of toluene. While boiling and mixing the reaction solution for 2 hours, the color of the reaction mixture changed from clear, to light yellow, to light pink, and then slowly to dark red. The heat was then turned off, and the solution was allowed to gradually cool down to room temperature for 1 hour. The gold nanoparticles were then collected and separated from the solution using a centrifuge and washed three times; by vortexing and dispersing the gold nanoparticles in 10 mL portions of toluene, and then precipitating the gold nanoparticles by adding 40 mL portions of methanol and spinning them in a centrifuge. The solution was then decanted to remove any remaining byproducts and unreacted starting materials. Drying the gold nanoparticles in a vacuum environment produced a solid black pellet; which could be stored for long periods of time (up to one year) for later use, and then redissolved in organic solvents such as toluene.

A protocol for synthesizing ~12 nm diameter gold nanoparticles (Au nanoparticles) in an organic solvent is presented. The gold nanoparticles are capped with oleylamine ligands to prevent agglomeration. The gold nanoparticles are soluble in organic solvents such as toluene.

Síntese de Nanopartículas de Ouro

Gold nanoparticles (Au nanoparticles) that are ~12 nm in diameter were synthesized by rapidly injecting a solution of 150 mg (0.15 mmol) of ...

Medições SERS de molécula única habilitadas por nanoantenas de origami de DNA plasmônico

Single-Molecule Surface-Enhanced Raman Scattering Measurements Enabled by Plasmonic DNA Origami Nanoantennas

Surface-enhanced Raman scattering (SERS) has the capability to detect single molecules for which high field enhancement is required. Single-molecule (SM) SERS is able to provide molecule-specific spectroscopic information about individual molecules and therefore yields more detailed chemical information than other SM detection techniques. At the same time, there is the potential to unravel information from SM measurements that remain hidden in Raman measurements of bulk material. This protocol outlines the SM SERS measurements using a DNA origami nanoantenna (DONA) in combination with atomic force microscopy (AFM) and Raman spectroscopy. A DNA origami fork structure and two gold nanoparticles are combined to form the DONAs, with a 1.2-2.0 nm gap between them. This allows an up to 1011-fold SERS signal enhancement, enabling measurements of single molecules. The protocol further demonstrates the placement of a single analyte molecule in a SERS hot spot, the process of AFM imaging, and the subsequent overlaying of Raman imaging to measure an analyte in a single DONA.

Autor em destaque: Medições de espalhamento Raman aprimoradas por superfície de molécula única habilitadas por nanoantenas de origami de DNA plasmônico  

This protocol demonstrates single-molecule surface-enhanced Raman scattering (SERS) measurements using a DNA origami nanoantenna (DONA) combined with colocalized atomic force microscopy (AFM) and Raman measurements.

Medidas de espalhamento Raman aprimoradas por superfície de molécula única habilitadas por nanoantenas de origami de DNA plasmônico

Surface-enhanced Raman scattering (SERS) has the capability to detect single molecules for which high field enhancement is required. Single-molecule (SM) ...

Sinal de nanossondas rápida realce pela síntese de nanopartículas de ouro em Situ

Resumo

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A fabricação de um UV-Vis e espectroscopia Raman de plataforma Imuno

Síntese Nanostar ouro com um método de crescimento de sementes de Prata Mediated

Um método simples para o tamanho Síntese controlada de estáveis Oligoméricas Clusters de nanopartículas em condições ambientais

Hidroquinona baseada Síntese de ouro Nanorods

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