Os autores Obrigado Linnea Tankred e Diana Rydholm para criação de animais.

Filhotes de rato BALB/c, de ambos os sexos foram utilizados em conformidade com a instrução para o uso de animais em oftalmológico e Vision Research, e os protocolos foram aprovados pela Comissão de Estocolmo para a ética Animal de investigação. Os ratos foram alojados em ninhadas, juntamente com a mãe que amamenta, com um ciclo de dia/noite de 12 h, livre acesso à comida e água e monitorados diariamente.
Nota: Para o procedimento cirúrgico, os ratos foram mantidos sob anestesia com isoflurano voláteis. Pomadas oculares são desencorajadas durante procedimentos oculares, como eles podem interferir com tratamentos e substâncias utilizadas. Se necessário, para evitar o olho seco, uma gota de solução salina normal estéril pode ser aplicada. Apesar da Úvea punções são self-healing, cuidado foi tomado durante punções da Úvea para garantir a esterilidade com instrumentos cirúrgicos. Tratamento pós-cirúrgico incluiu a hidratação com solução salina normal por via subcutânea e analgesia com a administração tópica ocular de cloridrato de tetracaína. Os filhotes foram autorizados a recuperar a prostração esternal sobre uma almofada de aquecimento antes de ser devolvido para a mãe que amamenta, em uma gaiola limpa. Ninhadas foram mantidas com a mesma mãe de enfermagem para evitar o estresse.
1. anestesia
<ol><li>Prepare a câmara de indução de anestesia, para administrar o isoflurano anestésico e certifique-se de que uma máscara pequena do mouse também é acoplada. Nota: Realize experimentos todos os animais de acordo com todas as licenças éticos aplicáveis.</li>
	<li>Prefill câmara de indução com 3-4% de isoflurano voláteis no ar atmosférico. Nota: Diferentes substâncias anestésicas que isoflurano podem ser utilizadas, de acordo com autorizações de éticas. Procedimentos anestésicos voláteis devem ser realizados uma campânula ventilada de banco ou emanações.</li>
	<li>Coloca um filhote de rato BALB/c de 12,5-dias de idade pós-natal (P) na câmara de indução. Confirme que o aparelho de anestesia está pronto para entregar isoflurano para a câmara de indução. Nota: Filhotes de rato são frágeis e melhor manipulado pela nuca. Manter os filhotes juntos como uma ninhada ou com a mãe de enfermagem para evitar o estresse.</li>
	<li>Permitir que o filhote ser totalmente anestesiado.</li>
	<li>Delicadamente, pega o filhote de rato pela nuca. Nota: Manter a câmara de indução fechada em todos os momentos para indução segura e estável.</li>
	<li>Transferi o mouse para a máscara de roedor. Certifique-se de mudar o fluxo anestésico da câmara de indução para a máscara ao mover o mouse.</li>
	<li>Execute uma pitada de dedo do pé para confirmar a anestesia.</li>
</ol>2. perfure o procedimento sob estereoscópio cirúrgico
<ol><li>Posicione o mouse na posição lateral de prostração. Confirme que a máscara está bem posicionada para que o olho do rato é no campo de visão do estereoscópio.</li>
	<li>Assim que o olho está virada para cima em direção ao estereoscópio, Rode suavemente a cabeça de rato. Nota: O foco claro do olho deve ser alcançado sob o estereoscópio. Posicionamento, é recomendável uma ampliação de 16x, enquanto 40 X deve ser usado para realizar o procedimento cirúrgico. Se ética autorizações permitem, aparar a ponta dos bigodes pode facilitar a visualização do olho.</li>
	<li>Usando pequenas pinças subordinante, cuidadosamente se projetam olho do filhote aplicando uma pressão para baixo para as pálpebras, dorsais e ventrais ao olho.</li>
	<li>Segure um suave mas firme da tampa do olho do filhote, com pequenas pinças. Nota: Recomenda-se realizar a protusão do olho e tampa segurando com a mão não dominante, como a mão dominante deve executar o procedimento de punção.</li>
	<li>Use o estereoscópio para localizar ao limbo da córnea. Limbo de Albino BALB/c pode ser facilmente identificado, o plexo vascular circular posterior da córnea.</li>
	<li>Com uma agulha chanfrada de diâmetro (30 G) de 0,25 mm, realize uma pequena punção da Úvea, perto do limite de estroma posterior da Úvea. Use apenas a ponta da agulha, e não mais da metade do bisel (equivalente a 0,5 mm), punção da Úvea. Se executado corretamente, os furos da Úvea são auto-selante, ainda injeção intra-ocular de substâncias de estudo pode ser administrada através do mesmo ferimento. Nota: Se experimentou com anatomia ocular do mouse, a punção da Úvea é executada entre o corpo ciliar e ora serrata. Deve ter cuidado ao executar a punção da Úvea para evitar a ruptura da lente.</li>
	<li>Realize a punção da Úvea segunda no site do oposto do olho do primeiro local de punção. Otimizar a distância e a posição das punções; Considere o 12 e punções de 06:00, com 12:00 sendo tão dorsal quanto possível.</li>
	<li>Repita o procedimento de punções da Úvea em quatro dias até P24.5. Antes de cada punção da Úvea sucessiva, monitore animais status especial atenção à presença da catarata traumática devido a dano da lente durante a punção da Úvea, ou pressão ocular diminuição óbvia. Aponte para executar punções repetição às mesmas posições como punções anteriores para efeitos de ideais.</li>
</ol>3. não-invasiva na Vivo de monitoramento
<ol><li>Antes da punção ou injeções em cada dia experimental, anestesia o mouse como realizada acima.</li>
	<li>Com o mouse na posição lateral de prostração, projetam-se suavemente o olho.</li>
	<li>Concentre-se na vasculatura de íris com o estereoscópio cirúrgico.</li>
	<li>Tire uma foto da vasculatura íris com uma câmera equipada para o estereoscópio cirúrgico. Nota: Apesar de não haver necessidade, induzindo a meiose pode ser útil para normalizar a área de íris por animal. Considere éticas licenças quando selecionando um agente indutor de meiose. Cuidado foco da vasculatura íris facilitará ainda mais a análise quantitativa. Recomenda-se uma magnitude de 40 X.</li>
</ol>4. no pós-operatório cuidados
<ol><li>Remover o filhote BALB/c da máscara de roedores e suavemente, transferi-lo para uma almofada de aquecimento em camadas com uma esteira cirúrgica.</li>
	<li>Aplique uma gota de solução de tetracaína 1% aos olhos perfurados. Nota: Outras soluções analgésicas podem ser usadas, de acordo com autorizações de éticas.</li>
	<li>Hidrate o animal com uma injeção subcutânea de 200 µ l de solução salina normal estéril.</li>
	<li>Retorne o filhote para a mãe que amamenta em uma gaiola limpa do mouse.</li>
	<li>Monitore o processo de recuperação. O filhote deve ser capaz de deambulate e voltar para a maca.</li>
</ol>5. olho Enucleação
<ol><li>Eutanásia do animal por deslocamento cervical. Execute Enucleação e dissecação sob um estereoscópio para melhor visualização do procedimento. Nota: Os procedimentos de eutanásia diferentes podem ser usados. Recomenda-se a aderir às autorizações de éticas.</li>
	<li>Separe as pálpebras para melhorar a exposição aos olhos.</li>
	<li>Fazer um pequeno corte (cerca de 0,5 cm) perto do canto do olho das pálpebras com uma tesoura de olho Bonn curva.</li>
	<li>Use o espaço periocular expostas para inserir micro fórceps subordinante atrás (do globo sob) na órbita.</li>
	<li>Pegue o tecido circundante do olho e puxe delicadamente para cima. Evitar a exploração sobre o globo ocular, usar os tecidos circundantes mais próximo ao soquete do olho.</li>
	<li>Inserir a tesoura de olho Bonn curva atrás do globo do olho na órbita.</li>
	<li>Corte os tecidos circundantes, até que o olho é liberado do soquete. Nota: Esta técnica de dissecação mantém a anatomia do olho e beneficia a análise subsequente.</li>
	<li>Proceda à remoção do tecido externos do olho. A remoção de tecido estranho pode ser executada após a fixação, se preferirem. Nota: Camundongos BALB/c são melanina deficiente, portanto, para aumentar o contraste, é recomendado um fundo escuro para facilitar o processo de dissecação.</li>
	<li>Brevemente enxaguar o olho inteiro em uma placa de Petri preenchida com solução salina tampão fosfato (PBS).</li>
	<li>Transfira o olho para um tubo de 2 mL contendo 1,5 mL de solução de formol tamponado de 4%.</li>
	<li>Fixar o olho durante 6 h à temperatura ambiente. Nota: Fixação confere a rigidez do tecido e facilita a dissecação da íris. Tempo de fixação deve ser testado e ajustado para diferentes aplicações.</li>
</ol>6. Iris dissecação procedimento sob estereoscópio
<ol><li>Remover a solução fixador do tubo com uma pipeta Pasteur plástica de 1,5 mL (ou similar) e enxágue os olhos três vezes com PBS fresco.</li>
	<li>Coloque o olho fixo em uma superfície lisa seca (carrinho de dissecação) com câmara anterior voltado para cima.</li>
	<li>Com uma agulha 30G chanfrada, realize um ponto de entrada posterior ao limbo.</li>
	<li>Segurando o segmento anterior com pequenas pinças subordinante, insira uma ponta do Clayman-Vannas para reta na abertura criada anteriormente. Nota: Recomenda-se controlar a pinça com a mão não dominante e a tesoura com o dominante.</li>
	<li>Enquanto roda o olho com a pinça subordinante, corte em torno ao limbo para remover o segmento posterior do olho. Nota: Efectuar cortes parciais permitirá a ponta interna da tesoura para continuar no tecido e grandemente facilita o processo.</li>
	<li>Posicione o segmento anterior voltada para baixo, expondo a lente.</li>
	<li>Remova a lente cuidadosamente agarrando-o com pequenas pinças e puxando para cima. Nota: Uma agulha chanfrada pode ser usada para perfurar e puxe a lente.</li>
	<li>Posicione o segmento anterior com a córnea virado para baixo e o corte perpendicular ao campo de visão.</li>
	<li>Pegue delicadamente o tecido posterior ao corpo ciliar com a pequena pinça subordinante.</li>
	<li>Com uma tesoura reta Clayman-Vannas, prosseguir para aparar só anterior do corpo ciliar para remover a malha trabecular e isolar a íris. Confirmar que a malha trabecular é removida; a íris deve mover-se dentro da córnea.</li>
	<li>Transferi com cuidado a viseira anterior com a pinça subordinante pequena, mantendo a córnea, a uma placa de 96 poços contendo 200 µ l de PBS.</li>
	<li>Continue a manter a córnea no poço e dissecar a íris por lavagem com PBS com uma pipeta. Nota: Se o aderente de restos de íris para a córnea, uma malha trabecular pode estar presente e o bisel da agulha 30G pode ser usado para ajudar a deslocar a íris.</li>
	<li>Retire o 96 poços com a pequena pinça subordinante da córnea e manter a íris isolada no poço para uma análise mais aprofundada.</li>
	<li>Armazenar amostras flutuantes íris a 4 ° C. Nota: Apesar de ser corrigido, armazenamento a longo prazo das amostras flutuantes íris não é recomendado.</li>
</ol>7. possíveis leituras experimentais
<ol><li>Para visualizar os vasos sanguíneos em íris dissecados, use toda a montagem flutuante imuno-histoquímica coloração métodos para marcadores como a molécula de adesão celular endotelial de plaquetas (PECAM) -1 ou isolectin B4. Como alternativa, use perfusão de todo o corpo com manchas vasculares, tais como dextranos fluorescente-etiquetadas alto peso molecular.</li>
	<li>Use na vivo não invasiva imagens para realizar em silico plana-montagem e quantificar a vasculatura íris completo com software de imagem apropriado. Nota: O sistema vascular pode ser quantificada, tanto in vivo e em vitro, utilizando densitometria ou com vasculatura análise software9.</li>
	<li>O processo todo globo ocular para ácidos nucleicos e extração da proteína, seguido por métodos PCR ou immunoblotting, realizar a análise molecular dos olhos perfurados. Nota: Análise Molecular dos tecidos é melhor executada com tecido não fixa, mas dissecação da íris não fixa é extremamente desafiador, e o uso do olho todo tem processado resultados estatisticamente significativos em anteriores estudos8.</li>
</ol>

<ol>
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Os autores não têm nada para divulgar.

No presente protocolo, é apresentado um novo método para a indução da resposta vascular de íris por punção da Úvea. A punção desencadeia mecanismos de cura ferida e promove respostas vasculares na íris10,11. Isto está de acordo com patologias oculares, tais como o PDR e NVG, onde respostas angiogênico exacerbada da retina no segmento posterior do olho culminaram com o quadro clínico da rubeosis iridis, uma aumento de vascularização da íris<sup cl...

A íris, juntamente com o corpo ciliar e a coroide, compreende a Úvea, que é o tecido mais vascularizado do olho. Vasculatura Iris é essencial na manutenção da homeostase na câmara anterior do olho. Como resultado de abundantes conexões anastomótica entre artérias e veias, os vasos sanguíneos de íris fornecer nutrientes e o suprimento de oxigênio não só a íris em si, mas o todo segmento anterior do olho1.
A formação de novos vasos sanguíneos, ou angiogênese de pre-existentes, é fundamental em processos fisiológicos, tais como desenvolvimento e2de cicatrização de feridas. Angiogênese é finamente regulada por uma multiplicidade de factores canônicas, como fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e inibidor de ativador de plasminogênio (PAI), bem como vários fatores inflamatórios, e um desequilíbrio desses fatores pode levar a patológica angiogênese3.
No olho, a neovascularização é a causa de doenças fatais vista, tais como a retinopatia diabética proliferativa (PDR) e glaucoma neovascular (NVG). Nestas doenças oculares, a neovascularização focal geralmente está localizada em tecidos da retina, no entanto, o desequilíbrio em inflamatória e fatores angiogênico em ambos as anteriores e posteriores oculares câmaras do olho tem sido associada com rubeosis iridis, o termo clínico para íris neoangiogênese patológica4. Estas patologias indicam a capacidade da íris adulta submeter-se a angiogênese. Em camundongos, sistema vascular ocular é imaturo, após o nascimento e continua a maturação pós-parto. Esta peculiaridade do desenvolvimento é explorada no modelo do rato da retinopatia induzida pelo oxigênio, um modelo que imita pròxima o quadro clínico de retinopatia da prematuridade5. Além disso, angiogênese e inflamação desempenham um papel crucial em mecanismos6de cicatrização de feridas, e para ferir a cura em si tem sido associada a angiogênese modelos7.
Neste estudo, descrevemos um modelo de neovascularização íris induzida por punção. Da Úvea punções são realizadas perto do limite exterior do limbo, que induzem a neovascularização da íris por acionar a sistema de cicatrização de feridas. Devido a transparência da córnea, a vasculatura de íris pode ser analisado facilmente na vivo por métodos não-invasivos. Furado olhos apresentam um aumento do leito vascular na íris, que tem sido associada com um aumento da ativação do plasminogênio e marcadores inflamatórios8. O modelo apresentado tem um grande potencial como uma nova ferramenta para estudar a angiogênese e triagem angiogênico compostos e permite a visualização direta no vivo dos processos angiogênico.

<table><tbody><tr><td>Bonn eye scissors</td><td>Bausch &amp;amp; Lomb</td><td>23060</td><td></td></tr><tr><td>Clayman-Vannas curved scissors</td><td>Bausch &amp;amp; Lomb</td><td>E3383 C</td><td></td></tr><tr><td>Clayman-Vannas straight scissors</td><td>Bausch &amp;amp; Lomb</td><td>E3383 S</td><td></td></tr><tr><td>Objective adapter for camera</td><td>Handcrafted</td><td>N/A</td><td>Or any system that allows adapting a camera to the microscope</td></tr><tr><td>Heating Pad 100-110 watts</td><td>Non Applicable</td><td>N/A</td><td>Available in pet/veterinarian stores</td></tr><tr><td>Hypodermic 30g beveled needle</td><td>KDM GmBH germany</td><td>911914</td><td></td></tr><tr><td>Iphone 4S</td><td>Apple</td><td>Non Applicable</td><td>Or other high resolution image acquistion device</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>KDG 9623</td><td></td></tr><tr><td>McPherson tying forceps</td><td>Bausch &amp;amp; Lomb</td><td>E1815 S</td><td></td></tr><tr><td>Micro tying forceps</td><td>Bausch &amp;amp; Lomb</td><td>63140</td><td></td></tr><tr><td>Minims tetracaine hydrochloride</td><td>Bausch &amp;amp; Lomb</td><td>N/A</td><td>1 % (w/v) Eye Drops</td></tr><tr><td>Neutral-buffered formalin</td><td>Bioreagens</td><td>0018-40</td><td></td></tr><tr><td>Normal saline solution</td><td>Fresenius Kabi</td><td>210352</td><td>0.9 % (w/v) NaCl in injectable water</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td>Balanced and buffered PBS pH 7.4</td></tr><tr><td>Petri dish 10 cm</td><td>Starstedt</td><td>83.3902</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 3 cm</td><td>Starstedt</td><td>83.3900</td><td></td></tr><tr><td>Safe Seal Tube 2.0 mL</td><td>Starstedt</td><td>72.685.200</td><td>Or any eppendorf style tubes</td></tr><tr><td>TC plate 96-well</td><td>Starstedt</td><td>83.3924</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipette 3.5 mL</td><td>Starstedt</td><td>86.1171</td><td>Or any other Pasteur pipette style</td></tr><tr><td>Univentor 400 anesthesia unit</td><td>Univentor Limited</td><td>N/A</td><td>Or equivalent flow regulator with induction chamber and mask for volatile anesthesia</td></tr><tr><td>Wild M650 surgical microscope</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>N/A</td><td>Or other surgical or magnifying stereoscope</td></tr></tbody></table>

puncture-induced iris neovascularization as a mouse model of rubeosis iridis

Descrevemos um modelo de neovascularização íris induzida por punção como um modelo geral para avaliação não invasiva da angiogênese. O modelo também é relevante para o direcionamento de glaucoma neovascular, uma visão ameaçadora complicação da retinopatia diabética. Este método baseia-se na indução da resposta vascular de íris por uma série de furos da Úvea autovedante em camundongos BALB/c e aproveita a maturação pós-parto da vasculatura ocular do mouse. Filhotes de rato passam por punções da Úvea do dia pós-natal 12.5, quando os filhotes naturalmente abrirem seus olhos, até o dia pós-natal 24,5. Devido a transparência da córnea, vasculatura íris pode ser analisada facilmente através do tempo por métodos não invasivos na vivo . Além disso, a íris semitransparente de camundongos BALB/c pode ser flatmounted para immunohistologic detalhada análise com coloração de fundo mínimo de não-específica. Neste modelo, angiogênese é impulsionado principalmente pela inflamatória e plasminogênio Ativando sistemas. O modelo induzida por punção é o primeiro para induzir a neovascularização da íris em pequenos roedores e tem a vantagem de permitir a análise directa não invasivo na vivo do processo angiogênico. Além disso, o modelo pode ser combinado com substâncias modulando angiogênico, que destaca seu potencial no estudo da angiogênese com uma perspectiva na vivo .

Filhotes de rato Albino BALB/c em p 12.5 foram submetidas a punções da Úvea, repetidas cada quarto dia (experimental dia 0, 4, 8, 12), até P24.5. Em P27.5, os ratos foram sacrificados e íris cuidadosamente dissecado (experimental dia 15). Fotos de olhos de rato foram tiradas com uma câmera acoplada a um estereoscópio cirúrgico antes de cada série de punção em cada dia experimental para avaliar a avaliação não invasiva da resposta vascular íris. Punções da Úvea induzem um...

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Puncture-Induced Iris Neovascularization as a Mouse Model of Rubeosis Iridis

Neovascularização da íris, uma complicação comum da doença isquêmica da retina, pode levar a risco de vista neovascular glaucoma. Aqui, descrevemos um protocolo murino para induzir a neovascularização da íris experimental que pode ser utilizada para avaliação não invasiva da angiogênese-modulando as substâncias.

Induzida por punção neovascularização de Iris como um modelo do rato da Rubeosis Iridis

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

8.7K visualizações.  Karolinska Institutet. Neovascularização da íris, uma complicação comum da doença isquêmica da retina, pode levar a risco de vista neovascular glaucoma. Aqui, descrevemos um protocolo murino para induzir a neovascularização da íris experimental que pode ser utilizada para avaliação não invasiva da angiogênese-modulando as substâncias.

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A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) research. By administering targeted laser injury to the RPE and Bruch&#8217;s membrane, the procedure induces angiogenesis, modeling the hallmark pathology observed in neovascular AMD. 
First developed in non-human primates, the laser-induced CNV model has come to be implemented into many other species, the most recent of which being the mouse. Mouse experiments are advantageously more cost-effective, experiments can be executed on a much faster timeline, and they allow the use of various transgenic models. The miniature size of the mouse eye, however, poses a particular challenge when performing the procedure. Manipulation of the eye to visualize the retina requires practice of fine dexterity skills as well as simultaneous hand-eye-foot coordination to operate the laser. However, once mastered, the model can be applied to study many aspects of neovascular AMD such as molecular mechanisms, the effect of genetic manipulations, and drug treatment effects. 
The laser-induced CNV model, though useful, is not a perfect model of the disease. The wild-type mouse eye is otherwise healthy, and the chorio-retinal environment does not mimic the pathologic changes in human AMD. Furthermore, injury-induced angiogenesis does not reflect the same pathways as angiogenesis occurring in an age-related and chronic disease state as in AMD.
Despite its shortcomings, the laser-induced CNV model is one of the best methods currently available to study the debilitating pathology of neovascular AMD. Its implementation has led to a deeper understanding of the pathogenesis of AMD, as well as contributing to the development of many of the AMD therapies currently available.

Here, we present the mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) protocol, an experimental model that re-creates the vascular hallmarks of neovascular age-related macular degeneration (AMD). Once mastered, it can reliably and effectively induce CNV as a model system to test various experimental measures.

Um modelo de rato para induzida por laser coróide Neovascularização

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) ...

Medicina

A Mouse Model of Retinal Ischemia-Reperfusion Injury Through Elevation of Intraocular Pressure

Retinal ischemia-reperfusion (I/R) is a pathophysiological process contributing to cellular damage in multiple ocular conditions, including glaucoma, diabetic retinopathy, and retinal vascular occlusions. Rodent models of I/R injury are providing significant insights into mechanisms and treatment strategies for human I/R injury, especially with regard to neurodegenerative damage in the retinal neurovascular unit. Presented here is a protocol for inducing retinal I/R injury in mice through elevation of intraocular pressure (IOP). In this protocol, the ocular anterior chamber is cannulated with a needle, through which flows the drip of an elevated saline reservoir. Using this drip to raise IOP above systolic arterial blood pressure, a practitioner temporarily halts inner retinal blood flow (ischemia). When circulation is reinstated (reperfusion) by removal of the cannula, severe cellular damage ensues, resulting ultimately in retinal neurodegeneration. Recent studies demonstrate inflammation, vascular permeability, and capillary degeneration as additional elements of this model. Compared to alternative retinal I/R methodologies, such as retinal arterial ligation, retinal I/R injury by elevated IOP offers advantages in its&#160;anatomical specificity, experimental tractability, and technical accessibility, presenting itself as a valuable tool for examining neuronal pathogenesis and therapy in the retinal neurovascular unit.

This article describes a procedure for inducing retinal ischemia-reperfusion injury by elevated intraocular pressure in mice. Retinal ischemia-reperfusion injury by elevated intraocular pressure serves to model human pathologies characterized by compromised oxygen and nutrient delivery in the retina, enabling researchers to examine potential cellular mechanisms and treatments for human diseases of the retinal neurovascular unit.

Um modelo de mouse Retinal isquemia-reperfusão Através elevação da pressão intra-ocular

Retinal ischemia-reperfusion (I/R) is a pathophysiological process contributing to cellular damage in multiple ocular conditions, including glaucoma, ...

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this protocol, we aim to guide the reader not simply through the technical considerations of generating laser-induced lesions to trigger neovascular processes, but rather focus on the powerful information that can be obtained from multimodal longitudinal in vivo imaging throughout the follow-up period.
The laser-induced mouse CNV model was generated by a diode laser administration. Multimodal in vivo imaging techniques were used to monitor CNV induction, progression and regression. First, spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) was performed immediately after the lasering to verify a break of Bruch&#39;s membrane. Subsequent in vivo imaging using fluorescein angiography (FA) confirmed successful damage of Bruch&#39;s membrane from serial images acquired at the choroidal level. Longitudinal follow-up of CNV proliferation and regression on days 5, 10, and 14 after the lasering was performed using both SD-OCT and FA. Simple and reliable grading of leaky CNV leasions from FA images is&#160;presented. Automated segmentation for measurement of total retinal thickness, combined with manual caliber application for measurement of retinal thickness at CNV sites, allow unbiased evaluation of the presence of edema. Finally, histological verification of CNV is performed using isolectin GS-IB4 staining on choroidal flatmounts. The staining is thresholded, and the isolectin-positive area is calculated with ImageJ.
This protocol is especially useful in therapeutics studies requiring high-throughput-like screening of CNV pathology as it allows fast, multimodal, and reliable classification of CNV pathology and retinal edema. In addition, high resolution SD-OCT enables the recording of other pathological hallmarks, such as the accumulation of subretinal or intraretinal fluid. However, this method does not provide a possibility to automate CNV volume analysis from SD-OCT images, which has to be performed manually.

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Here, we present the usefulness of longitudinal in vivo imaging in the follow-up of morphological changes of laser-induced choroidal neovascularization in mice.

Na Vivo Imagiologia multimodal e análise do modelo de neovascularização coroide de induzida por Laser de Mouse

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this ...

Neurociência

A Model of Glaucoma Induced by Circumlimbal Suture in Rats and Mice

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known risk factor for glaucoma. This protocol demonstrates a step-by-step guide on this technique in Long Evans rats and C57BL/6 mice. Under general anesthesia, a "purse-string" suture is applied on the conjunctiva, around the equator and behind the limbus of the eye. The fellow eye serves as an untreated control. Over the duration of our study, which was a period of 8 weeks for rats and 12 weeks for mice, IOP remained elevated, as measured regularly by rebound tonometry in conscious animals without topical anesthesia. In both species, the sutured eyes showed electroretinogram features consistent with preferential inner retinal dysfunction. Optical coherence tomography showed selective thinning of the retinal nerve fiber layer. Histology of the rat retina in cross-section found reduced cell density in the ganglion cell layer, but no change in other cellular layers. Staining of flat-mounted mouse retinae with a ganglion cell specific marker (RBPMS) confirmed ganglion cell loss. The circumlimbal suture is a simple, minimally invasive and cost-effective way to induce ocular hypertension that leads to ganglion cell injury in both rats and mice.

Chronic ocular hypertension is induced by applying a circumlimbal suture in rats and mice, leading to functional and structural deterioration of the retinal ganglion cells consistent with glaucoma.

Um modelo de Glaucoma induzido por sutura Circumlimbal em ratos e camundongos

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known ...

Optimization of the Retinal Vein Occlusion Mouse Model to Limit Variability

Mouse models of retinal vein occlusion (RVO) are often used in ophthalmology to study hypoxic-ischemic injury in the neural retina. In this report, a detailed method pointing out critical steps is provided with recommendations for optimization to achieve consistently successful occlusion rates across different genetically modified mouse strains. The RVO mouse model consists primarily of the intravenous administration of a photosensitizer dye followed by laser photocoagulation using a retinal imaging microscope attached to an ophthalmic guided laser. Three variables were identified as determinants of occlusion consistency. By adjusting the wait time after rose bengal administration and balancing the baseline and experimental laser output, the variability across experiments can be limited and a higher success rate of occlusions achieved. This method can be used to study retinal diseases that are characterized by retinal edema and hypoxic-ischemic injury. Additionally, as this model induces vascular injury, it can also be applied to study the neurovasculature, neuronal death, and inflammation.

Here, we describe an optimized protocol for retinal vein occlusion using rose bengal and a laser-guided retinal imaging microscope system with recommendations to maximize its reproducibility in genetically modified strains.

Otimização do Modelo de Oclusão de Veia da Retina em Camundongo para Limitar a Variabilidade

Mouse models of retinal vein occlusion (RVO) are often used in ophthalmology to study hypoxic-ischemic injury in the neural retina. In this report, a ...

Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR model induction and its readouts in both mice and rats. Retinal neovascularization is induced in OIR by exposing rodent pups either to hyperoxia (mice) or alternating levels of hyperoxia and hypoxia (rats). The primary readouts of these models are the size of neovascular (NV) and avascular (AVA) areas in the retina. This preclinical in vivo model can be used to evaluate the efficacy of potential anti-angiogenic drugs or to address the role of specific genes in the retinal angiogenesis by using genetically manipulated animals. The model has some strain and vendor specific variation in the OIR induction which should be taken into consideration when designing the experiments.

Oxygen-induced retinopathy (OIR) can be used to model ischemic retinal diseases such as retinopathy of prematurity and proliferative diabetic retinopathy and to serve as a model for proof-of-concept studies in evaluating antiangiogenic drugs for neovascular diseases. OIR induces robust and reproducible neovascularization in the retina that can be quantified.

Modelo de Retinopatia Induzida por Oxigênio para Doenças Isquêmicas da Retina em Roedores

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...

Quantification of Vascular Parameters in Whole Mount Retinas of Mice with Non-Proliferative and Proliferative Retinopathies

Retinopathies are a heterogeneous group of diseases that affect the neurosensory tissue of the eye. They are characterized by neurodegeneration, gliosis&#160;and a progressive change in vascular function and structure. Although the onset of the retinopathies is characterized by subtle disturbances in visual perception, the modifications in the vascular plexus are the first signs detected by clinicians. The absence or presence of neovascularization determines whether the retinopathy is classified as either non-proliferative (NPDR) or proliferative (PDR). In this sense, several animal models tried to mimic specific vascular features of each stage to determine the underlying mechanisms involved in endothelium alterations, neuronal death and other events taking place in the retina. In this article, we will provide a complete description of the procedures required for the measurement of retinal vascular parameters in adults and early birth mice at postnatal day (P)17. We will detail the protocols to carry out retinal vascular staining with Isolectin GSA-IB4 in whole mounts for later microscopic visualization. Key steps for image processing with Image J Fiji software are also provided, therefore, the readers will be able to measure vessel density, diameter and tortuosity, vascular branching, as well as avascular and neovascular areas. These tools are highly helpful to evaluate and quantify vascular alterations in both non-proliferative and proliferative retinopathies.

This article describes a well-established and reproducible lectin stain assay for the whole mount retinal preparations and the protocols required for the quantitative measurement of vascular parameters frequently altered in proliferative and non-proliferative retinopathies.

Quantificação de Parâmetros Vasculares em Retinas inteiras de Camundongos com Retinopatias Não Proliferativas e Proliferativas

Retinopathies are a heterogeneous group of diseases that affect the neurosensory tissue of the eye. They are characterized by neurodegeneration, ...

Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic nerve and retinal ganglion cell (RGC) degeneration, resulting in visual dysfunction by interrupting the transmission of visual information from the eye to the brain. Elevated intraocular pressure is the most important risk factor; thus, several models of ocular hypertension have been developed in rodents by either genetic or experimental approaches to investigate the causes and effects of the disease. Among those, some limitations have been reported such as surgical invasiveness, inadequate functional assessment, requirement of extensive training, and highly variable extension of retinal damage. The present work characterizes a simple, low-cost, and efficient method to induce ocular hypertension in rodents, based on low-temperature, full-circle cauterization of the limbal vascular plexus, a major component of aqueous humor drainage. The new model provides a technically easy, noninvasive, and reproducible subacute ocular hypertension, associated with progressive RGC and optic nerve degeneration, and a unique post-operative clinical recovery rate that allows in vivo functional studies by both electrophysiological and behavioral methods.

The goal of this protocol is to characterize a novel model of glaucomatous neurodegeneration based on 360&#176; thermic cauterization of limbal vascular plexus, inducing subacute ocular hypertension.

Cauterização em círculo completo do plexo vascular limbal no glaucoma induzido cirurgicamente em roedores

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic ...

<meta charset="utf8"></head><body>Modelo de camundongo para lesão de isquemia-reperfusão retiniana para estudar patologias retinianas

Induction of Retinal Ischemia-Reperfusion Injury in a Mouse Eye Model

Ischemia-reperfusion injuries are known to cause a range of retinal pathologies, including diabetic retinopathy, glaucoma, retinal vascular occlusions, and other vaso-occlusive conditions. This manuscript presents a method for inducing ischemia-reperfusion injury in a mouse model. The method utilized anterior chamber cannulation attached to a saline reservoir, generating hydrostatic pressure to raise the intraocular pressure to 90-100 mmHg. This method effectively caused constriction of retinal capillaries to induce retinal ischemia. At the end of the ischemic period (60 min), the intraocular pressure was normalized (&#8804;20 mmHg) before removing the cannula from the anterior chamber to initiate reperfusion. Days after the ischemia/reperfusion procedure, the eyes were collected and sectioned for histological staining. The histopathology of the retinal sections was scored by evaluating eight parameters of retinal injury: folds, hemorrhage, deformation, cell loss in the ganglion cell, inner nuclear, outer nuclear, and photoreceptor layers, and damage to retinal pigment epithelial cells. This method provided a reproducible model to study the mechanisms and pathology of retinal ischemia/reperfusion injury. In addition, this model can facilitate the discovery of potential therapeutic targets to treat retinal ischemia/reperfusion injury, advancing the study of retinal pathologies and improving patient outcomes.

<meta charset="utf8"></head><body>Indução de lesão de isquemia-reperfusão retiniana em um modelo de olho de camundongo

This protocol models retinal ischemia-reperfusion injury in a mouse eye by inducing retinal ischemia via anterior chamber cannulation and intraocular pressure elevation, followed by intraocular pressure normalization to initiate the reperfusion.

Indução de lesão de isquemia-reperfusão retiniana em um modelo de olho de camundongo

Ischemia-reperfusion injuries are known to cause a range of retinal pathologies, including diabetic retinopathy, glaucoma, retinal vascular occlusions, ...

Induzida por punção neovascularização de Iris como um modelo do rato da Rubeosis Iridis

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Um modelo de rato para induzida por laser coróide Neovascularização

Um modelo de mouse Retinal isquemia-reperfusão Através elevação da pressão intra-ocular

Na Vivo Imagiologia multimodal e análise do modelo de neovascularização coroide de induzida por Laser de Mouse

Um modelo de Glaucoma induzido por sutura Circumlimbal em ratos e camundongos

Otimização do Modelo de Oclusão de Veia da Retina em Camundongo para Limitar a Variabilidade

Modelo de Retinopatia Induzida por Oxigênio para Doenças Isquêmicas da Retina em Roedores

Quantificação de Parâmetros Vasculares em Retinas inteiras de Camundongos com Retinopatias Não Proliferativas e Proliferativas

Cauterização em círculo completo do plexo vascular limbal no glaucoma induzido cirurgicamente em roedores

Indução de lesão de isquemia-reperfusão retiniana em um modelo de olho de camundongo

Indução de lesão de isquemia-reperfusão retiniana em um modelo de olho de camundongo