Los autores agradecen a Linnea Tankred y Diana Rydholm para la ganadería.

Crías de ratón BALB/c de ambos sexos fueron utilizados con arreglo a la declaración para el uso de animales en oftalmológica y la investigación de visión, y los protocolos fueron aprobados por la Comisión de Estocolmo para la investigación Animal ético. Ratones fueron alojados en literas, junto con la madre de la enfermería, con un ciclo de día/noche 12 h, libre acceso al alimento y agua y supervisados diariamente.
Nota: Para el procedimiento quirúrgico, los ratones se mantuvieron bajo anestesia con isoflurano volátil. Ungüentos oculares son recomendables durante los procedimientos oculares, ya que podrían interferir con los tratamientos y sustancias utilizadas. Si es necesario, para evitar el ojo seco, una gota de solución salina normal estéril puede ser aplicada. Aunque los pinchazos uveales son auto-sanación, fue procurar durante punciones uveales esterilidad con instrumentos quirúrgicos. Tratamiento post quirúrgico incluye la hidratación con solución salina normal por vía subcutánea y analgesia con la administración ocular tópica de clorhidrato de tetracaína. Los cachorros se les permitiera recuperar a recumbency esternal en un cojín de calefacción antes de ser devuelto a la madre de la enfermería, en una jaula limpia. Camadas se mantuvieron con la misma madre de la enfermería para evitar el estrés.
1. anestesia
<ol><li>Preparar la cámara de inducción de anestesia, para administrar anestésico isoflurano y garantizar que también se acopla una máscara de ratón pequeño. Nota: Realizar experimentos de todo animales de acuerdo con todos los permisos éticos aplicables.</li>
	<li>Rellenar previamente la cámara de inducción con 3-4% de isoflurano volátiles en aire atmosférico. Nota: Diferentes sustancias anestésicas que isoflurano pueden utilizarse, según permisos de éticas. Procedimientos anestésicos volátiles deben llevarse en una campana ventilada de banco o humo.</li>
	<li>Lugar un postnatal (P) 12.5 días de edad BALB/c ratón cachorro en la cámara de inducción. Confirmar que el aparato de anestesia está listo para entregar isoflurano a la cámara de inducción. Nota: Crías de ratón son frágiles y mejor manejada por el pescuezo. Mantener los cachorros juntos como una basura o con la madre para evitar el estrés.</li>
	<li>Deje que el cachorro ser completamente anestesiada.</li>
	<li>Suavemente, levante el cachorro de ratón por el pescuezo. Nota: Mantenga la cámara de inducción, cerrada en todo momento para la inducción segura y estable.</li>
	<li>Transferir el ratón a la máscara de roedor. Asegúrese de cambiar el flujo anestésico de la cámara de inducción a la máscara al mover el ratón.</li>
	<li>Realizar un pellizco del dedo del pie para confirmar la anestesia.</li>
</ol>2. Perfore el procedimiento bajo estereoscopio quirúrgica
<ol><li>Coloque el ratón en la posición lateral recumbency. Confirmar que la máscara está bien posicionada por lo que es el ojo de ratón en el campo de visión del estereoscopio.</li>
	<li>Suavemente gire la cabeza del ratón por lo que el ojo es hacia arriba hacia el estereoscopio. Nota: Enfoque claro del ojo debe lograrse bajo el estereoscopio. Para la colocación, se recomienda un aumento de 16 X, mientras que 40 X debe ser utilizado para realizar el procedimiento quirúrgico. Si lo permiten permisos éticos, recorte la punta de los bigotes puede facilitar la visualización del ojo.</li>
	<li>Cuidadosamente usando pinzas atar pequeñas, sobresalen ojo del cachorro aplicando presión hacia abajo a los párpados dorsales y ventrales al ojo.</li>
	<li>Mantenga una mano suave pero firme de párpado del cachorro, con pinzas pequeñas. Nota: Se recomienda para realizar la protrusión ocular y tapa sujetando con la mano no dominante, como la mano dominante debe realizar el procedimiento de punción.</li>
	<li>Usa el Estereoscopio para situar el limbo corneal. Limbo de albinos BALB/c puede identificarse fácilmente por el plexo vascular circular posterior a la córnea.</li>
	<li>Con una aguja biselada de 0.25 mm diámetro (30 G), realizar una pequeña punción uveal, cerca del límite limbal posterior de la uvea. Utilice sólo la punta de la aguja, y no más de la mitad del bisel (equivalente a 0.5 mm), perfore la úvea. Si se ejecuta correctamente, las punciones uveales son autosellantes, pero la inyección intraocular de sustancias de estudio puede ser administrada a través de la misma herida de punción. Nota: Si experimenta con anatomía ocular de ratón, la puntura uveal se ejecuta entre el cuerpo ciliar y la ora serrata. Debe tener cuidado al realizar la punción uveal para evitar la ruptura de la lente.</li>
	<li>Realizar la segunda punción uveal en el sitio opuesto del ojo desde el primer sitio de la punción. Optimizar la distancia y la posición de las perforaciones; considerar 12 y 6:00 pinchazos, con 12:00 siendo como dorsal como sea posible.</li>
	<li>Repita el procedimiento de úvea pinchazos cada cuatro días hasta P24.5. Antes de cada punción uveal sucesiva, monitorear estado animal prestando especial atención a la presencia de catarata traumática debido a daño de la lente durante la punción uveal, o evidente presión ocular disminuida. Objetivo para la realización de punciones repetidas en la misma posición como punciones anteriores para efectos óptimos.</li>
</ol>3. no invasiva in Vivo monitoreo
<ol><li>Antes de la punción o inyecciones cada día experimental, anestesiar el ratón como se realizó anteriormente.</li>
	<li>Con el ratón en la posición lateral recumbency, sobresalen suavemente el ojo.</li>
	<li>Centrarse en la vasculatura del iris con el estereoscopio quirúrgico.</li>
	<li>Tomar una foto de la vascularización del iris con una cámara para el estereoscopio quirúrgico. Nota: Aunque no es necesario, inductora de la meiosis puede ser útil para normalizar la zona de iris por animal. Considerar éticos permisos al seleccionar a un agente de inducción de la meiosis. Atención cuidadosa de la vascularización del iris más facilitará análisis cuantitativo. Se recomienda una magnitud de 40 X.</li>
</ol>4. postoperatorio cuidado
<ol><li>Quitar la cría de ratones BALB/c de la máscara de roedor y suavemente la transferencia a una almohadilla de calefacción con una estera quirúrgica.</li>
	<li>Aplicar una gota de solución de tetracaína 1% en ojos pinchados. Nota: Otras soluciones analgésicas pueden utilizarse, según permisos de éticas.</li>
	<li>Hidratar el animal con una inyección subcutánea de 200 μL de solución salina normal estéril.</li>
	<li>Regresar el cachorro a la madre en una jaula del ratón limpio.</li>
	<li>Supervisar el proceso de recuperación. El cachorro debe poder deambulate y volver a la camada.</li>
</ol>5. ojo enucleación
<ol><li>Eutanasia a los animales por dislocación cervical. Realizar enucleación y disección bajo un estereoscopio para mejor visualización del procedimiento. Nota: Pueden utilizar procedimientos diferentes de la eutanasia. Se recomienda apegarse estrictamente a la ética permite.</li>
	<li>Separe los párpados para mejorar la exposición a la vista.</li>
	<li>Hacer una pequeña incisión (aproximadamente 0,5 cm) cerca del canto de las tapas del ojo con curva tijeras de ojo de Bonn.</li>
	<li>Utilizar el espacio expuesto periocular para insertar micro pinzas ATA detrás (bajo) el globo en la órbita.</li>
	<li>Agarra el tejido que rodea el ojo y tire suavemente hacia arriba. Evitar la explotación en el globo ocular, utilizar más los tejidos circundantes a la cuenca del ojo.</li>
	<li>Inserte las tijeras de ojo Bonn curva detrás del globo ocular en la órbita.</li>
	<li>Corte a través de los tejidos circundantes hasta que el ojo se libera de la toma. Nota: Esta técnica de disección mantiene la anatomía del ojo y beneficia el análisis subsecuente.</li>
	<li>Proceder a la remoción de tejido extraño del ojo. La eliminación de tejido extraño puede realizarse después de la fijación, si se prefiere. Nota: Ratones BALB/c son melanina deficiente, por lo tanto, para aumentar el contraste, un fondo oscuro se recomienda para facilitar el procedimiento de disección.</li>
	<li>Brevemente enjuague el ojo todo en una placa Petri se llena con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS).</li>
	<li>Transferir el ojo a un tubo de 2 mL que contiene 1,5 mL de solución tamponada de formalina al 4%.</li>
	<li>Fijar los ojos durante 6 h a temperatura ambiente. Nota: La fijación confiere la rigidez de los tejidos y facilita la disección del iris. Tiempo de fijación debe ser probada y ajustada para diferentes aplicaciones.</li>
</ol>6. Iris procedimiento de disección bajo estereoscopio
<ol><li>Retire la solución de fijación del tubo con una pipeta Pasteur plástica de 1,5 mL (o similar) y enjuague el ojo tres veces con PBS fresco.</li>
	<li>Coloque el ojo fijo en una superficie lisa (soporte de disección) con la cámara anterior hacia arriba.</li>
	<li>Con una aguja de 30 G biselado, realizar un punto de entrada posterior al limbus.</li>
	<li>Sostiene el segmento anterior con pequeñas pinzas para atar, inserte una punta de tijeras rectas Clayman Vannas la apertura previamente creada. Nota: Se recomienda controlar el fórceps con la mano no dominante y la tijera con el dominante.</li>
	<li>Mientras gira el ojo con las pinzas para atar, cortar alrededor del limbus para quitar el segmento posterior del ojo. Nota: Realizar cortes parciales permitirá el interior punta de las tijeras para seguir en el tejido y en gran manera facilita el proceso.</li>
	<li>La posición del segmento anterior hacia abajo, exponiendo la lente.</li>
	<li>Retire con cuidado el lente agarrando con pinzas pequeñas y tirando hacia arriba. Nota: Puede utilizarse una aguja biselada para pinchar y tire de la lente.</li>
	<li>Posición del segmento anterior con la córnea hacia abajo y el corte perpendicular al campo de visión.</li>
	<li>Agarra suavemente el tejido posterior al cuerpo ciliar con las pinzas pequeñas de atar.</li>
	<li>Con unas tijeras rectas Clayman Gill-Vannas, proceder a recortar justo anterior del cuerpo ciliar para quitar la malla trabecular y aislar el iris. Confirmar que se ha quitado la malla trabecular; el diafragma debe moverse dentro de la córnea.</li>
	<li>Transferir cuidadosamente el ocular anterior con las pinzas pequeñas de atar, sosteniendo la córnea a una placa de 96 pocillos que contienen 200 μL de PBS.</li>
	<li>Continúe sosteniendo la córnea en el pozo y diseccionar el iris mediante lavado con PBS con una pipeta. Nota: Si el iris sigue siendo adherente a la córnea, algunas red trabecular puede ser presente y el bisel de una aguja de 30 G se puede utilizar para ayudar a desplazar el diafragma.</li>
	<li>Saque la córnea 96-bien con las pinzas pequeñas de atar y mantener el iris aislado en el pozo para su posterior análisis.</li>
	<li>Conservar muestras de diafragma flotante a 4 ° C. Nota: A pesar de ser fijos, no se recomienda almacenamiento a largo plazo de las muestras de diafragma flotante.</li>
</ol>7. posibles lecturas experimentales
<ol><li>Para visualizar los vasos sanguíneos en el iris disecadas, utilizar immunohistochemistry de montaje conjunto flotante coloración métodos para marcadores como molécula de adhesión de células endoteliales plaquetas (PECAM) -1 o proteína B4. Como alternativa, utilizar perfusión de cuerpo entero con manchas vasculares, tales como dextranos marcados con fluorescente de alto peso molecular.</li>
	<li>Utilizar en vivo imágenes no invasivas para realizar en silico plana-montaje y cuantificar vasculatura iris completo con software de imagen apropiado. Nota: Puede cuantificarse vasculatura, tanto en vivo como en vitro, utilizando densitometría o con vasculatura análisis software9.</li>
	<li>Proceso del globo ocular entero para ácidos nucleicos y extracción de proteínas, seguida por métodos de PCR o inmunotransferencia, para llevar a cabo el análisis molecular de los ojos pinchados. Nota: El análisis Molecular de los tejidos se realiza mejor con el tejido no fijado, pero disección de iris no fijos es extremadamente difícil, y el uso del ojo entero ha rendido resultados estadísticamente significativos en anteriores estudios8.</li>
</ol>

<ol>
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Los autores no tienen nada que revelar.

En el presente Protocolo, se presenta un método novedoso para la inducción de la respuesta vascular del iris por punción uveal. La punción desencadena mecanismos curativos de la herida y promueve las respuestas vasculares en el iris10,11. Esto está de acuerdo con las patologías oculares, como el PDR y NVG, donde culminan angiogénicos exacerbado las respuestas de la retina en el segmento posterior del ojo en la condición clínica de rubeosis iridiana, una ...

El iris, junto con el cuerpo ciliar y la coroides, compone de la úvea, que es el tejido más vascularizado del ojo. Vasculatura del diafragma es esencial para mantener la homeostasis en la cámara anterior del ojo. Como resultado de abundantes conexiones anastomóticas entre arterias y venas, los vasos sanguíneos de iris proporcionan nutrientes y suministro de oxígeno no sólo el diafragma sí mismo, sino a todo segmento anterior del ojo1.
La formación de nuevos vasos sanguíneos, o angiogénesis de las ya existentes, es fundamental en los procesos fisiológicos, tales como desarrollo y2de cicatrización. Angiogénesis está finamente reglamentada por multitud de factores canónicos, como factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y el inhibidor del activador del plasminógeno (PAI), así como múltiples factores inflamatorios, y un desequilibrio de estos factores puede llevar a patológica 3de la angiogénesis.
En el ojo, la neovascularización es la causa de enfermedades peligrosas para la vista, como la retinopatía diabética proliferativa (PDR) y el glaucoma neovascular (GNV). En estas enfermedades oculares, la neovascularización focal se encuentra comúnmente en los tejidos de la retinales, sin embargo, el desequilibrio en inflamatorias y factores angiogénicos en ambas las posteriores y anteriores oculares cámaras del ojo se ha asociado con rubeosis iridiana, la término clínico para iris neoangiogenesis patológica4. Estas patologías indican la capacidad del diafragma adulto a angiogénesis. En ratones, vasculatura ocular es inmaduro después del nacimiento y maduración postparto. Esta peculiaridad del desarrollo se explota en el modelo de ratón de la retinopatía inducida por el oxígeno, un modelo que imita muy de cerca la condición clínica de retinopatía de la prematuridad5. Además, Angiogénesis e inflamación juegan un papel fundamental en los mecanismos6de heridas y cicatrización se ha asociado con angiogénesis modelos7.
En este estudio, describimos un modelo del neovascularization del diafragma inducida por la punción. Uveales punciones se realizan cerca del límite exterior del limbus, que inducen neovascularización del iris mediante la activación del sistema de cicatrización. Debido a la transparencia de la córnea, vasculatura del iris puede ser analizado fácilmente en vivo por métodos no invasivos. Pinchado los ojos presentan un aumento del lecho vascular en el iris, que se ha asociado con un aumento de la activación de plasminógeno y marcadores inflamatorios8. El modelo presentado tiene un gran potencial como una nueva herramienta para estudiar la angiogenesis y angiogénicos compuestos de detección y permite la visualización directa en vivo de los procesos angiogénicos.

<table><tbody><tr><td>Bonn eye scissors</td><td>Bausch &amp;amp; Lomb</td><td>23060</td><td></td></tr><tr><td>Clayman-Vannas curved scissors</td><td>Bausch &amp;amp; Lomb</td><td>E3383 C</td><td></td></tr><tr><td>Clayman-Vannas straight scissors</td><td>Bausch &amp;amp; Lomb</td><td>E3383 S</td><td></td></tr><tr><td>Objective adapter for camera</td><td>Handcrafted</td><td>N/A</td><td>Or any system that allows adapting a camera to the microscope</td></tr><tr><td>Heating Pad 100-110 watts</td><td>Non Applicable</td><td>N/A</td><td>Available in pet/veterinarian stores</td></tr><tr><td>Hypodermic 30g beveled needle</td><td>KDM GmBH germany</td><td>911914</td><td></td></tr><tr><td>Iphone 4S</td><td>Apple</td><td>Non Applicable</td><td>Or other high resolution image acquistion device</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>KDG 9623</td><td></td></tr><tr><td>McPherson tying forceps</td><td>Bausch &amp;amp; Lomb</td><td>E1815 S</td><td></td></tr><tr><td>Micro tying forceps</td><td>Bausch &amp;amp; Lomb</td><td>63140</td><td></td></tr><tr><td>Minims tetracaine hydrochloride</td><td>Bausch &amp;amp; Lomb</td><td>N/A</td><td>1 % (w/v) Eye Drops</td></tr><tr><td>Neutral-buffered formalin</td><td>Bioreagens</td><td>0018-40</td><td></td></tr><tr><td>Normal saline solution</td><td>Fresenius Kabi</td><td>210352</td><td>0.9 % (w/v) NaCl in injectable water</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td>Balanced and buffered PBS pH 7.4</td></tr><tr><td>Petri dish 10 cm</td><td>Starstedt</td><td>83.3902</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 3 cm</td><td>Starstedt</td><td>83.3900</td><td></td></tr><tr><td>Safe Seal Tube 2.0 mL</td><td>Starstedt</td><td>72.685.200</td><td>Or any eppendorf style tubes</td></tr><tr><td>TC plate 96-well</td><td>Starstedt</td><td>83.3924</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipette 3.5 mL</td><td>Starstedt</td><td>86.1171</td><td>Or any other Pasteur pipette style</td></tr><tr><td>Univentor 400 anesthesia unit</td><td>Univentor Limited</td><td>N/A</td><td>Or equivalent flow regulator with induction chamber and mask for volatile anesthesia</td></tr><tr><td>Wild M650 surgical microscope</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>N/A</td><td>Or other surgical or magnifying stereoscope</td></tr></tbody></table>

puncture-induced iris neovascularization as a mouse model of rubeosis iridis

Describimos un modelo del neovascularization del diafragma inducida por la punción como un modelo general para la evaluación no invasiva de la angiogénesis. El modelo también es relevante para dirigidos a glaucoma neovascular, una complicación peligrosa para la vista de la retinopatía diabética. Este método se basa en la inducción de la respuesta vascular del iris por una serie de pinchazos uveales autoadhesivos en ratones BALB/c y se aprovecha de la maduración postparto de vasculatura ocular de ratón. Crías de ratón son sometidos a pinchazos uveales de día postnatal 12.5, cuando los cachorros abran los ojos, naturalmente hasta día postnatal 24.5. Debido a la transparencia de la córnea, vasculatura iris puede analizarse fácilmente a través del tiempo por métodos no invasivos en vivo . Además, el diafragma semitransparente de ratones BALB/c puede ser flatmounted para el análisis detallado immunohistologic con tinción de fondo inespecífica mínimo. En este modelo, la angiogénesis es impulsada principalmente por las inflamatorias y sistemas de activación del plasminógeno. El modelo inducida por punción es el primero en inducir neovascularización de iris en pequeños roedores y tiene la ventaja de permitir la directa no invasiva en vivo análisis del proceso angiogénico. Por otra parte, el modelo puede combinarse con sustancias modulación angiogenic, que destaca su potencial en el estudio de la angiogénesis con perspectiva en vivo .

Crías de ratón BALB/c de Albino en P12.5 fueron sometidos a pinchazos uveales, repetidos cada cuarto día (día experimental 0, 4, 8, 12), hasta P24.5. En P27.5, ratones fueron sacrificados e iris cuidadosamente disecado (experimental día 15). Fotos de ojos de ratón fueron tomadas con una cámara adherida a un estereoscopio quirúrgico antes de cada serie de punción cada día experimental para evaluar la evaluación no invasiva de la respuesta vascular del iris. Uveales pinchazos ind...

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Puncture-Induced Iris Neovascularization as a Mouse Model of Rubeosis Iridis

Neovascularization del diafragma, una complicación común de la enfermedad de retina isquémica, puede llevar a glaucoma neovascular avistar-que amenaza. Aquí, describimos un protocolo murino para inducir neovascularización de iris experimental que puede utilizarse para la evaluación no invasiva de las sustancias de modulación de angiogénesis.

Neovascularization del diafragma como un modelo de ratón de iridis del rubeosis inducida por la punción

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant ...

puncture-induced-iris-neovascularization-as-mouse-model-rubeosis

Research

JoVE Journal

Medicine

8.7K vistas.  Karolinska Institutet. Neovascularization del diafragma, una complicación común de la enfermedad de retina isquémica, puede llevar a glaucoma neovascular avistar-que amenaza. Aquí, describimos un protocolo murino para inducir neovascularización de iris experimental que puede utilizarse para la evaluación no invasiva de las sustancias de modulación de angiogénesis.

Video: Puncture-Induced Iris Neovascularization as a Mouse Model of Rubeosis Iridis

A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) research. By administering targeted laser injury to the RPE and Bruch&#8217;s membrane, the procedure induces angiogenesis, modeling the hallmark pathology observed in neovascular AMD. 
First developed in non-human primates, the laser-induced CNV model has come to be implemented into many other species, the most recent of which being the mouse. Mouse experiments are advantageously more cost-effective, experiments can be executed on a much faster timeline, and they allow the use of various transgenic models. The miniature size of the mouse eye, however, poses a particular challenge when performing the procedure. Manipulation of the eye to visualize the retina requires practice of fine dexterity skills as well as simultaneous hand-eye-foot coordination to operate the laser. However, once mastered, the model can be applied to study many aspects of neovascular AMD such as molecular mechanisms, the effect of genetic manipulations, and drug treatment effects. 
The laser-induced CNV model, though useful, is not a perfect model of the disease. The wild-type mouse eye is otherwise healthy, and the chorio-retinal environment does not mimic the pathologic changes in human AMD. Furthermore, injury-induced angiogenesis does not reflect the same pathways as angiogenesis occurring in an age-related and chronic disease state as in AMD.
Despite its shortcomings, the laser-induced CNV model is one of the best methods currently available to study the debilitating pathology of neovascular AMD. Its implementation has led to a deeper understanding of the pathogenesis of AMD, as well as contributing to the development of many of the AMD therapies currently available.

Here, we present the mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) protocol, an experimental model that re-creates the vascular hallmarks of neovascular age-related macular degeneration (AMD). Once mastered, it can reliably and effectively induce CNV as a model system to test various experimental measures.

Un modelo de ratón para inducida por láser neovascularización coroidea

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) ...

Investigación

Medicina

A Mouse Model of Retinal Ischemia-Reperfusion Injury Through Elevation of Intraocular Pressure

Retinal ischemia-reperfusion (I/R) is a pathophysiological process contributing to cellular damage in multiple ocular conditions, including glaucoma, diabetic retinopathy, and retinal vascular occlusions. Rodent models of I/R injury are providing significant insights into mechanisms and treatment strategies for human I/R injury, especially with regard to neurodegenerative damage in the retinal neurovascular unit. Presented here is a protocol for inducing retinal I/R injury in mice through elevation of intraocular pressure (IOP). In this protocol, the ocular anterior chamber is cannulated with a needle, through which flows the drip of an elevated saline reservoir. Using this drip to raise IOP above systolic arterial blood pressure, a practitioner temporarily halts inner retinal blood flow (ischemia). When circulation is reinstated (reperfusion) by removal of the cannula, severe cellular damage ensues, resulting ultimately in retinal neurodegeneration. Recent studies demonstrate inflammation, vascular permeability, and capillary degeneration as additional elements of this model. Compared to alternative retinal I/R methodologies, such as retinal arterial ligation, retinal I/R injury by elevated IOP offers advantages in its&#160;anatomical specificity, experimental tractability, and technical accessibility, presenting itself as a valuable tool for examining neuronal pathogenesis and therapy in the retinal neurovascular unit.

This article describes a procedure for inducing retinal ischemia-reperfusion injury by elevated intraocular pressure in mice. Retinal ischemia-reperfusion injury by elevated intraocular pressure serves to model human pathologies characterized by compromised oxygen and nutrient delivery in the retina, enabling researchers to examine potential cellular mechanisms and treatments for human diseases of the retinal neurovascular unit.

Un modelo murino de isquemia retiniana-reperfusión mediante la elevación de la presión intraocular

Retinal ischemia-reperfusion (I/R) is a pathophysiological process contributing to cellular damage in multiple ocular conditions, including glaucoma, ...

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this protocol, we aim to guide the reader not simply through the technical considerations of generating laser-induced lesions to trigger neovascular processes, but rather focus on the powerful information that can be obtained from multimodal longitudinal in vivo imaging throughout the follow-up period.
The laser-induced mouse CNV model was generated by a diode laser administration. Multimodal in vivo imaging techniques were used to monitor CNV induction, progression and regression. First, spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) was performed immediately after the lasering to verify a break of Bruch&#39;s membrane. Subsequent in vivo imaging using fluorescein angiography (FA) confirmed successful damage of Bruch&#39;s membrane from serial images acquired at the choroidal level. Longitudinal follow-up of CNV proliferation and regression on days 5, 10, and 14 after the lasering was performed using both SD-OCT and FA. Simple and reliable grading of leaky CNV leasions from FA images is&#160;presented. Automated segmentation for measurement of total retinal thickness, combined with manual caliber application for measurement of retinal thickness at CNV sites, allow unbiased evaluation of the presence of edema. Finally, histological verification of CNV is performed using isolectin GS-IB4 staining on choroidal flatmounts. The staining is thresholded, and the isolectin-positive area is calculated with ImageJ.
This protocol is especially useful in therapeutics studies requiring high-throughput-like screening of CNV pathology as it allows fast, multimodal, and reliable classification of CNV pathology and retinal edema. In addition, high resolution SD-OCT enables the recording of other pathological hallmarks, such as the accumulation of subretinal or intraretinal fluid. However, this method does not provide a possibility to automate CNV volume analysis from SD-OCT images, which has to be performed manually.

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Here, we present the usefulness of longitudinal in vivo imaging in the follow-up of morphological changes of laser-induced choroidal neovascularization in mice.

En Vivo La proyección de imagen multimodal y análisis del modelo de neovascularización coroidea inducida por láser Mouse

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this ...

Neurociencias

A Model of Glaucoma Induced by Circumlimbal Suture in Rats and Mice

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known risk factor for glaucoma. This protocol demonstrates a step-by-step guide on this technique in Long Evans rats and C57BL/6 mice. Under general anesthesia, a "purse-string" suture is applied on the conjunctiva, around the equator and behind the limbus of the eye. The fellow eye serves as an untreated control. Over the duration of our study, which was a period of 8 weeks for rats and 12 weeks for mice, IOP remained elevated, as measured regularly by rebound tonometry in conscious animals without topical anesthesia. In both species, the sutured eyes showed electroretinogram features consistent with preferential inner retinal dysfunction. Optical coherence tomography showed selective thinning of the retinal nerve fiber layer. Histology of the rat retina in cross-section found reduced cell density in the ganglion cell layer, but no change in other cellular layers. Staining of flat-mounted mouse retinae with a ganglion cell specific marker (RBPMS) confirmed ganglion cell loss. The circumlimbal suture is a simple, minimally invasive and cost-effective way to induce ocular hypertension that leads to ganglion cell injury in both rats and mice.

Chronic ocular hypertension is induced by applying a circumlimbal suture in rats and mice, leading to functional and structural deterioration of the retinal ganglion cells consistent with glaucoma.

Un modelo de Glaucoma inducido por sutura de Circumlimbal en ratas y ratones

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known ...

Optimization of the Retinal Vein Occlusion Mouse Model to Limit Variability

Mouse models of retinal vein occlusion (RVO) are often used in ophthalmology to study hypoxic-ischemic injury in the neural retina. In this report, a detailed method pointing out critical steps is provided with recommendations for optimization to achieve consistently successful occlusion rates across different genetically modified mouse strains. The RVO mouse model consists primarily of the intravenous administration of a photosensitizer dye followed by laser photocoagulation using a retinal imaging microscope attached to an ophthalmic guided laser. Three variables were identified as determinants of occlusion consistency. By adjusting the wait time after rose bengal administration and balancing the baseline and experimental laser output, the variability across experiments can be limited and a higher success rate of occlusions achieved. This method can be used to study retinal diseases that are characterized by retinal edema and hypoxic-ischemic injury. Additionally, as this model induces vascular injury, it can also be applied to study the neurovasculature, neuronal death, and inflammation.

Here, we describe an optimized protocol for retinal vein occlusion using rose bengal and a laser-guided retinal imaging microscope system with recommendations to maximize its reproducibility in genetically modified strains.

Optimización del modelo de ratón de oclusión de venas retinianas para limitar la variabilidad

Mouse models of retinal vein occlusion (RVO) are often used in ophthalmology to study hypoxic-ischemic injury in the neural retina. In this report, a ...

Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR model induction and its readouts in both mice and rats. Retinal neovascularization is induced in OIR by exposing rodent pups either to hyperoxia (mice) or alternating levels of hyperoxia and hypoxia (rats). The primary readouts of these models are the size of neovascular (NV) and avascular (AVA) areas in the retina. This preclinical in vivo model can be used to evaluate the efficacy of potential anti-angiogenic drugs or to address the role of specific genes in the retinal angiogenesis by using genetically manipulated animals. The model has some strain and vendor specific variation in the OIR induction which should be taken into consideration when designing the experiments.

Oxygen-induced retinopathy (OIR) can be used to model ischemic retinal diseases such as retinopathy of prematurity and proliferative diabetic retinopathy and to serve as a model for proof-of-concept studies in evaluating antiangiogenic drugs for neovascular diseases. OIR induces robust and reproducible neovascularization in the retina that can be quantified.

Modelo de retinopatía inducida por oxígeno para enfermedades retinianas isquémicas en roedores

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...

Quantification of Vascular Parameters in Whole Mount Retinas of Mice with Non-Proliferative and Proliferative Retinopathies

Retinopathies are a heterogeneous group of diseases that affect the neurosensory tissue of the eye. They are characterized by neurodegeneration, gliosis&#160;and a progressive change in vascular function and structure. Although the onset of the retinopathies is characterized by subtle disturbances in visual perception, the modifications in the vascular plexus are the first signs detected by clinicians. The absence or presence of neovascularization determines whether the retinopathy is classified as either non-proliferative (NPDR) or proliferative (PDR). In this sense, several animal models tried to mimic specific vascular features of each stage to determine the underlying mechanisms involved in endothelium alterations, neuronal death and other events taking place in the retina. In this article, we will provide a complete description of the procedures required for the measurement of retinal vascular parameters in adults and early birth mice at postnatal day (P)17. We will detail the protocols to carry out retinal vascular staining with Isolectin GSA-IB4 in whole mounts for later microscopic visualization. Key steps for image processing with Image J Fiji software are also provided, therefore, the readers will be able to measure vessel density, diameter and tortuosity, vascular branching, as well as avascular and neovascular areas. These tools are highly helpful to evaluate and quantify vascular alterations in both non-proliferative and proliferative retinopathies.

This article describes a well-established and reproducible lectin stain assay for the whole mount retinal preparations and the protocols required for the quantitative measurement of vascular parameters frequently altered in proliferative and non-proliferative retinopathies.

Cuantificación de parámetros vasculares en retinas de monte entero de ratones con retinopatías no proliferativas y proliferativas

Retinopathies are a heterogeneous group of diseases that affect the neurosensory tissue of the eye. They are characterized by neurodegeneration, ...

Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic nerve and retinal ganglion cell (RGC) degeneration, resulting in visual dysfunction by interrupting the transmission of visual information from the eye to the brain. Elevated intraocular pressure is the most important risk factor; thus, several models of ocular hypertension have been developed in rodents by either genetic or experimental approaches to investigate the causes and effects of the disease. Among those, some limitations have been reported such as surgical invasiveness, inadequate functional assessment, requirement of extensive training, and highly variable extension of retinal damage. The present work characterizes a simple, low-cost, and efficient method to induce ocular hypertension in rodents, based on low-temperature, full-circle cauterization of the limbal vascular plexus, a major component of aqueous humor drainage. The new model provides a technically easy, noninvasive, and reproducible subacute ocular hypertension, associated with progressive RGC and optic nerve degeneration, and a unique post-operative clinical recovery rate that allows in vivo functional studies by both electrophysiological and behavioral methods.

The goal of this protocol is to characterize a novel model of glaucomatous neurodegeneration based on 360&#176; thermic cauterization of limbal vascular plexus, inducing subacute ocular hypertension.

Cauterización de círculo completo del plexo vascular limbal para el glaucoma inducido quirúrgicamente en roedores

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic ...

<meta charset="utf8"></head><body>Modelo murino de lesión por isquemia-reperfusión retiniana para estudiar patologías retinianas

Induction of Retinal Ischemia-Reperfusion Injury in a Mouse Eye Model

Ischemia-reperfusion injuries are known to cause a range of retinal pathologies, including diabetic retinopathy, glaucoma, retinal vascular occlusions, and other vaso-occlusive conditions. This manuscript presents a method for inducing ischemia-reperfusion injury in a mouse model. The method utilized anterior chamber cannulation attached to a saline reservoir, generating hydrostatic pressure to raise the intraocular pressure to 90-100 mmHg. This method effectively caused constriction of retinal capillaries to induce retinal ischemia. At the end of the ischemic period (60 min), the intraocular pressure was normalized (&#8804;20 mmHg) before removing the cannula from the anterior chamber to initiate reperfusion. Days after the ischemia/reperfusion procedure, the eyes were collected and sectioned for histological staining. The histopathology of the retinal sections was scored by evaluating eight parameters of retinal injury: folds, hemorrhage, deformation, cell loss in the ganglion cell, inner nuclear, outer nuclear, and photoreceptor layers, and damage to retinal pigment epithelial cells. This method provided a reproducible model to study the mechanisms and pathology of retinal ischemia/reperfusion injury. In addition, this model can facilitate the discovery of potential therapeutic targets to treat retinal ischemia/reperfusion injury, advancing the study of retinal pathologies and improving patient outcomes.

<meta charset="utf8"></head><body>Inducción de una lesión por isquemia-reperfusión retiniana en un modelo de ojo de ratón

This protocol models retinal ischemia-reperfusion injury in a mouse eye by inducing retinal ischemia via anterior chamber cannulation and intraocular pressure elevation, followed by intraocular pressure normalization to initiate the reperfusion.

Inducción de una lesión por isquemia-reperfusión retiniana en un modelo de ojo de ratón

Ischemia-reperfusion injuries are known to cause a range of retinal pathologies, including diabetic retinopathy, glaucoma, retinal vascular occlusions, ...

Neovascularization del diafragma como un modelo de ratón de iridis del rubeosis inducida por la punción

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Un modelo de ratón para inducida por láser neovascularización coroidea

Un modelo murino de isquemia retiniana-reperfusión mediante la elevación de la presión intraocular

En Vivo La proyección de imagen multimodal y análisis del modelo de neovascularización coroidea inducida por láser Mouse

Un modelo de Glaucoma inducido por sutura de Circumlimbal en ratas y ratones

Optimización del modelo de ratón de oclusión de venas retinianas para limitar la variabilidad

Modelo de retinopatía inducida por oxígeno para enfermedades retinianas isquémicas en roedores

Cuantificación de parámetros vasculares en retinas de monte entero de ratones con retinopatías no proliferativas y proliferativas

Cauterización de círculo completo del plexo vascular limbal para el glaucoma inducido quirúrgicamente en roedores

Inducción de una lesión por isquemia-reperfusión retiniana en un modelo de ojo de ratón

Inducción de una lesión por isquemia-reperfusión retiniana en un modelo de ojo de ratón