Este trabalho foi apoiado pelo Israel Ministério da ciência, tecnologia e espaço do Comitê o cientista-chefe do Ministério israelense da agricultura (#16-16-0003).

1. Material e condições de crescimento da planta
<ol><li>Sementes de um tabaco (cultivar Samsun) sementes por vaso de 5 cm x 5 cm cheio de médio padrão pot. Coloque os potenciômetros em bandejas. Crescem as plantas em uma sala de crescimento sob condições de dia longo (16/8 h claro/escuro) a uma temperatura constante de 23 ° C. Irrigue com água da torneira até drenos de água da panela.</li>
	<li>Depois de 50±5 dias, inicie tratamentos de Fe na irrigação, de acordo com as concentrações adequadas para o experimento. Por exemplo, usamos uma gama de concentrações de ferro, de 0 a 6 mM, complementado por um quelante de Fe solúvel (Fe EDDHA). Irriga as plantas com a solução adequada a cada dois dias (para evitar desidratação) por 6-8 dias.</li>
</ol>2. preparar as folhas para medição de ferro
Notas: Todos os materiais a ser utilizado devem ser isento de ferro a fim de reduzir o risco de contaminação de ferro. Limpe o pilão duas vezes com solução de HCl de 4% e seque com papel de filtro cada vez antes de usar. Se qualquer material é reutilizado, limpe-o duas vezes com solução de HCl de 4% e seque com papel de filtro.
<ol><li>Separe as folhas do tronco à mão, usando luvas (não utilize qualquer equipamento de metal). Use cerca de 10 g de folhas (peso fresco) para cada amostra. Limpe cada folha com água bidestilada (DDW) usando um frasco do pulverizador. Este passo é importante para evitar a contaminação de Fe.</li>
	<li>Seque as folhas em uma toalha de papel e colocá-los em um saco de papel. Transferi os sacos de papel para um forno a uma temperatura constante de 80 ° C durante 2-3 dias.</li>
	<li>Quando secar, esmaga as folhas em pó usando um almofariz e um pilão e transferência para tubos de plástico estéril 15 mL.</li>
</ol>3. queimar as folhas em cinzas.
Notas: O uso da solução de HCl com pH baixo (perto de 0) destina-se a aumentar a solubilidade de ferro. A lã de rocha é usado para evitar que os gases escapem do frasco durante a queima.
<ol><li>Pese um frasco de cintilação de novo e lacrado 20 mL sem tampa. Observe o valor ou defina o valor como zero utilizando o botão de Tara. Adicione as folhas secas esmagadas (amostra) para o frasco.</li>
	<li>Pesar a amostra e o recipiente e observe o valor. Feche o frasco com lã de rocha.</li>
	<li>Pesar 3 frascos adicionais sem adição de amostras e Observe seus valores. Estes frascos serão usados como controles para avaliar a quantidade de lã de rocha que poderia ter levado a qualquer aumento no peso de amostra.</li>
	<li>Coloque os frascos de amostra e controle em uma fornalha e começar a queimar usando as seguintes etapas de temperatura: temperatura ambiente, o rápido aumento de 425 ° C e, finalmente, a 425° C por 4 horas. Por esta altura, as folhas secas serão transformaram-se em cinzas.</li>
	<li>Deixe-o esfriar amostras até cerca de 100 ° C, mas não abaixo desta temperatura para as seguintes duas etapas evitar a umidade, que pode afetar o peso final da amostra. Usando luvas pesadas, remova as amostras da fornalha com uma pinça, segurando o frasco exteriormente.</li>
	<li>Colocar os frascos em uma superfície plana, remover a lã de rocha e fechar os frascos com as tampas originais.</li>
	<li>Pesar os frascos de 3 controle (ver 3.3) e calcular o seu ganho de peso médio. Se o ganho de peso é igual ou superior a 1% do peso da cinza (consulte a etapa 4.2), usar esse valor como uma estimativa do erro de medição.</li>
</ol>4. preparar as cinzas para medição de ferro
Notas: A concentração final de ferro na amostra inicial é calculada como o peso das cinzas dividido pelo volume de HCl adicionado.
<ol><li>Preparar uma solução de HCl 1 M (4% HCl) adicionando 12,5 mL de uma solução de HCl de 37% a 87,5 mL de DDW (em um frasco plástico ou vidro).</li>
	<li>Pesar um tubo plástico de 15 mL e observe o valor ou defina o valor como zero utilizando o botão de Tara. Transferir as cinzas para o tubo, pesar e observe o valor. Este é o peso das cinzas.</li>
	<li>Adicione 5 mL de 1 M de HCl para as cinzas. Filtrar as cinzas num filtro de 22 µm e adicionar um adicional 5 mL de 1 M de HCl através do mesmo filtro.</li>
	<li>O volume final deve ser de 10 mL. Note que o filtro vai perder parte da solução. Nota: As amostras agora estão prontas para a medição de Fe faby ou pelo método azul da Prússia.</li>
	<li>Faça uma curva de calibração com a concentração de Fe medida por espectrometria atômica e pelo método Prussian blue (ver Figura 4) para cada espécie de planta. Posteriormente, a concentração de Fe pode ser medida pelo método azul prussiano.</li>
</ol>5. medir a concentração de Fe por faby
<ol><li>Remova 4 mL de cada amostra para medição por faby.</li>
	<li>Divida os resultados obtidos com a medição de faby pelo peso das cinzas. Divida o valor resultante por 0,01 (porque as cinzas foram solubilizadas em 10 mL). O valor resultante é a concentração de ferro por grama cinza (ppm).</li>
</ol>6. preparar a solução de coloração azul da Prússia
<ol><li>Preparar um 4% solução Prussian blue adicionando 4 g de K4Fe(CN)6 a 100 mL DDW e vortex (outros volumes e/ou concentrações podem ser usadas para diferentes demandas). Note-se que neste estudo, um menos Prussian blue solução concentrada do que o utilizado anteriormente relatados (20%)14 .</li>
	<li>Manter a solução no escuro a 4 ° C até o uso. A solução é estável por 6 meses quando armazenado em tais condições.</li>
</ol>7. gerando uma curva de calibração para o método azul da Prússia, usando resultados de faby
Nota: Calcular a concentração de ferro nas cinzas usando a seguinte fórmula <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57408/57408eq1.jpg">Equação 1 C: concentração, v: volume de amostra, w: peso das cinzas (g).
<ol><li>Misture a 0,50 mL de solução de azul prussiano e 0,50 mL de 1 M de HCl. Isto servirá como solução em branco.</li>
	<li>Misturar 0,5 mL da amostra (cinzas em 4% HCl, conforme descrito na seção 3) e 0,5 mL de solução de azul prussiano (etapa 6.1) por pipetagem. Espere pelo menos 1 minuto, mas não mais de 5 minutos. Após 5 minutos, vai ocorrer sedimentação nas amostras.</li>
	<li>Transfira a mistura para uma cubeta e medir a D.O. a 715 nm, utilizando um espectrofotômetro. Observe o valor.</li>
	<li>Divida o valor de OD (passo 7.3) pelo peso das cinzas (passo 3.2) da amostra. O resultado representa OD por grama de cinzas.</li>
	<li>Plotar a regressão linear entre as concentrações de ferro obtidos a partir das medições de faby (eixo Y) e os valores de OD (eixo X). Use os resultados obtidos nas etapas 5.2 e 7,4. Calcular a fórmula de regressão, Y = a + bX, onde Y representa a concentração de ferro, um representa a absorvância se cruzam, b representa a inclinação de absorvância e X representa o OD.</li>
</ol>8. usando o método azul da Prússia para determinar os níveis de ferro em outras amostras do mesmo tipo de planta
Notas: Uma vez que já foi estabelecida uma curva de calibração para este tipo de planta, concentração de ferro em qualquer novas amostras do mesmo tipo de planta pode ser diretamente calculada usando a fórmula de regressão linear.
<ol><li>Execute as etapas nas seções 3 e 4, seguido por etapas 7.1 a 7.4.</li>
	<li>Calcule a concentração de ferro em solução usando a fórmula obtida a regressão linear (passo 7.5).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kobayashi, T., Nishizawa, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+uptake,+translocation,+and+regulation+in+higher+plants.">Iron uptake, translocation, and regulation in higher plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 63 (1), 131-152 (2012).</li><li>Bradley, J. M., Le Brun, N. E., Moore, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferritins:+Furnishing+proteins+with+iron.">Ferritins: Furnishing proteins with iron.</a> Journal of Biological Inorganic Chemistry. 21 (1), 13-28 (2012).</li><li>Zieli&#324;ska-Dawidziak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+ferritin+-+a+source+of+iron+to+prevent+its+deficiency.">Plant ferritin - a source of iron to prevent its deficiency.</a> Nutrients. 7 (2), 1184-1201 (2015).</li><li>Johnson, D. C., Dean, D. R., Smith, A. D., Johnson, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+formation+of+biological+iron-sulfur+clusters.">Structure, function, and formation of biological iron-sulfur clusters.</a> Annual Review of Biochemistry. 74 (1), 247-281 (2015).</li><li>Guo, H., Barnard, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+iron+oxide+nanoparticles:+morphology,+surface+chemistry+and+environmental+stability.">Naturally occurring iron oxide nanoparticles: morphology, surface chemistry and environmental stability.</a> Journal of Materials Chemistry A. 1 (1), 27-42 (2013).</li><li>Hem, J. D., Cropper, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+of+iron+in+natural+water.">Chemistry of iron in natural water.</a> Report US Geological Survey. , 1-31 (1962).</li><li>Rout, G. R., Sahoo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+iron+in+plant+growth+and+metabolism.">Role of iron in plant growth and metabolism.</a> Reviews in Agricultural Science. 3, 1-24 (2015).</li><li>Speretto, R. A., Ricachenevsky, F. K., Stein, R. J., de Abreu Waldow, V., Fett, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+stress+in+plants+Dealing+with+deprivation+and+overload.">Iron stress in plants Dealing with deprivation and overload.</a> Plant Stress. 4, 57-69 (2010).</li><li>Tautkus, S., Steponeniene, L., Kazlauskas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+iron+in+natural+and+mineral+waters+by+flame+atomic+absorption+spectrometry.">Determination of iron in natural and mineral waters by flame atomic absorption spectrometry.</a> Journal of the Serbian Chemical Society. 69 (5), 393-402 (2006).</li><li>Braunschweig, J., Bosch, J., Heister, K., Kuebeck, C., Meckenstock, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reevaluation+of+colorimetric+iron+determination+methods+commonly+used+in+geomicrobiology.">Reevaluation of colorimetric iron determination methods commonly used in geomicrobiology.</a> Journal of Microbiological Methods. 89 (1), 41-48 (2012).</li><li>PerkinElmer. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Atomic Spectroscopy - Guide to Selecting the Appropriate Technique and System. 16, (2011).</li><li>Wachasunder, S. D., Nafade, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+and+accuracy+control+in+the+determination+of+heavy+metals+by+atomic+absorption+spectrometry.">Precision and accuracy control in the determination of heavy metals by atomic absorption spectrometry.</a> Science. 58, 517-528 (2001).</li><li>Woods, J. T., Mellon, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiocyanate+method+for+iron.+A+spectrophotometric+study.">Thiocyanate method for iron. A spectrophotometric study.</a> Industrial &amp; Engineering Chemistry Analytical Edition. 13 (8), 551-554 (1941).</li><li>Perls, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nachweis+von+Eisenoxyd+in+gewissen+Pigmenten.">Nachweis von Eisenoxyd in gewissen Pigmenten.</a> Virchows Archiv Fur Pathologische Anatomie Und Physiologie Und Fur Klinische Medizin. 39 (1), 42-48 (1867).</li><li>Connorton, J. M., Jones, E. R., Rodriguez-Ramiro, I., Fairweather-Tait, S., Uauy, C., Balk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altering+expression+of+a+vacuolar+iron+transporter+doubles+iron+content+in+white+wheat+flour.">Altering expression of a vacuolar iron transporter doubles iron content in white wheat flour.</a> bioRxiv. , 1-25 (2017).</li><li>de la Fuente, V., Rufo, L., Rodr&#237;guez, N., Franco, A., Amils, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+iron+localization+in+wild+plants+and+hydroponic+cultures+of+Imperata+cylindrica+(L.)+P.+Beauv.">Comparison of iron localization in wild plants and hydroponic cultures of Imperata cylindrica (L.) P. Beauv.</a> Plant Soil. 418 (1-2), 25-35 (2017).</li><li>Hsiao, P. Y., Cheng, C. P., Koh, K. W., Chan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+defensin+gene,+AtPDF1.1,+mediates+defence+against+Pectobacterium+carotovorum+subsp.+carotovorum+via+an+iron-withholding+defence+system.">The Arabidopsis defensin gene, AtPDF1.1, mediates defence against Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum via an iron-withholding defence system.</a> Science Reports. 7 (1), 1-14 (2017).</li><li>Johnson, D. B., Kanao, T., Hedrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+transformations+of+iron+at+extremely+low+pH:+Fundamental+and+applied+aspects.">Redox transformations of iron at extremely low pH: Fundamental and applied aspects.</a> Frontiers in Microbiology. 3, 1-13 (2012).</li><li>Stumm, W., Lee, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygenation+of+ferrous+iron.">Oxygenation of ferrous iron.</a> Industrial &amp; Engineering Chemistry. 53 (2), 143-146 (1961).</li><li>Jones, A. M., Griffin, P. J., Collins, R. N., Waite, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferrous+iron+oxidation+under+acidic+conditions+-+The+effect+of+ferric+oxide+surfaces.">Ferrous iron oxidation under acidic conditions - The effect of ferric oxide surfaces.</a> Geochimica et Cosmochimica Acta. 145, 1-12 (2014).</li><li>Hawkesworth, C. J., Kemp, A. I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+continental+crust.">Evolution of the continental crust.</a> Nature. 443 (7113), (2006).</li><li>Thompson, L. M., Louis, M., Troeh, F. R., Thompson, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Soils and soil fertility. , (1973).</li><li>Krueger, B. J., Grassian, V. H., Cowin, J. P., Laskin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+chemistry+of+individual+mineral+dust+particles+from+different+dust+source+regions:+The+importance+of+particle+mineralogy.">Heterogeneous chemistry of individual mineral dust particles from different dust source regions: The importance of particle mineralogy.</a> Atmospheric Environment. 38 (36), 6253-6261 (2004).</li><li>Bewick, V., Cheek, L., Ball, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistics+review+7:+Correlation+and+regression.">Statistics review 7: Correlation and regression.</a> Journal of Critical Care. 7 (6), 451-459 (2003).</li><li>Asuero, A. G., Sayago, A., Gonz&#225;lez, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+correlation+coefficient:+An+overview.">The correlation coefficient: An overview.</a> Critical Reviews in Analytical Chemistry. 36 (1), 41-59 (2006).</li><li>. Analytical Chemistry. Calibration Curves Available from: <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10188/calibration-curves">https://www.jove.com/science-education/10188/calibration-curves</a> (2018)</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Medição de ferro nos tecidos da planta é muito importante para avaliar os efeitos da irrigação ou outras condições ambientais. Aqui, descrevemos um método colorimétrico fácil e preciso para a medição de conteúdo Fe em folhas de tabaco, que podem ser facilmente adaptados para outras espécies de plantas e tecidos.
Na otimização de condições para o método colorimétrico, usamos um médio baixo pH (pH < 1.0) para permitir que a solubilidade de ferro. O processo de gravação foi...

Ferro (Fe) é um micronutriente importante em todos os organismos vivos. Em plantas, é um micronutriente essencial1 por causa de seu envolvimento em processos básicos, tais como respiração, fotossíntese e a clorofila biossíntese. Alta acumulação de íons de ferro livre é prejudicial às células devido a reações, levando à liberação de radicais livres, causando estresse oxidativo vegetais. Para manter a homeostase de ferro dentro da célula vegetal, íons são armazenadas em vacúolos e sequestrados dentro ferritins, gaiolas de proteína diretamente envolvidas na homeostase de ferro2 e a estrutura de armazenamento principal de ferro em todos os organismos vivos. Ao mesmo tempo, a anemia por deficiência de ferro afeta uma proporção significativa da população humana, resultando em uma crescente necessidade de planta Fe biofortificação. Devido as propriedades únicas de ferritina de planta, enriquecimento de alimentos com ferro-ferritina oferece uma promissora estratégia para combater este problema de desnutrição de3.
Íons de ferro são principalmente encontrados em dois Estados de oxidação, ou seja, o ferrosos (divalentes Fe2 + ou ferro (II)) e férrico (trivalente Fe3 + ou ferro (III)) formas. Várias outras formas de ferro, tais como aglomerados de ferro4, também são encontradas nas células. Fe é armazenado como óxido de ferro dentro da célula e, naturalmente, hematita formas (Fe2O3) e ferryhidrites ((Fe3 +)2O30,5 H2O) sob condições fisiológicas5. Os hidróxidos formados nessas reacções, especialmente o formulário férrico, têm muito baixa solubilidade. Retenção de ferro é consequentemente afetada pelo pH da solução e é em grande parte em um estado sólido acima de pH 56.
Considerando o pobre solubilidade e alta reatividade de Fe, sua transferência entre tecidos vegetais e órgãos deve ser associada com moléculas quelantes apropriadas. Além disso, seus Estados de redox entre os formulários ferroso e férrico1 devem ser controlados. Dentro de folhas, cerca de 80% do ferro é encontrado nas células fotossintéticas, devido à suas funções essenciais no sistema de transporte de elétrons, na biossíntese de citocromos, clorofila e outras moléculas de heme e na formação de Fe-S7de clusters. No caso de ferro em excesso dentro da célula, o excedente é translocado para o vacúolo, onde o metal é armazenado em moléculas de ferritina8.
Ferro pode ser medido em tecidos vegetais por vários métodos, incluindo chama absorção atômica espectroscopia9 (faby) ou ensaios colorimétricos10, o primeiro sendo muito mais precisos do que o último. Faby é uma técnica de alta precisa que permite que se determine a composição elementar de uma amostra com base a emissão eletromagnética dos elementos individuais. Faby converte íons metálicos para Estados atômicos, flama-aquecimento da amostra, levando a excitação do íon e a emissão de um comprimento de onda específico quando um determinado íon retorna ao seu estado fundamental. As emissões de íons de diferentes são separadas por um monocromador e detectadas por um sensor de absorção11. Faby, portanto, serve para quantificar diretamente as concentrações de ferro. Outras técnicas para a visualização de ferro nos tecidos biológicos são, no entanto, disponíveis. Espectroscopia de massa de plasma indutivamente acoplado (ICP-MS)12 é uma técnica muito precisa para medição de ferro e outros oligoelementos, mas a falta de equipamento, tanto para faby e ICP-MS, é um problema comum. Por outro lado, a medição de ferro por tiocianato colorimetria13 carece de precisão e falha detectar pequenas variações entre as amostras. Prussian blue coloração14,15,16,17 é um método indireto baseado na reação de férrico de ferrocianeto de potássio (K4Fe(CN)6) com cátions Fe, produzindo um cor azul forte e é utilizado para detecção qualitativa de ferro em cortes histológicos de tecidos animais e vegetais.
Ferro metálico (zero-valente) é raro na litosfera. A forma iônica não-complexado dominante de ferro no ambiente é ditada principalmente pela quantidade de oxigênio na atmosfera, com ferro ferroso, sendo relativamente mais abundantes em ambientes anóxica e ferro férrico, predominando em sites aeróbios. Esta última forma é também dominante em ambientes extremamente ácidas, embora os agentes causadores da oxidação de ferro ferroso diferem frequentemente em ambiente anóxico e ácido18. Quando o ferro é solubilizado em 4% HCl (pH 0) em um ambiente aeróbio, a maior parte do ferro diluído existe como forma a férrico (Fe3 +)19,20.
As reações entre íons de Fe e K4Fe(CN)6 são como segue:
Fe3 +: FeCl3 + K4Fe(CN)6 = KFe(III)Fe(II)(CN)6¯ + 3KCl
Fe2 +: 4 FeCl2 + K 24Fe(CN)6 =4(Fe(CN)6) de Fe2 + 8 KCl
No presente estudo, perguntamos se a coloração azul prussiano pode ser útil para medir os níveis de ferro na solução.
Inicialmente, verificamos que a correlação entre a concentração de Fe em solução aquosa e coloração azul prussiano. A concentração de Fe (como FeCl2, FeCl3 ou uma mistura de 1:1 dos dois) em soluções aquosas foi medida por espectroscopia atômica e pela absorvância (OD) após a adição de azul da Prússia. A Figura 1 mostra as curvas de regressão linear para as medições obtidas por cada método. Concluímos que o método Prussian blue pode ser usado para análise quantitativa da concentração de ferro na solução.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57408/57408fig1.jpg"> Figura 1: regressões lineares entre concentração de Fe medido por faby e absorbância de luz (OD, 715 nm) obtidos pelo método Prussian blue. Os quadrados azuis e linha representam a solução de Fe2 + , os quadrados vermelhos e linha representam a solução de Fe3 + e os quadrados pretos e linha representam uma mistura 1:1 entre Fe2 + e Fe3 +. Obtiveram-se as regressões a seguintes: [Fe2 +] = 3 + 123 x OD, r = 0.996, R2 = 0.989; [Fe3 +] = 1 + 292 OD x, r = 0.999, R2 = 0.997; e [Fe2 + 3 +] = 11 + 146 x OD, r = 0.983, R2 = 0.956. O Fe2 + doador era FeCl2 e o Fe3 + doador era FeCl3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57408/57408fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Para adaptar o método colorimétrico azul prussiano para análise quantitativa do ferro de tecidos vegetais, o teor de ferro de cinzas de folhas de tabaco foi medido por espectroscopia atômica de absorção de chama e coloração azul prussiano. Houve boa correlação entre os resultados pelas duas técnicas.

<table><tbody><tr><td>Potassium Hexacyanoferrate(II)</td><td>Fisher Chemical</td><td>14459-95-1</td><td>Reagent for the Pussian Blue</td></tr><tr><td>Millex Syringe Filter Unit, Vial Vent 0.22 &amp;mu;m</td><td>Millec</td><td>SLGP033RS</td><td>Filter used to filter the ashes + 4% HCl Solution</td></tr><tr><td>Scintillation Vials</td><td>Fisherbrand</td><td>03-337-4</td><td>Used to keep the dry powdered plant material during the burning procedure.</td></tr><tr><td>Disposable Syringe 10 ml</td><td>Medi-Plus</td><td>1931</td><td>Syringe used during the filtration</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>231-595-7</td><td>Used in the 4% HCl solution to dilute the ashes and clean the materials</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Tobacco, Nicotiana tabacum&lt;/em&gt; cv. Samsun NN</td><td>Obtained from Prof. Simon Barak and routinely used in the Zaccai Lab</td><td>Barak S, Nejidat A, Heimer Y, Volokita M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of the glycolate oxidase gene in tobacco seedlings. Plant Molecular Biology. 2001 Mar 1;45(4):399-407.</td><td>Tobacco cultivar used in this protocol</td></tr><tr><td>Glass Wool (Rock Wool)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>659997-17-3</td><td>Used in the procedure of burning samples in the furnace.</td></tr></tbody></table>

a colorimetric method for measuring iron content in plants

Ferro, dentre os mais importantes micronutrientes em organismos vivos, está envolvido em processos básicos, tais como a respiração e a fotossíntese. Teor de ferro é bastante baixo em todos os organismos, que se elevam em plantas para cerca de 0,009% do peso seco. Até à data, um dos métodos mais precisos para medir a concentração de ferro nos tecidos da planta é chama espectroscopia de absorção atômica. No entanto, esta abordagem é demorado e caro e requer equipamento específico não comumente encontrado em laboratórios da planta. Portanto, um método mais simples, mas preciso que pode ser usado rotineiramente é necessária. O método colorimétrico do azul da Prússia é usado regularmente para ferro qualitativo em cortes histológicos animais e vegetais de coloração. Neste estudo, adaptamos o método para medições quantitativas de ferro no tabaco deixa o azul da Prússia. Nós validado a precisão deste método usando espectroscopia atômica e azul da Prússia coloração para medir o teor de ferro nas mesmas amostras e encontrou uma regressão linear (R2 = 0.988) entre os dois processos. Concluímos que o método azul da Prússia para medição quantitativa de ferro nos tecidos da planta é preciso, simples e barato. No entanto, a regressão linear apresentada aqui pode não ser apropriada para outras espécies de plantas, devido a possíveis interações entre a amostra e o reagente. Estabelecimento de uma curva de regressão, portanto, é necessária para diferentes espécies de plantas.

Quando este protocolo é realizado corretamente, um deve ficar excelente correlação entre os resultados obtidos com os métodos de espectroscopia atômica e azul prussiano. Portanto, o método Prussian blue pode ser facilmente usado para obter uma medição precisa da concentração de ferro em amostras de plantas, como refletido no seguinte experimento.
Plantas de tabaco foram cultivadas, conforme descrito no protocolo e irri...

Watch this Scientific Journal Video about A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants at JoVE.com

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Um método colorimétrico para medir o teor de ferro nas plantas

Apresentamos um protocolo simples e confiável para medir o teor de ferro em tecidos vegetais usando o método colorimétrico do azul da Prússia.

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

a-colorimetric-method-for-measuring-iron-content-in-plants

Research

JoVE Journal

Biochemistry

21.9K visualizações.  Ben-Gurion University of the Negev. Apresentamos um protocolo simples e confiável para medir o teor de ferro em tecidos vegetais usando o método colorimétrico do azul da Prússia.

Vídeo: A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

RGB and Spectral Root Imaging for Plant Phenotyping and Physiological Research: Experimental Setup and Imaging Protocols

Better understanding of plant root dynamics is essential to improve resource use efficiency of agricultural systems and increase the resistance of crop cultivars against environmental stresses. An experimental protocol is presented for RGB and hyperspectral imaging of root systems. The approach uses rhizoboxes where plants grow in natural soil over a longer time to observe fully developed root systems. Experimental settings are exemplified for assessing rhizobox plants under water stress and studying the role of roots. An RGB imaging setup is described for cheap and quick quantification of root development over time. Hyperspectral imaging improves root segmentation from the soil background compared to RGB color based thresholding. The particular strength of hyperspectral imaging is the acquisition of chemometric information on the root-soil system for functional understanding. This is demonstrated with high resolution water content mapping. Spectral imaging however is more complex in image acquisition, processing and analysis compared to the RGB approach. A combination of both methods can optimize a comprehensive assessment of the root system. Application examples integrating root and aboveground traits are given for the context of plant phenotyping and plant physiological research. Further improvement of root imaging can be obtained by optimizing RGB image quality with better illumination using different light sources and by extension of image analysis methods to infer on root zone properties from spectral data.

An experimental protocol is presented for assessment of soil grown plant root systems with RGB and hyperspectral imaging. Combination of RGB image time series with chemometric information from hyperspectral scans optimizes insights into plant root dynamics.

RGB e raiz Spectral Imaging para fenotipagem de planta e pesquisa fisiológica: instalação Experimental imagem e protocolos

Better understanding of plant root dynamics is essential to improve resource use efficiency of agricultural systems and increase the resistance of crop ...

Ambiente

Quantifying Plant Soluble Protein and Digestible Carbohydrate Content, Using Corn (Zea mays) As an Exemplar

Elemental data are commonly used to infer plant quality as a resource to herbivores. However, the ubiquity of carbon in biomolecules, the presence of nitrogen-containing plant defensive compounds, and variation in species-specific correlations between nitrogen and plant protein content all limit the accuracy of these inferences. Additionally, research focused on plant and/or herbivore physiology require a level of accuracy that is not achieved using generalized correlations. The methods presented here offer researchers a clear and rapid protocol for directly measuring plant soluble proteins and digestible carbohydrates, the two plant macronutrients most closely tied to animal physiological performance. The protocols combine well characterized colorimetric assays with optimized plant-specific digestion steps to provide precise and reproducible results. Our analyses of different sweet corn tissues show that these assays have the sensitivity to detect variation in plant soluble protein and digestible carbohydrate content across multiple spatial scales. These include between-plant differences across growing regions and plant species or varieties, as well as within-plant differences in tissue type and even positional differences within the same tissue. Combining soluble protein and digestible carbohydrate content with elemental data also has the potential to provide new opportunities in plant biology to connect plant mineral nutrition with plant physiological processes. These analyses also help generate the soluble protein and digestible carbohydrate data needed to study nutritional ecology, plant-herbivore interactions and food-web dynamics, which will in turn enhance physiology and ecological research.

Quantifying Plant Soluble Protein and Digestible Carbohydrate Content, Using Corn Zea mays As an Exemplar

The protocols described herein provide a clear and approachable methodology for measuring soluble protein and digestible (non-structural) carbohydrate content in plant tissues. The ability to quantify these two plant macronutrients has significant implications for advancing the fields of plant physiology, nutritional ecology, plant-herbivore interactions and food-web ecology.

Quantificação de proteínas solúveis vegetais e carboidratos digeríveis conteúdo, usando o milho (Zea mays) como um Exemplar

Elemental data are commonly used to infer plant quality as a resource to herbivores. However, the ubiquity of carbon in biomolecules, the presence of ...

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III))

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative conditions. Excessive iron results in free redox-active Fe(II) and can cause devastating effects within the cell like oxidative stress (OS) and death by lipid peroxidation known as ferroptosis (FPT). Therefore, quantitative measurements of ferrous (Fe(II)) and ferric (Fe(III)) iron rather than total Fe-determination is the key for closer insight into these detrimental processes. Since Fe(II)/(III) determinations can be hampered by fast redox-state shifts and low concentrations in relevant samples, like cerebrospinal fluid (CSF), methods should be available that analyze quickly and provide low limits of quantification (LOQ). Capillary electrophoresis (CE) offers the advantage of fast Fe(II)/Fe(III) separation and works without a stationary phase, which could interfere with the redox balance or cause analyte sticking. CE combined with inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) as a detector offers further improvement of detection sensitivity and selectivity. The presented method uses 20 mM HCl as a background electrolyte and a voltage of +25 kV. Peak shapes and concentration detection limits are improved by conductivity-pH-stacking. For reduction of 56[ArO]+, ICP-MS was operated in the dynamic reaction cell (DRC) mode with NH3 as a reaction gas. The method achieves a limit of detection (LOD) of 3 &#181;g/L. Due to stacking, higher injection volumes were possible without hampering separation but improving LOD. Calibrations related to peak area were linear up to 150 &#181;g/L. Measurement precision was 2.2% (Fe(III)) to 3.5% (Fe(II)). Migration time precision was &#60;3% for both species, determined in 1:2 diluted lysates of human neuroblastoma (SH-SY5Y) cells. Recovery experiments with standard addition revealed accuracy of 97% Fe(III) and 105 % Fe(II). In real-life bio-samples like CSF, migration time can vary according to varying conductivity (i.e., salinity). Thus, peak identification is confirmed by standard addition.

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry CE-ICP-MS for Quantification of Iron Redox Species FeII, FeIII

This iron redox speciation method is based on capillary electrophoresis-inductively coupled plasma mass spectrometry with sample stacking combined with short analysis in one run. The method quickly analyzes and provides low limits of quantification for iron redox species across a diverse range of tissues and biofluid samples.

Configuração da Espectrometria de Massa de Plasma Acoplada de Eletroforese Capilar (CE-ICP-MS) para quantificação de espécies de redox de ferro (Fe(II), Fe(III))

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative ...

Química

<meta charset="utf8"></head><body>Ensaio fluorescente para detecção de novos quelantes de ferro

Quantifiable and Inexpensive Cell-Free Fluorescent Method to Confirm the Ability of Novel Compounds to Chelate Iron

Cancer cells require large amounts of iron to maintain their proliferation. Iron metabolism is considered a hallmark of cancer, making iron a valid target for anti-cancer approaches. The development of novel compounds and the identification of leads for further modification requires that proof of mechanism assays be carried out. There are many assays to evaluate the impact on proliferation; however, the ability to chelate iron is an important and sometimes overlooked end-point measure due to the high costs of equipment and the challenge to quickly and reproducibly quantify the strength of chelation. Here, we describe a quantifiable and inexpensive cell-free fluorescent method to confirm the ability of novel compounds to chelate iron. Our assay relies on the commercially available inexpensive fluorescent dye Calcein, whose fluorescence can be quantified on most fluorescent microtiter plate readers. Calcein is a weak iron chelator, and its fluorescence is quenched when it binds Fe2+/3+; fluorescence is restored when a novel chelator outcompetes Calcein for bound Fe2+/3+. The removal of fluorescent quenching and the resulting increase in fluorescence allows the chelation ability of a novel putative chelator to be determined. Therefore, we offer an inexpensive, high-throughput assay that allows the rapid screening of novel candidate chelator compounds.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: avaliando o impacto de novos quelantes de ferro no metabolismo das células cancerígenas

We describe a fluorescent assay that can quickly and inexpensively confirm the ability of novel compounds to chelate iron. The assay measures the ability of compounds to outcompete the iron binding activity of the weak iron chelating fluorescent probe Calcein, resulting in a quantifiable increase in fluorescence when chelation occurs.

Método fluorescente sem células quantificável e barato para confirmar a capacidade de novos compostos de quelar ferro 

Cancer cells require large amounts of iron to maintain their proliferation. Iron metabolism is considered a hallmark of cancer, making iron a valid target ...

Pesquisa do câncer

Measurement of Tissue Non-Heme Iron Content using a Bathophenanthroline-Based Colorimetric Assay

Iron is an essential micronutrient. Both iron overload and deficiency are highly detrimental to humans, and tissue iron levels are finely regulated. The use of experimental animal models of iron overload or deficiency has been instrumental to advance knowledge of the mechanisms involved in the systemic and cellular regulation of iron homeostasis. The measurement of total iron levels in animal tissues is commonly performed with atomic absorption spectroscopy or with a colorimetric assay based on the reaction of non-heme iron with a bathophenanthroline reagent. For many years, the colorimetric assay has been used for the measurement of the non-heme iron content in a wide range of animal tissues. Unlike atomic absorption spectroscopy, it excludes the contribution of heme iron derived from hemoglobin contained in red blood cells. Moreover, it does not require sophisticated analytical skills or highly expensive equipment, and can thus be easily implemented in most laboratories. Finally, the colorimetric assay can be either cuvette-based or adapted to a microplate format, allowing higher sample throughput. The present work provides a well-established protocol that is suited for the detection of alterations in tissue iron levels in a variety of experimental animal models of iron overload or iron deficiency.

Here, a protocol for the measurement of the non-heme iron content in animal tissues is provided, using a simple, well-established colorimetric assay that can be easily implemented in most laboratories.

Medição do teor de ferro não-heme do tecido usando um ensaio colorimétrico baseado em banhontrolina

Iron is an essential micronutrient. Both iron overload and deficiency are highly detrimental to humans, and tissue iron levels are finely regulated. The ...

Medicina

Quantitating Iron Transport Across the Mouse Placenta In Vivo Using Nonradioactive Iron Isotopes

Iron is essential for maternal and fetal health during pregnancy, with approximately 1 g of iron needed in humans to sustain a healthy pregnancy. Fetal iron endowment is entirely dependent on iron transfer across the placenta, and perturbations of this transfer can lead to adverse pregnancy outcomes. In mice, measurement of iron fluxes across the placenta traditionally relied on radioactive iron isotopes, a highly sensitive but burdensome approach. Stable iron isotopes (57Fe and 58Fe) offer a nonradioactive alternative for use in human pregnancy studies.
Under physiological conditions, transferrin-bound iron is the predominant form of iron taken up by the placenta. Thus, 58Fe-transferrin was prepared and injected intravenously in pregnant dams to directly assess placental iron transport and bypass maternal intestinal iron absorption as a confounding variable. Isotopic iron was quantitated in the placenta and mouse embryonic tissues by inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS). These methods can also be employed in other animal model systems of physiology or disease to quantify in vivo iron dynamics.

Quantitating Iron Transport Across the Mouse Placenta In Vivo Using Nonradioactive Iron Isotopes

This article demonstrates how to prepare and administer transferrin-bound nonradioactive isotopic iron for studies of iron transport in mouse pregnancy. The approach for quantifying isotopic iron in fetoplacental compartments is also described.

Quantificando o transporte de ferro através da placenta de camundongo in vivo usando isótopos de ferro não radioativos

Iron is essential for maternal and fetal health during pregnancy, with approximately 1 g of iron needed in humans to sustain a healthy pregnancy. Fetal ...

Biologia

The Caco-2 Cell Bioassay for Measurement of Food Iron Bioavailability

Knowledge of Fe bioavailability is critical to the assessment of the nutritional quality of Fe in foods. In vivo measurement of Fe bioavailability is limited by cost, throughput, and the caveats inherent to isotopic labeling of the food Fe. Thus, there exists a critical need for an approach that is high-throughput and cost-effective. The Caco-2 cell bioassay was developed to satisfy this need. The Caco-2 cell bioassay for Fe bioavailability utilizes simulated gastric and intestinal digestion coupled with culture of a human intestinal epithelial cell line known as Caco-2. In Caco-2 cells, Fe uptake stimulates the intracellular formation of ferritin, an Fe storage protein easily measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Ferritin forms in proportion to Fe uptake; thus, by measuring Caco-2 cell ferritin production, one can assess intestinal Fe uptake from simulated food digests into the enterocyte. 
Via this approach, the model replicates the key initial step that determines food Fe bioavailability. Since its inception in 1998, this model approach has been rigorously compared to factors known to influence human Fe bioavailability. Moreover, it has been applied in parallel studies, with three human efficacy studies evaluating Fe biofortified crops. In all cases, the bioassay correctly predicted the relative amounts of Fe bioavailability from the factors, crops, and overall diet. This paper provides detailed methods on Caco-2 cell culture coupled with the in vitro digestion process and cell ferritin ELISA necessary to conduct the Caco-2 cell bioassay for Fe bioavailability.

The Caco-2 cell bioassay for iron (Fe) bioavailability represents a cost-effective and versatile approach to assess Fe bioavailability from foods, food products, supplements, meals, and even diet regimens. Thoroughly validated to human studies, it represents the state of the art for studies of Fe bioavailability.

O Bioensaio celular Caco-2 para Medição da Biodisponibilidade de Ferro Alimentar

Knowledge of Fe bioavailability is critical to the assessment of the nutritional quality of Fe in foods. In vivo measurement of Fe bioavailability is ...

Introduction to Mass Spectrometry

Source: Laboratory of Dr. Khuloud Al-Jamal - King&#39;s College London

Mass spectrometry is an analytical chemistry technique that enables the identification of unknown compounds within a sample, the quantification of known materials, the determination of the structure, and chemical properties of different molecules.
A mass spectrometer is composed of an ionization source, an analyzer,&#160;and a detector. The process involves the ionization of chemical compounds to generate ions. When using inductively coupled plasma (ICP), samples containing elements of interest are introduced into argon plasma as aerosol droplets. The plasma dries the aerosol, dissociates the molecules, and then removes an electron from the components to be detected by the mass spectrometer. Other ionization methods such as electrospray ionization (ESI) and matrix assisted laser desorption ionization (MALDI) are used to analyze biological samples. Following the ionization procedure, ions are separated in the mass spectrometer according to their mass-to-charge ratio (m/z), and the relative abundance of each ion type is measured. Finally, the detector commonly consists in an electron multiplier where the collision of ions with a charged anode leads to a cascade of increasing number of electrons, which can be detected by an electrical circuit connected to a computer.
In this video, the procedure of ICP-MS analysis will be described by the detection of 56Fe as an example.

Um método colorimétrico para medir o teor de ferro nas plantas

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

RGB e raiz Spectral Imaging para fenotipagem de planta e pesquisa fisiológica: instalação Experimental imagem e protocolos

Quantificação de proteínas solúveis vegetais e carboidratos digeríveis conteúdo, usando o milho (Zea mays) como um Exemplar

Configuração da Espectrometria de Massa de Plasma Acoplada de Eletroforese Capilar (CE-ICP-MS) para quantificação de espécies de redox de ferro (Fe(II), Fe(III))

Método fluorescente sem células quantificável e barato para confirmar a capacidade de novos compostos de quelar ferro

Método fluorescente sem células quantificável e barato para confirmar a capacidade de novos compostos de quelar ferro

Método fluorescente sem células quantificável e barato para confirmar a capacidade de novos compostos de quelar ferro

Medição do teor de ferro não-heme do tecido usando um ensaio colorimétrico baseado em banhontrolina

Quantificando o transporte de ferro através da placenta de camundongo in vivo usando isótopos de ferro não radioativos

O Bioensaio celular Caco-2 para Medição da Biodisponibilidade de Ferro Alimentar

Introdução à Espectrometria de Massa