Biosensores ópticos são sensores que detectam um alvo biológico ou alvos de interesse usando a luz. Esses dispositivos encontraram aplicações em saúde, produtos farmacêuticos, monitoramento ambiental, Segurança Interna e até mesmo no campo de batalha. Os biosensores ópticos são amplamente divididos em sensores baseados em rótulos e sem rótulos. Um exemplo de sensoriamento baseado em rótulos é a Polymerase Chain Reaction, ou PCR, que usa rótulos fluorescentes, ou fluoroforos, para quantificar o DNA alvo amplificado. Um exemplo de método livre de rótulos é Surface Plasmon Resonance, ou SPR. Aqui, a interação sem alterações biomoléculas com a superfície do sensor é quantificada medindo uma característica fundamental do sensor, como o ângulo de reflexão. Este vídeo revisa o básico desses tipos de técnicas de biosensagem óptica e seus componentes críticos, os princípios de trabalho e aplicações comuns de biosensores ópticos.
Primeiro, vejamos os princípios gerais da biosensação óptica baseada em rótulos. Normalmente, uma sonda ou elemento de biorecognição, como um anticorpo complementar, é anexado na superfície do sensor usando a química tradicional de imobilização. A solução amostral é então fluída sobre a superfície dos sensores. A molécula alvo, que é complementar ao elemento biorecognição imobilizado, é capturada seletivamente a partir da complexa solução amostral. Em seguida, a solução de amostra em excesso é lavada com tampão ou água. Em seguida, para ajudar a visualizar e quantificar a quantidade de alvo vinculado, uma molécula secundária que é complementar ao alvo e anexada a um fluoróvo, é fluída através do sistema. Depois de algum tempo, quando a ligação da molécula secundária ao alvo ocorreu, o excesso de fluoróforo desvinculado é lavado. A intensidade do fluoróforo ligado pode então ser quantificada usando um microscópio fluorescente. Esta intensidade é primeiramente traçada para várias concentrações de alvo conhecidas para criar uma curva de calibração, que permite então a medida direta de uma quantidade desconhecida de alvo capturado. Assim, as técnicas baseadas em rótulos utilizam a intensidade de fluorescência de fluoroforos extremamente sensíveis para quantificar a concentração da biomolécula de interesse.
Agora que revisamos os princípios dos biosensores ópticos baseados em rótulos, vamos dar uma olhada em um exemplo comumente usado, o padrão atual para amplificação de DNA, PCR Quantitativo ou qPCR. A mistura de reação qPCR inclui uma sonda rotulada para quantificação de reação em tempo real. A sequência da sonda é anexada a moléculas fluorescentes e quencher, e se liga a uma sequência de DNA específica. A molécula saciador sacia a emissão do fluoróforo enquanto ambas estão ligadas à sonda. Durante a reação do PCR, a enzima polimerase degrada o DNA da sonda e separa fisicamente o repórter fluoróforo, impedindo assim a sacieçação e resultando em um aumento da fluorescência. Para executar qPCR, primeiro adicione todos os componentes da reação, incluindo os sondas rotuladas, em um tubo PCR ou bem. Em seguida, coloque os poços pcr em um termociclador especializado e insira os parâmetros para cada ciclo e o número de ciclos. O termociclador usado para qPCR inclui uma fonte de luz com os componentes ópticos necessários para selecionar um comprimento de onda e um detector para medir a intensidade da fluorescência em tempo real durante a reação do PCR. No final de cada ciclo térmico, a intensidade fluorescente devido aos Fluoroforos liberados é registrada e plotada. A intensidade fluorescente é diretamente proporcional ao logaritmo da concentração alvo na reação bem, e assim, para uma fluorescência conhecida, a concentração de alvo desconhecida pode ser calculada.
Vejamos agora como a detecção pode ser alcançada sem repórteres, como fluoroforos, usando técnicas de sensoriamento óptico sem rótulos. Para técnicas sem rótulos, a imobilização do elemento biorecognição é a mesma da técnica baseada em rótulos. Qualquer acessório biomolécula à superfície desses sensores modifica o índice de refração nas proximidades do dispositivo óptico. As moléculas alvo se ligam à superfície do dispositivo óptico funcionalizado formando uma camada fina e modificando ainda mais o índice de refração. Essas alterações no índice de refração podem ser monitoradas rastreando a mudança na frequência natural de vibração, ou na frequência ressonante do sistema. A diferença nas frequências ressonantes antes e depois da ligação do alvo, chamada f shift, é diretamente proporcional à concentração do alvo capturado.
Agora vamos dar uma olhada nos princípios básicos de uma técnica de sensoriamento óptico comumente usada sem rótulos, Surface Plasmon Resonance ou SPR. Um instrumento SPR típico combina uma fonte laser movevel, um detector óptico para medir a mudança de intensidade, e um chip de sensor com um prisma de vidro revestido de um lado com ouro. O prisma coberto de ouro é integrado a um sistema fluido que permite uma operação de fluxo. Em um experimento, a molécula da sonda, ou elemento de biorecognição, é anexada à superfície dourada. O elemento alvo então flui sobre a superfície e se liga à sonda imobilizada. O sensor de sensibilidade utiliza o fenômeno SPR. Isso ocorre quando a luz polarizada é mostrada na superfície do metal, como o ouro, em um ângulo específico, theta SPR. Isso resulta na geração de plasmons superficiais que são oscilações eletrônicas coerentes que existem na interface de dois materiais que têm permitidaidades de sinais opostos. Quando a massa ligada à superfície do sensor muda, a condição de ressonância dos plasmons de superfície é alterada. Consequentemente, quando apenas o elemento de biorecognição está ligado na superfície, o feixe é refletido em um ângulo, ota um. Em seguida, quando mais massa é anexada à superfície, como o alvo capturado, uma redução da intensidade da luz refletida no ângulo específico, theta SPR é observado, à medida que o ângulo de reflexão muda para dois. A mudança de intensidade da luz refletida no ângulo de ressonância, theta SPR, é então uma função do ângulo da luz refletida, e pode ser medida como a diferença nos ângulos, um e dois.
Agora que cobrimos os princípios e procedimentos por trás dos biosensores ópticos, vamos ver como os pesquisadores estão aplicando essas técnicas hoje. O citómetro de célula de fluxo é um sistema óptico de biossensagem que é comumente usado para contar células e medir uma variedade de outras propriedades e componentes celulares. Uma amostra composta por vários tipos de células, cada uma marcada com um fluoróforo único, é preparada em uma suspensão. Em seguida, a amostra é executada através do citómetro de fluxo de tal forma que as células passam por um raio laser um de cada vez. À medida que cada célula passa pelo raio laser, a luz fluorescente dispersa e emitida pelos diferentes fluoroforos são separadamente quantificadas, o que dá uma contagem direta dos vários tipos de células da amostra. Outra aplicação de biosensores ópticos é a detecção de bactérias em amostras. Uma maneira de fazer isso é usando sensores ópticos de ressonador de anel. Eles são compostos de um loop fechado acoplado a guias de entrada de luz e ondas de saída. Quando a luz do comprimento de onda ressonante é aplicada ao guia de onda de entrada, ela é passada através do loop e constrói uma intensidade sobre várias viagens de ida e volta devido a interferências construtivas e é saída para o guia de onda de saída. Anticorpos específicos para proteínas da superfície bacteriana são imobilizados na superfície do ressonador do anel e um espectro de absorção de linha de base é obtido. Em seguida, a amostra bacteriana é fluída para a superfície do ressonador para permitir a ligação bacteriana ao corpo imobilizado, após o qual um segundo espectro de absorção é obtido. Se a bactéria de interesse se ligar, observa-se uma mudança visível nos picos ressonantes, o que é diretamente proporcional à concentração das bactérias-alvo.
Você acabou de assistir o vídeo do JoVE sobre biosensagem óptica. Discutimos os princípios básicos tanto da sensoriamento óptico baseada em rótulos quanto sem rótulos, juntamente com dois exemplos proeminentes desses métodos e algumas aplicações das técnicas. Obrigado por assistir.
