Agradecemos a Rana Adeel Ahmad para assistência na purificação do FCP. Prof Claudia Büchel é reconhecido por discussões úteis e ler o manuscrito. Este trabalho foi financiado pela Fundação de pesquisa alemã para LD (DI1956-1/1) e a Fundação Humboldt para uma bolsa de Feodor Lynen para ld.

Nota: Complexos fotossintéticos como FCPs são altamente vulneráveis à luz e ao calor. Sempre trabalho no gelo e sob uma luz muito fraca.
1. isolamento de FCP de células
<ol><li>
Isolamento de tilacoides de células de c. meneghiniana
	<ol>
<li>C. meneghiniana em cinco frascos de 500 mL que cada um preenchido com 300 mL de ASP-médio23,25 e 50 milhões de células de crescer. Conecte os frascos com uma rolha de algodão e permitir que as células a crescer para a fase de crescimento exponencial por aproximadamente uma semana num agitador a 120 rpm com 16 h luz e fase escura de 8 h a 40 µmol photons/(m²s) branco luz e uma temperatura entre 15-18 ° C. Verifique se o número de celular está entre 1,5 milhões de células/mL com uma câmara de contador de célula.</li>
		<li>Centrifugar as células a 4.000 x g em um rotor pré-resfriado com frascos de 500 mL centrífuga (4 ° C) por 15 min em uma centrífuga de alta velocidade. Re-suspenda as pelotas de célula em 12 mL de tampão de homogeneização (HB, tabela 1) de pipetagem.<ol>
<li>Transferi a suspensão para um tubo de plástico de 50ml único. Armazenar as amostras a-80 ° C ou prosseguir para a etapa 1.1.3.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Pré-fixe o moinho de esferas e equipamentos. Encher o béquer de 50 mL do moinho do grânulo para 75% com uma mistura de grânulo de vidro e adicionar a suspensão de eritrócitos. Para rompimento da pilha, use pulsos de 7 x 45 s a toda velocidade com 30 s de resfriamento entre cada pulso. Tome 20 µ l de células rompidas para verificações de qualidade na etapa 1.1.6.</li>
		<li>Filtre as células rompidas sobre um funil de vidro filtro e lave por derramando o HB sobre os grânulos de vidro até que eles aparecem claros. A fração de lavagem com o filtrado de piscina. Manter o volume final inferior a 150 mL.</li>
		<li>Centrifugar a amostra por 15 min a 140 x g , usando três tubos de plástico de 50 mL para os detritos de célula de Pelotas. Cuidadosamente, transferir o sobrenadante para frascos de ultracentrifugação de policarbonato de 20 mL e descartar a pelota.<ol>
<li>Encha os frascos com HB, equilibrar o peso e centrifugue em um rotor adequado por 1h em 300.000 x g e 4 ° C para as membranas tilacoides de Pelotas.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Use o tempo de centrifugação para verificar a proporção de células rompidas por microscopia em ampliação de X 400 com a 20 µ l da amostra tirada em 1.1.3. Calcule a relação entre o cloroplasto livre e cloroplasto que contém frustules (conchas de silicone). Nota: Paredes celulares de diatomáceas são feitas de sílica, que é visível como altamente diffracting substância no microscópio. Cloroplastos ocorrendo pontos tão verdes devem foram liberados das células se trabalhou o rompimento da pilha.</li>
		<li>Ressuspender o pellet de membrana com como tampão de lavagem pequena quanto possível (0,5-1 mL) usando o pincel de um pintor pequeno. Encha os frascos de ultracentrifugação de policarbonato com lavagem Reserva (tabela 1), equilibrar o seu peso e centrifugar por 20 min em 200.000 x g e 4 ° C.<ol>
<li>Re-suspenda as membranas lavadas com pincel de um pintor. Adicione o tampão de lavagem somente se necessário para manter a concentração de tilacoides mais alta possível. Todos contém no frasco (15 mL) de uma amostra da piscina.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Pre-dilua as amostras usando 10 µ l da amostra com 90 µ l de acetona 100%. -Centrifugar a 12.000 x g por 5 min para proteína precipitada de Pelotas. Pegue 10 µ l da pré diluição e misturá-lo com 990 µ l de 90% de acetona.<ol>
<li>Medir a absorbância (ABS) da clorofila a e c em 664 nm e 630 nm em 90% de acetona. Subtrai o ABS750nm de ambos os valores. Determinar o teor de clorofila total usando a seguinte fórmula:24 1)<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58017/58017eq1.jpg"> 2)<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58017/58017eq2.jpg">
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Alíquota contém, em doses de 0,5 mg de clorofila total em um tubos de reação de 1,5 mL, congelá-los em nitrogênio líquido e armazená-los a-80 ° C até utilização posterior.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Separação e concentração de complexos FCP
	<ol>
<li>Preparar uma solução de gradiente de sacarose e encher os tubos de se até o topo, menos o volume de carga (300-500 µ l). Congele os tubos a-20 ° C até que eles são completamente congelados. Permitir que os tubos descongelar a + 4 ° C, que leva 3-4 h para um tubo de 17 mL.<ol>
<li>Repeti o ciclo de congelamento-descongelamento duas vezes para refinar o gradiente para melhor resolução.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Use as amostras obtidas em 1.1.9 correspondente a 0,5 mg de clorofila e ajuste com buffer B1 (tabela 1) para um volume final de 2ml. Para solubilização, adicione n-dodecil-β-D-maltopyranoside (b-DDM) a uma concentração final de 20 mM.<ol>
<li>Inverter o tubo 3 vezes e coloque-o no gelo por 20 min com agitação suave para evitar espuma. Centrifugue por 5 min, a 12.000 x g em uma centrífuga de pre-cooled tabela superior a + 4 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Carrega o sobrenadante do gradiente. Não carregue mais de 125 µ g de clorofila total por gradiente se 17 mL frascos são usados. Centrífuga para 22 h em 100.000 x g e + 4 ° C.<ol>
<li>Recupere as frações FCP marrons desejadas de gradiente usando uma seringa (Figura 2A). Tirar um 5 µ l alíquota e dilui-lo com 995 µ l de B1a.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Medir o espectro de absorbância (ABS) entre 370-750 nm em um espectrofotômetro UV-VIS. Use o vidro ótico semi micro cubetas.<ol>
<li>Abra o software gerenciador de espectros, ir para o modo de espectro e gravar uma linha de base de 370 a 750 nm seguido por medições de amostra. Use as seguintes configurações: digitalizar velocidade, 200 nm/min; campo de dados, 0,5 nm; resposta, média.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Medir o volume da amostra recuperada com uma micropipeta. Lave os complexos do FCP, adicionando duas vezes o volume recuperado com buffer B1 (tabela 1). Concentre-se em um concentrador de membrana com um 30 kDa corte a 1.000 x g e + 4 ° C para um ABS672nm pelo menos 20. Nota: A concentração de b-DDM pode levantar-se devido ao enriquecimento micelle no compartimento da amostra. Isto pode levar a maior solubilização dos complexos FCP! Evite excesso de solubilização adicionando detergente buffer livre B1 se lavar mais etapas são necessárias para remover a sacarose residual.</li>
		<li>Tome um 20 µ l de alíquota para os controles. Choque, congelar as amostras em nitrogênio líquido e armazená-los a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58017/58017fig2.jpg"> Figura 2: purificação do FCP, espectroscópicos controles e verificação de pureza. (A) aparência típica de um gradiente de densidade de sacarose após centrifugação durante a noite. Todas as bandas marrons contêm a piscina FCP consistindo de FCPa e FCPb. pigm. - desacoplado pigmentos, PS - fotossistemas espectros de absorvância (B) do FCP antes (linha azul) e depois concentração (linha tracejada laranja) usando dispositivos de filtro centrífugo com corte 30 kDa . Particularmente, carotenoides são propensas a perda do FCP, o que resultaria em absorvância inferior na região entre 500-550 nm. Gráficos são normalizados para a clorofila Qy máxima no ~ 670 nm. Espectros de emissão de clorofila a (C) com excitação de chl c (465 nm) para testar a transferência de energia de excitação funcional. Se a energia transferida da chl c para chl um é dificultada, uma banda de fluorescência adicional em ~ 640 nm (chl c) ocorreria. Gráficos são normalizados para a máximo de emissão. (D) espectros de excitação gravado no 675 nm (chl uma fluorescência máxima) para testar a transferência de energia para chl um de todos os pigmentos de absorção entre 370 nm e 600 nm. Se a energia transferida para chl um é menos eficiente, o rendimento de fluorescência diminuiria especialmente entre 465 e 550 nm. Os gráficos são normalizados para o máximo em 440 nm. Os espectros (b), (C) e (D) são praticamente idênticas, se a concentração funcionou bem. (E) verificar a pureza do FCP isolado usando um gel de Tris-tricine28. FCPa e FCPb têm subunidades entre 18-19 kDa. Todas visíveis prata manchada as proteínas maiores que 20 kDa são contaminantes. Thyl. -Contém <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58017/58017fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol start="3"><li>
Controles baseados em gel e espectroscópicos
	<ol>
<li>Registro da absorbância entre 370-750 nm de 5 µ l do FCP em 995 µ l de B1a depois passo 1.2.5. Compará-lo com o espectro obtido na etapa 1.2.4. Use a mesma instrumentação e configurações conforme descrito na etapa 1.2.4.<ol>
<li>Exportar dados como *. csv e importar os dados para uma planilha. Normalizar os dois espectros com o máximo de chl na banda de cerca de 672y Q nm, conforme representado na Figura 2B.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Calcule o fator de diluição das amostras da etapa 1.2.4 e 1.3.1 dividindo o ABS medido672nm pelo desejado ABS672nm de 0,03. Diluir as amostras em conformidade com B1a e transferi-los para cubetas de fluorescência de vidro especial.</li>
		<li>Grave a chl um espectro de emissão de fluorescência com um spectrofluorometer para revelar a transferência de energia luz intacta de chl c a chl um (Figura 2).<ol>
<li>Use o software do espectrômetro e ir para o modo de medição do espectro com as seguintes configurações: modo, emissão; fenda de largura excitação e emissão, 3 nm; sensibilidade, média; velocidade de digitalização, 100 nm/min; campo de dados, 0,5 nm; comprimento de onda de excitação, 465 nm; emissão, 600-800 nm. Execute analógicos e medida.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Grave espectros de excitação com a mesma amostra e equipamento para revelar a transferência de energia intactos, de todos os pigmentos para chl (Figura 2D). Alterar configurações para: modo, excitação; comprimento de onda de emissão, 675 nm; excitação, 370-600 nm. Grave os espectros.<ol>
<li>Corrija com um espectro de rodamina na mesma faixa para propriedades espectrais da lâmpada – cf. instruções no manual do usuário.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Amostras de Mix FCP correspondente a 1 µ g de chl um com 10 µ l de tampão de carregamento SDS. Incubar durante 10 minutos a 25 ° C. Centrifugue por 5 min a 12000 x g em uma centrífuga de mesa.<ol>
<li>Carrega o sobrenadante em um gel de Tris-tricine28. Separá-lo por 2 h a 150 V e prata-mancha-lo após a separação de40. Nota: As subunidades FCP separam em duas bandas de proteína proeminente entre 18-19 kDa, que são constituintes da FCPa e FCPb29 (Figura 2E).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparação de lipossomas e incorporação do FCP
<ol><li>
Preparação da mistura de lipídios e detergente micelas de lipídios Nota: lipídios são suscetíveis a aquecer temperaturas combinadas com condições oxidativas. Tente manter os lipídios refrigerados e sob uma atmosfera de2 N.<ol>
<li>Calcule os rácios de lipídios tilacoides desejado para meneghiniana c. de acordo com Vieler et al . 200730. Consulte o exemplo dado em suplementar a tabela 1. Prepare os lipídios as soluções recomendadas pelo fabricante em um recipiente à prova de solvente.</li>
		<li>Pipetar a quantidade desejada de lipídios em um tubo de reação de 2 mL e evaporar o clorofórmio utilizando um fluxo suave de nitrogênio e tentar os lipídios espalhados por toda a área da base do tubo. Deixe o fluxo de2 N até que todo solvente é evaporado.</li>
		<li>Solubilizar a mistura de lipídios em 29 µ l da solução de β-D-glucopiranósido n-octil (OG) a 4 ° C, durante 4 h. Incubar a mistura lipídica durante 10 minutos a 30 ° C. Incubar os lipídios em banho sonicador para min 3 x 3 a 25 ° C, interrompida por 30 s no gelo.<ol>
<li>Adicione 221 µ l de tampão de tricine e 250 µ l de tampão de diálise x 4.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Use uma extrusora com membranas de policarbonato 0,1 µm de diâmetro de 50-70 nm definidos em lipossomas. Monte a extrusora com o apoio da membrana e filtro. Evitar bolhas de ar e aperte o conjunto completamente.</li>
		<li>Encher uma seringa com buffer de diálise x 4 e pre-molhado da extrusora até que nenhuma bolha pode ser vista na segunda seringa.</li>
		<li>Aplicar os lipid-detergente-micelas para a extrusora e pressione a solução de uma seringa para o outro para trás e volta. Repita este passo 5 vezes até parece a solução homogênea. Nota: Esta solução pode ser armazenada a 4 ° C por vários dias. Não congele!</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Incorporação de FCP complexos e remoção de detergentes e agregados Nota: Neste exemplo, usamos um lipídio/chl uma proporção de 12:1, que corresponde a uma proporção lipídio/proteína de aproximadamente 100: 1.<ol>
<li>Adicionar o FCP igual a 20 µ g de chl um em um volume total de 500 µ l de B1a buffer para 250 μL dos lipid-micelas extrudados e 250 µ l de buffer de diálise de 4x. Incube as amostras para min 3 x 3 a 25 ° C, em um thermomixer a 1.500-3.000 rpm, interrompida por uma pausa de s 30 no gelo.</li>
		<li>Corte a tampa do tubo de reação de 1,5 mL quatro só em cima dando um anel que ainda se encaixa na tampa. Preparar peças de 1,5 x 1,5 cm da membrana de diálise e lavá-los em 20 mL de tampão de diálise x 1</li>
		<li>Preencha 250 µ l da amostra para cada tampa. Com cuidado, coloque a membrana na tampa para que o compartimento é totalmente preenchido com a amostra e sem bolhas de ar ocorrerem. Aperte o anel do tubo de reação na assembleia a fim de ter um compartimento fechado.</li>
		<li>Dialize as amostras em 50 mL de 1x buffer de diálise durante a noite (12-16 h) no gelo em uma coqueteleira caindo. Substitua o buffer de diálise utilizada fresca e adicionar 7 mg de grânulos adsorvente para remover os restantes detergentes para pelo menos 6 h.</li>
		<li>Substitua o tampão de diálise novamente e urinar para outro h 12. recuperar os lipossomas perfurando a membrana de diálise com uma ponta de micropipeta de 200 µ l e aspirar todos os lipossomas da tampa do tubo de reação.</li>
		<li>Passo opcional: se alta pureza (> 95%) é necessária. Prepare um gradiente descontínuo de densidade em 17 mL frascos de ultracentrifugação com etapas contendo 6%, 10%, 15% e 20% copolímero de epicloridrina de sacarose no buffer de diálise. Carrega os lipossomas em cima e se a 100.000 x g, durante 4 h em um rotor de balde oscilante.<ol>
<li>Recuperar a banda superior marrom com uma seringa, diluir a amostra 1:5 com DP e prossiga para a próxima etapa.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Centrifugue os lipossomas FCP em pelo menos 2 mL de tampão de diálise por 1,5 h em 100.000 x g e 4 ° C. 1x Recupere os lipossomas, girando o tubo de centrifugação em um ângulo de 45°. Permitir que os lipossomas mover para baixo por 1 min (Figura 3A).</li>
		<li>Recuperar os lipossomas FCP em um volume final de 25-50 µ l. evitar perturbar o precipitado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Controles 1: absorvância, espectroscopia de fluorescência
	<ol>
<li>Adicione uma alíquota de 3 µ l dos FCP-lipossomas para um volume final de 1 mL de 1x buffer de diálise e centrifugue por 5 min a 12.000 x g.<ol>
<li>Grave a absorbância entre 370 e 750 nm de FCP-lipossomas com o mesmo equipamento, conforme descrito em 1.2.4. Normalizar o espectro ao máximo na região dey Q da chl um (670-680 nm) e compará-lo ao espectro normalizado de solubilizado FCP (Figura 3).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparar o FCP-lipossomas em 1 mL de DP com uma absorbância (ABS) = 0,03 em relação a máxima entre 670-680 nm. Ajuste o FCP solubilized detergente da etapa 1.2.6 para o ABS mesmo diluindo com B1a.</li>
		<li>Gravar espectros de absorvância de ambas as amostras, conforme descrito em 1.2.4. Grave a chl um espectro de emissão de fluorescência de ambas as amostras, conforme descrito em 1.3.3. Nota: O rendimento de fluorescência é diminuído na amostra FCP-lipossoma (Figura 3D e cf. discussão.)</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58017/58017fig3.jpg"> Figura 3: isolamento do FCP proteoliposomes seguido por controles espectroscópicos e imagem latente confocal. (A) recuperação de lipossomas FCP após a centrifugação. Ligue o tubo de centrifugação a 45° e espere aproximadamente 1 min - os lipossomas se moverá para baixo enquanto o FCP agrega que não são incorporados em lipossomas furar a parede do tubo. (B) comparação dos espectros de absorvância do FCP solubilizado em detergente (azul) e FCP em lipossomas (laranja) (C) os espectros mesmos como em (B) normalizado para chl um máximo na região vermelha (~ 670 nm - Qy pico); FCP solubilizado em detergente (azul) e FCP em lipossomas (laranja). Potencialmente, pode haver uma perda de pigmento, principalmente de carotenoides visível na região de 500-550 nm. O agrupamento de FCP nos lipossomas pode levar a uma ampliação de pico e uma ligeira mudança da chl máximo (~ 670 nm) para o vermelho. (D) espectros de emissão de FCP solubilizado em detergente e FCP em lipossomas. Cluster do FCP no lipossoma realça interações energéticas dos complexos do FCP que reduz o rendimento de fluorescência (curva de laranja) e desloca os máximos de emissão ligeiramente para o vermelho. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58017/58017fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Os autores não têm nada para divulgar.

Lipossomas FCP com composição lipídica natural fornecem uma ferramenta útil, simples e reprodutível para investigar Propriedades espectroscópicas in vitro. O ambiente de lipídios em lipossomas FCP assemelha-se a situação dentro da membrana tilacoides, dando origem a resultados experimentais que aproximam-se às condições naturais.
Existem várias vantagens de usar c. meneghiniana como um sistema modelo para antena do FCP. Ele cresce relativamente rápido e é mais ...

Organismos fotossintéticos como diatomáceas devem lidar com a constante mudança de condições de luz e responder com mecanismos sofisticados de aclimatação que sustentar alta eficiência fotossintética e protegem contra danos foto-oxidativo causado pela luz excessiva. Um processo de luz-protetores principal em eucariontes fotossintéticos é a alta energia têmpera (qE) da luz absorvida que ocorre como a principal contribuição para a não-fotoquímica têmpera (NPQ) sob condições de estresse leve1,2 ,3. Os complexos de antena colheita luz (LHC) estão envolvidos na regulação das vias de transferência de energia de excitação. Em resposta à luz alta induzidas pelo baixo pH no lúmen do cloroplasto, os interruptores do sistema de antena da luz colheita de estado para o estado de têmpera. Este estado de energia dissipativas protege fotossistemas (PS) e outros complexos na membrana tilacoides de foto-oxidação. Em eucariontes fotossintéticos, o qE é geralmente induzida por dois fatores1,2,3. Um fator é a luz especializada colheita proteína que responde ao baixo pH. A proteína PsbS induz o qE , em maior de plantas4. LhcSRs5, modulada pela atividade do PsbS, induzir o qE nas algas verdes6. Diatomáceas possuem proteínas, como Lhcx que estruturalmente relacionada com a LHCSRs7,8,9,10.
O segundo fator de qE é o ciclo da xantofila onde carotenoides da antena são convertidos em uma forma de foto-protetora por de epoxidação e revertidos por epoxidação. Plantas e algas verdes, violaxantina é convertida em zeaxantina. Diatomáceas, diadinoxantina é convertida em diatoxanthin, que em seguida se correlaciona com a extensão da NPQ11. A luz de diatomáceas colheita antena possui algumas peculiaridades, embora relacionadas com plantas e algas LHCs é evolutiva. O interruptor de luz da colheita para foto-proteção é extremamente rápido e a capacidade NPQ é superior em comparação com plantas12. Isto pode ser uma razão porque diatomáceas são muito bem sucedidas em diferentes nichos ecológicos, de forma que eles são responsáveis por até 45% da produção primária líquida oceânica13. Portanto, luz, sistemas de colheita de diatomáceas são um interessante objeto de pesquisa de fotossíntese.
Diatomáceas, como as espécies centralizado no Cyclotella meneghiniana, possuem tilacoides intrínseca luz colheita sistemas em homenagem os pigmentos eles vincular - fucoxantina, clorofila (chl) a e c, daí Light FCP. colheita de proteínas, tais como FCPs, são incorporado no sistema de membrana tilacoides, composto por várias camadas de membrana. Diatomáceas formam bandas de três contém. Este complexo situação dificulta a estudá-los no nível molecular na membrana tilacoides. Além disso, muitos componentes contribuem para a regulação da luz da colheita (veja acima). Portanto, em muitas abordagens, os complexos foram isolados a partir da membrana usando detergentes suaves, tais como n-dodecil-β-D-maltopyranoside (β-DDM), que solubilizar a membrana, mas manter os complexos FCP intacta. Muitos estudos espectroscópicos foram realizados usando o FCP solubilizado para investigar a energia intramolecular transferência14,15,16,17. No entanto, esta primeira abordagem foi limitada, desde que o Regulamento de transferência de energia precisa de excitônicas interação com outros complexos de antena ou de fotossistemas. Daí, esses tipos de estudos não podem ser realizados com solubilizado complexos porque a interação entre complexos é perdida.
Uma característica importante no Regulamento da antena é a "exclusão molecular" da antena e fotossistemas na membrana tilacoides18. Anteriormente, realizou uma abordagem simples para simular este efeito in vitro. O detergente foi removido, o que leva à agregação aleatória de complexos de antena. Embora alguns dados razoáveis foi obtidos por esta abordagem17,19, a remoção do detergente não reflete a situação na vivo e tem algumas limitações, desde que os complexos não estão interagindo em sua regular terciário estrutura.
O uso de lipossomas supera várias das limitações anteriores. A estrutura terciária ainda está totalmente intacta. A membrana do lipossoma fornece um ambiente quase nativo para os complexos de antena. A membrana separa o interior do lipossoma o ambiente exterior. Por estes meios, os lipossomas fornecem dois compartimentos de reação para estudos de gradientes iônica e pH, bem como quanto aos processos de transporte. Além disso, os parâmetros do sistema experimental podem ser controlados mais facilmente para estudos na membrana tilacoides. Os lipossomas foram já mostrou ser uma excelente ferramenta para o estudo de complexos fotossintéticos. Um grande foco no passado foi na planta LHC onde o efeito de composição de lipídios alterados foi testado no LHC II20. Em outras abordagens, a interação da proteína-proteína entre diferentes LHC II foram investigados21. Além disso, alguns em algas verdes foram realizados estudos que descrevem a aglomeração espontânea entre LHC22. Considerando a importância das diatomáceas para ecossistemas aquáticos, relativamente poucos estudos foram realizados com complexos de antena de diatomáceas. Dois estudos investigaram os complexos antena do centralizado no meneghiniana de Cyclotella, onde a aglomeração do FCP antena23 e capacidade de resposta do FCP para gradientes eletroquímicos24 foram mostrados. Assim, os lipossomas são uma excelente ferramenta para estudar a antenas de diatomáceas e sua interação e regulamento em condições quase nativos. Os lipossomas são versáteis desde muitas condições tais como a composição de lipídios, lipossomas tamanho, densidade de proteína e a fase aquosa circundante pode ser controlada. Além disso, o método requer pequenas quantidades de amostras. O sistema experimental é robusto e altamente reprodutíveis. Compartimentação dos lipossomas permite estudar o pH e gradientes de íons, que são importantes fatores na regulação dos complexos de antena.
Aqui, descrevemos o isolamento de complexos de antena FCP de c. meneghiniana e sua incorporação em lipossomas com composição lipídica de tilacoides natural. Também, fornecemos dados exemplares para a caracterização espectroscópica de FCP solubilizado e compará-los com FCP em lipossomas. O método resume o conhecimento e protocolos padronizados obtidos com as melhorias de Gundermann e Büchel 201223Natali et al 201622e Ahmad e 2017 Dietzel24.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58017/58017fig1.jpg"> Figura 1: representação esquemática do fluxo de trabalho. (1) refere-se ao n º 1, que descreve o crescimento celular, ruptura e isolamento de tilacoides com a seguinte separação FCP em gradientes de densidade de sacarose; C. m. -Células deCyclotella meneghiniana . (2) preparação de tilacoides natural mistura de lipídios (MGDG, Junior e SQDG) descrita no n º 2 e criação de micelas de lipídios-detergente com octylglycoside (OG). Um tamanho definido lipid-micelle é alcançado por extrusão usando membranas de um diâmetro de poro definido. FCP e micelas de lipídios são unificadas em um lipido predefinido: proporção de proteína e os detergentes OG e β-DDM são removidos através de controlada diálise formando FCP proteoliposomes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58017/58017fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>500 ml centrifuge vials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>high speed centrifuge</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bead Mill VI 2</td><td>Edmund-B&amp;uuml;hler (edmund-buehler.de)</td><td></td><td>newer version: Vibrogen-Zellm&amp;uuml;hle Vl 6</td></tr><tr><td>Silibeads S 400 &amp;micro;m</td><td>Sigmund-Lindner.com</td><td>5223-7</td><td></td></tr><tr><td>Silibeads S 1,-1,3 mm</td><td>Sigmund-Lindner.com</td><td>4504</td><td></td></tr><tr><td>VitraPOR filter funnel - por1</td><td>ROBU GmbH</td><td>21121</td><td></td></tr><tr><td>polycarbonate ultracentrifuagtion vials (30 mL) for T-865</td><td>Beranek Laborger&amp;auml;te (Laborgeraete-beranek.de)</td><td>314348</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Discovery 90SE</td><td>Sorvall</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>rotor T 865</td><td>ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)</td><td>51411</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer Cell Counter Chamber (improved)</td><td>Carl Roth Laborbedarf (Carlroth.com)</td><td>T729.1</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Mikroskop Primostar (7)</td><td>Optik-Pro (optik-pro.de)</td><td>51428</td><td></td></tr><tr><td>optical glass cuvettes (6040-OG)</td><td>Hellma Analytics (hellma-analytics.com)</td><td>&quot;6040-10-10&quot;</td><td></td></tr><tr><td>V-630 UV-VIS Spectrophotometer (incl. software)</td><td>Jasco (jasco.de)</td><td>V-630</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&amp;beta;-D-Maltopyranoside</td><td>ANATRACE (anatrace.com)</td><td>D310LA</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clear tubes 17 ml for AH629</td><td>Beranek Laborger&amp;auml;te (Laborgeraete-beranek.de)</td><td>344061</td><td></td></tr><tr><td>rotor AH629-17-mL</td><td>ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)</td><td>54285</td><td></td></tr><tr><td>Membrane concentrator_Centriprep 30 kDa cutoff</td><td>Millipore (merckmillipore.com)</td><td>4307</td><td></td></tr><tr><td>Biometra Minigel-Twin</td><td>Analytik Jena AG (analytik-jena.de)</td><td>846-010-100</td><td></td></tr><tr><td>Silver Stain Plus Kit</td><td>Bio-Rad (bio-rad.com)</td><td>1610449</td><td></td></tr><tr><td>libre office spread sheet</td><td>The document foundation</td><td>https://de.libreoffice.org/download/libreoffice-still/</td><td></td></tr><tr><td>special glass cuvettes for fluorescence (101-0S)</td><td>Hellma Analytics (hellma-analytics.com)</td><td>101-10-20</td><td></td></tr><tr><td>Spectrofluorometer FP-6500 (incl. Software)</td><td>Jasco (jasco.de)</td><td>FP-6500</td><td></td></tr><tr><td>SDS-loading buffer Roti-Load</td><td>ROTH (carlroth.com)</td><td>K929.1</td><td></td></tr><tr><td>n-octyl &amp;beta;-D-glucopyranoside</td><td>ANATRACE (anatrace.com)</td><td>O311</td><td></td></tr><tr><td>Monogalactosyl Diaclyglycerol (MGDG)</td><td>Larodan AB (larodan.com)</td><td>59-1300</td><td>make stock solution in chloroform</td></tr><tr><td>Digalactosyl Diacylglycerol (DGDG)</td><td>Larodan AB (larodan.com)</td><td>59-1310</td><td>make stock solution in chloroform</td></tr><tr><td>Sulphoquinovosyl Diacylglycerol (SQDG)</td><td>Larodan AB (larodan.com)</td><td>59-1230</td><td>make stock solution in chloroform</td></tr><tr><td>L-alpha-Phosphatidylglycerol (PG)</td><td>Larodan AB (larodan.com)</td><td>37-0150</td><td>make stock solution in chloroform</td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-Phosphatidylcholine</td><td>Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)</td><td>P3782 SIGMA</td><td>make stock solution in chloroform</td></tr><tr><td>sonicator bath S-50TH</td><td>Sonicor (getmedonline.com</td><td>SONICOR-S-50TH</td><td></td></tr><tr><td>mini-Extruder</td><td>Avanti Polar Lipids (Avanti.com)</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Nuleopore polycarbonate membrane</td><td>Avanti Polar Lipids (Avanti.com)</td><td>610005</td><td></td></tr><tr><td>dialysis membrane Visking 14 kDa cutoff</td><td>ROTH (carlroth.com)</td><td>0653.1</td><td>boil in destilled water before use</td></tr><tr><td>Biobeads SM2 Adsorbent</td><td>Biorad (Bio-rad.com)</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>sucrose epichlorhydrin copolymer - Ficoll 400</td><td>Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)</td><td>F4375</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonate ultracentrifuagtion vials (2.7 mL) for TFT 80.4</td><td>Beranek Laborger&amp;auml;te (Laborgeraete-beranek.de)</td><td>252150</td><td></td></tr><tr><td>rotor TFT 80.4</td><td>Millipore (merckmillipore.com)</td><td>54356</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;material listed in order of appearance &lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;For specific safety instructions please refer to material safety sheets and repective manuals.&lt;br /&gt;Standard lab material and substances are not listed.&lt;/em&gt;</td></tr></tbody></table>

isolating and incorporating light-harvesting antennas from diatom cyclotella meneghiniana in liposomes with thylakoid lipids

O desempenho fotossintético de plantas, algas e diatomáceas depende fortemente do Regulamento rápido e eficiente, a colheita de luz e energia processos de transferência na membrana tilacoides de cloroplastos. A luz da colheita antena de diatomáceas, as proteínas de ligação a/c de clorofila do chamado fucoxantina (FCP), são necessários para a absorção de luz e centros de transferência eficiente para a reação fotossintética também quanto a foto-proteção contra luz em excesso. O interruptor entre essas duas funções é uma questão de longa data de pesquisa. Muitos desses estudos tenham sido realizados com FCP em micelas de detergente. Para estudos de interacção, os detergentes foram removidos, o que levou a uma agregação inespecífica de complexos do FCP. Nesta abordagem, é difícil discriminar entre artefatos e dados fisiologicamente relevantes. Portanto, informações mais valiosas sobre FCP e outro luz de membrana acoplada colheita complexos podem ser obtidas através do estudo de interações da proteína-proteína, transferência de energia e outros recursos espectroscópicos se estão inseridos em seu ambiente nativo de lipídios. A principal vantagem é que os lipossomas têm um tamanho definido e uma proporção de lipídio/proteína definidos pelo qual a extensão do FCP cluster é controlada. Além disso, alterações na composição do pH e íon que regulam a luz colheita na vivo podem ser facilmente simuladas. Em comparação com a membrana dos tilacoides, os lipossomas são mais homogêneo e menos complexo, que torna mais fácil de obter e compreender dados espectroscópicos. O protocolo descreve o procedimento de FCP isolamento e purificação, preparação de lipossomas e incorporação do FCP lipossomas com composição lipídica natural. Resulta de uma aplicação típica são dadas e discutidas.

O protocolo descreve o isolamento de fracção FCP total de Cyclotella meneghiniana e incorporação em lipossomas com composição lipídica nativo. O isolamento de tilacoides é altamente reprodutível, mas o rendimento de tilacoides pode mudar. O resultado é aceitável se a mais de 50% de todos os pigmentos são recuperados em etapa 1.1.4. Mais de 80% é o ideal.
A solubilização da contém é uma etapa crítica. B...

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Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar a fucoxantina clorofila a/c proteínas obrigatórias (FCP) de diatomáceas e incorporá-las em lipossomas com composições de lipídios naturais para estudar a transferência de energia de excitação sobre as alterações de composição do íon.

Isolando e incorporando luz-colheita antenas de diatomáceas Cyclotella Meneghiniana em lipossomas com lipídios tilacoides

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy ...

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Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Unit 1

Chloroplasts and Photosynthesis

SCIENTISTS IN ACTION

7.7K visualizações.  Goethe University. Aqui, apresentamos um protocolo para isolar a fucoxantina clorofila a/c proteínas obrigatórias (FCP) de diatomáceas e incorporá-las em lipossomas com composições de lipídios naturais para estudar a transferência de energia de excitação sobre as alterações de composição do íon.

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Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Bioquímica

Facile Preparation of Internally Self-assembled Lipid Particles Stabilized by Carbon Nanotubes

We present a facile method to prepare nanostructured lipid particles stabilized by carbon nanotubes (CNTs). Single-walled (pristine) and multi-walled (functionalized) CNTs are used as stabilizers to produce Pickering type oil-in-water (O/W) emulsions. Lipids namely, Dimodan U and Phytantriol are used as emulsifiers, which in excess water self-assemble into the bicontinuous cubic Pn3m phase. This highly viscous phase is fragmented into smaller particles using a probe ultrasonicator in presence of conventional surfactant stabilizers or CNTs as done here. Initially, the CNTs (powder form) are dispersed in water followed by further ultrasonication with the molten lipid to form the final emulsion. During this process the CNTs get coated with lipid molecules, which in turn are presumed to surround the lipid droplets to form a particulate emulsion that is stable for months. The average size of CNT-stabilized nanostructured lipid particles is in the submicron range, which compares well with the particles stabilized using conventional surfactants. Small angle X-ray scattering data confirms the retention of the original Pn3m cubic phase in the CNT-stabilized lipid dispersions as compared to the pure lipid phase (bulk state). Blue shift and lowering of the intensities in characteristic G and G&#39; bands of CNTs observed in Raman spectroscopy characterize the interaction between CNT surface and lipid molecules. These results suggest that the interactions between the CNTs and lipids are responsible for their mutual stabilization in aqueous solutions. As the concentrations of CNTs employed for stabilization are very low and lipid molecules are able to functionalize the CNTs, the toxicity of CNTs is expected to be insignificant while their biocompatibility is greatly enhanced. Hence the present approach finds a great potential in various biomedical applications, for instance, for developing hybrid nanocarrier systems for the delivery of multiple functional molecules as in combination therapy or polytherapy.

We report on a smart application of carbon nanotubes for kinetic stabilization of lipid particles that contain self-assembled nanostructures in their cores. The preparation of lipid particles requires rather low concentrations of carbon nanotubes permitting their use in biomedical applications such as drug delivery.

Preparação Facile da Internamente auto-montados Lipid partículas estabilizada por nanotubos de carbono

We present a facile method to prepare nanostructured lipid particles stabilized by carbon nanotubes (CNTs). Single-walled (pristine) and multi-walled ...

Química

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such systems allows for detailed studies of their underlying mechanisms which would not be feasible in vivo. Here, we provide a protocol for the in vitro reconstitution of the MinCDE system of Escherichia coli, which positions the cell division septum in the cell middle. The assay is designed to supply only the components necessary for self-organization, namely a membrane, the two proteins MinD and MinE and energy in the form of ATP. We therefore fabricate an open reaction chamber on a coverslip, on which a supported lipid bilayer is formed. The open design of the chamber allows for optimal preparation of the lipid bilayer and controlled manipulation of the bulk content. The two proteins, MinD and MinE, as well as ATP, are then added into the bulk volume above the membrane. Imaging is possible by many optical microscopies, as the design supports confocal, wide-field and TIRF microscopy alike. In a variation of the protocol, the lipid bilayer is formed on a patterned support, on cell-shaped PDMS microstructures, instead of glass. Lowering the bulk solution to the rim of these compartments encloses the reaction in a smaller compartment and provides boundaries that allow mimicking of in vivo oscillatory behavior. Taken together, we describe protocols to reconstitute the MinCDE system both with and without spatial confinement, allowing researchers to precisely control all aspects influencing pattern formation, such as concentration ranges and addition of other factors or proteins, and to systematically increase system complexity in a relatively simple experimental setup.

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

We provide a protocol for in vitro self-organization assays of MinD and MinE on a supported lipid bilayer in an open chamber. Additionally, we describe how to enclose the assay in lipid-clad PDMS microcompartments to mimic in vivo conditions by reaction confinement.

In Vitro Reconstituição de auto-organização padrões de proteína na Bilayers do Lipid suportados

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within the chloroplasts, the thylakoid membrane system houses all the photosynthetic pigments, reaction center complexes, and most of the electron carriers, and is responsible for light-dependent ATP synthesis. Over 90% of chloroplast proteins are encoded in the nucleus, translated in the cytosol, and subsequently imported into the chloroplast. Further protein transport into or across the thylakoid membrane utilizes one of four translocation pathways. Here, we describe a high-yield method for isolation of transport-competent thylakoids from peas (Pisum sativum), along with transport assays through the three energy-dependent cpTat, cpSec1, and cpSRP-mediated pathways. These methods enable experiments relating to thylakoid protein localization, transport energetics, and the mechanisms of protein translocation across biological membranes.

We present protocols herein for high-yield isolation of physiologically active thylakoids and protein transport assays for the chloroplast twin arginine translocation (cpTat), secretory (cpSec1), and signal recognition particle (cpSRP) pathways.

Isolamento de fisiologicamente ativo contém e a sua utilização em ensaios de transporte de energia-dependente da proteína

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of neutral lipids surrounded by a phospholipid monolayer. One of the most useful techniques in determining the cellular roles of droplets has been proteomic identification of bound proteins, which can be isolated along with the droplets. Here, two methods are described to isolate lipid droplets and their bound proteins from two wide-ranging eukaryotes: fission yeast and human placental villous cells. Although both techniques have differences, the main method - density gradient centrifugation -&#160;is shared by both preparations. This shows the wide applicability of the presented droplet isolation techniques.

In the first protocol, yeast cells are converted into spheroplasts by enzymatic digestion of their cell walls. The resulting spheroplasts are then gently lysed in a loose-fitting homogenizer. Ficoll is added to the lysate to provide a density gradient, and the mixture is centrifuged three times. After the first spin, the lipid droplets are localized to the white-colored floating layer of the centrifuge tubes along with the endoplasmic reticulum (ER), the plasma membrane, and vacuoles. Two subsequent spins are used to remove these other three organelles. The result is a layer that has only droplets and bound proteins.

In the second protocol, placental villous cells are isolated from human term placentas by enzymatic digestion with trypsin and DNase I. The cells are homogenized in a loose-fitting homogenizer. Low-speed and medium-speed centrifugation steps are used to remove unbroken cells, cellular debris, nuclei, and mitochondria. Sucrose is added to the homogenate to provide a density gradient and the mixture is centrifuged to separate the lipid droplets from the other cellular fractions.

The purity of the lipid droplets in both protocols is confirmed by Western Blot analysis. The droplet fractions from both preps are suitable for subsequent proteomic and lipidomic analysis.

Two techniques for isolating cellular lipid droplets from 1) yeast cells and 2) human placentas are presented. The centerpiece of both procedures is density gradient centrifugation, where the resulting floating layer containing the droplets can be readily visualized by eye, extracted, and quantified by Western Blot analysis for purity.

Isolamento de celulares lipídicas Gotas: Duas técnicas de purificação Começando a partir de células de levedura e placentas humanas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

Bioengenharia

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

Formação de biomembrana Microarrays com um método de montagem baseada em Rodo

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Purification of Active Photosystem I-Light Harvesting Complex I from Plant Tissues

This method is used to isolate Photosystem I (PSI) together with the Light Harvesting Complex I (LHCI), its native antenna, from plants. PSI-LHCI is a large membrane protein complex coordinating hundreds of light harvesting and electron transport factors and is the most efficient light harvesting system found in nature. Photons absorbed by the four LHCA antenna proteins that make up LHCI are transferred through excitonic interaction to the PSI core reaction center and are used to facilitate light-driven charge separation across the thylakoid membrane, providing reducing power and energy for carbon fixation in photoautotrophic organisms. The high quantum efficiency of PSI makes this complex an excellent model to study light-driven energy transfer. In this protocol, plant tissue is mechanically homogenized, and the chloroplasts are separated from the bulk cellular debris by filtration and centrifugation. The isolated chloroplasts are then osmotically lysed, and the thylakoid membranes are recovered via centrifugation and solubilized using the detergent n-dodecyl-beta-maltoside. The solubilized material is loaded onto an anion exchange column to collect most of the chlorophyll-containing complexes. Larger complexes are precipitated from the solution, resuspended in a small volume, and loaded on sucrose gradients to separate the major chlorophyll-containing complexes. The resulting sucrose gradient fractions are characterized to identify the band of interest containing PSI-LHCI. This protocol is highly similar to the protocol used in the crystallization of plant PSI-LHCI with some simplifications and relies on methods developed over the years in the lab of Nathan Nelson.

This protocol describes the isolation of Photosystem I (PSI) - Light Harvesting Complex I (LHCI) from plant tissues. PSI along with PSII is responsible for the conversion of light to chemical energy in oxygenic photoautotrophs and has a quantum efficiency of ~1, making it a target for studying light-driven energy transfer.

This method is used to isolate Photosystem I (PSI) together with the Light Harvesting Complex I (LHCI), its native antenna, from plants. PSI-LHCI is a ...

Examining BCL-2 Family Function with Large Unilamellar Vesicles

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate apoptosis1. Following cellular stress (e.g., DNA damage), the pro-apoptotic BCL-2 family effectors BAK (BCL-2 antagonistic killer 1) and/or BAX (BCL-2 associated X protein) become activated and compromise the integrity of the outer mitochondrial membrane (OMM), though the process referred to as mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP)1. After MOMP occurs, pro-apoptotic proteins (e.g., cytochrome c) gain access to the cytoplasm, promote caspase activation, and apoptosis rapidly ensues2.
In order for BAK/BAX to induce MOMP, they require transient interactions with members of another pro-apoptotic subset of the BCL-2 family, the BCL-2 homology domain 3 (BH3)-only proteins, such as BID (BH3-interacting domain agonist)3-6. Anti-apoptotic BCL-2 family proteins (e.g., BCL-2 related gene, long isoform, BCL-xL; myeloid cell leukemia 1, MCL-1) regulate cellular survival by tightly controlling the interactions between BAK/BAX and the BH3-only proteins capable of directly inducing BAK/BAX activation7,8. In addition, anti-apoptotic BCL-2 protein availability is also dictated by sensitizer/de-repressor BH3-only proteins, such as BAD (BCL-2 antagonist of cell death) or PUMA (p53 upregulated modulator of apoptosis), which bind and inhibit anti-apoptotic members7,9. As most of the anti-apoptotic BCL-2 repertoire is localized to the OMM, the cellular decision to maintain survival or induce MOMP is dictated by multiple BCL-2 family interactions at this membrane.
 Large unilamellar vesicles (LUVs) are a biochemical model to explore relationships between BCL-2 family interactions and membrane permeabilization10. LUVs are comprised of defined lipids that are assembled in ratios identified in lipid composition studies from solvent extracted Xenopus mitochondria (46.5% phosphatidylcholine, 28.5% phosphatidylethanoloamine, 9% phosphatidylinositol, 9% phosphatidylserine, and 7% cardiolipin)10. This is a convenient model system to directly explore BCL-2 family function because the protein and lipid components are completely defined and tractable, which is not always the case with primary mitochondria. While cardiolipin is not usually this high throughout the OMM, this model does faithfully mimic the OMM to promote BCL-2 family function. Furthermore, a more recent modification of the above protocol allows for kinetic analyses of protein interactions and real-time measurements of membrane permeabilization, which is based on LUVs containing a polyanionic dye (ANTS: 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid) and cationic quencher (DPX: p-xylene-bis-pyridinium bromide)11. As the LUVs permeabilize, ANTS and DPX diffuse apart, and a gain in fluorescence is detected. Here, commonly used recombinant BCL-2 family protein combinations and controls using the LUVs containing ANTS/DPX are described.

Biochemically-defined large unilamellar vesicles (LUVs) are a convenient model system to analyze BCL-2 family interactions with immediate implications in better understanding the mitochondrial pathway of apoptosis. A method to produce LUVs, along with standard BCL-2 family protein combinations and controls to examine LUV permeabilization, are presented.

Examinando BCL-2 Função Família com grandes vesículas unilamelares

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate ...

Biologia

On-Chip Octanol-Assisted Liposome Assembly for Bioengineering

Microfluidics is a widely used tool to generate droplets and vesicles of various kinds in a controlled and high-throughput manner. Liposomes are simplistic cellular mimics composed of an aqueous interior surrounded by a lipid bilayer; they are valuable in designing synthetic cells and understanding the fundamentals of biological cells in an in vitro fashion and are important for applied sciences, such as cargo delivery for therapeutic applications. This article describes a detailed working protocol for an on-chip microfluidic technique, octanol-assisted liposome assembly (OLA), to produce monodispersed, micron-sized, biocompatible liposomes. OLA functions similarly to bubble blowing, where an inner aqueous (IA) phase and a surrounding lipid-carrying 1-octanol phase are pinched off by surfactant-containing outer fluid streams. This readily generates double-emulsion droplets with protruding octanol pockets. As the lipid bilayer assembles at the droplet interface, the pocket spontaneously detaches to give rise to a unilamellar liposome that is ready for further manipulation and experimentation. OLA provides several advantages, such as steady liposome generation (&#62;10 Hz), efficient encapsulation of biomaterials, and monodispersed liposome populations, and requires very small sample volumes (~50 &#181;L), which can be crucial when working with precious biologicals. The study includes details on microfabrication, soft-lithography, and surface passivation, which are needed to establish OLA technology in the lab. A proof-of-principle synthetic biology application is also shown by inducing the formation of biomolecular condensates inside the liposomes via transmembrane proton flux. It is anticipated that this accompanying video protocol will facilitate the readers to establish and troubleshoot OLA in their labs.

The present protocol describes octanol-assisted liposome assembly (OLA), a microfluidic technique to generate biocompatible liposomes. OLA produces monodispersed, micron-sized liposomes with efficient encapsulation, allowing immediate on-chip experimentation. This protocol is anticipated to be particularly suitable for synthetic biology and synthetic cell research.

Montagem de lipossomas assistida por octanol on-chip para bioengenharia

Microfluidics is a widely used tool to generate droplets and vesicles of various kinds in a controlled and high-throughput manner. Liposomes are ...

Padrão de proteína reversível controlado por luz em membranas lipídicas

Dynamic Light-Induced Protein Patterns at Model Membranes

The precise localization and activation of proteins at the cell membrane at a certain time gives rise to many cellular processes, including cell polarization, migration, and division. Thus, methods to recruit proteins to model membranes with subcellular resolution and high temporal control are essential when reproducing and controlling such processes in synthetic cells. Here, a method is described for fabricating light-regulated reversible protein patterns at lipid membranes with high spatiotemporal precision. For this purpose, we immobilize the photoswitchable protein iLID (improved light-inducible dimer) on supported lipid bilayers (SLBs) and on the outer membrane of giant unilamellar vesicles (GUVs). Upon local blue light illumination, iLID binds to its partner Nano (wild-type SspB) and allows the recruitment of any protein of interest (POI) fused to Nano from the solution to the illuminated area on the membrane. This binding is reversible in the dark, which provides dynamic binding and release of the POI. Overall, this is a flexible and versatile method for regulating the localization of proteins with high precision in space and time using blue light.

Autor em destaque: Recrutamento de proteínas comutáveis por foto para padrões reversíveis em sistemas celulares artificiais

Here, a protocol is described for generating light-regulated and reversible protein patterns with high spatiotemporal precision at artificial lipid membranes. The method consists of the localized photoactivation of the protein iLID (improved light-inducible dimer) immobilized on model membranes that, under blue light, binds to its partner protein Nano (wild-type SspB).

Isolando e incorporando luz-colheita antenas de diatomáceas Cyclotella Meneghiniana em lipossomas com lipídios tilacoides

Resumo

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Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal