Este trabalho foi apoiado por um Norwich Research Park Studentship (JR), a engenharia conjunta e Conselho de pesquisa de ciências físicas/biotecnológico e financiados pelo Biological Sciences Research Council BBSRC OpenPlant sintético biologia centro de investigação concedem (BB / L014130/1) (FIBROCIMENTOS, ENTRE OUTROS); uma troca de conhecimento do John Innes Centre e comercialização concedem (BB/KEC1740/1) (APA); e a concessão de programa estratégico do Instituto BBSRC 'Moléculas de natureza' (BB/P012523/1) e o John Innes Foundation (A.O.). Gostaríamos de agradecer a George Lomonossoff para fornecer os pEAQ vetores e Andrew Davis para a fotografia.

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Os autores não têm nada para divulgar.

Coloque-através de-alto vácuo infiltração permite que este protocolo a ser usado rotineiramente em nosso laboratório para a produção preparativa triterpeno compostos de interesse para várias aplicações a jusante. O aparelho de vácuo infiltração descrito aqui é facilmente replicado. Adição do reservatório de vácuo é aconselhável diminuir o tempo necessário para puxar o vácuo necessário, no entanto, é possível simplesmente adaptar um forno de vácuo sem modificações como a câmara de infiltração. Proteger a bomba de vácuo através da adição de um condensador apropriado é teoricamente sensato, mas em nosso laboratório, encontrámos este é desnecessário.
Cobertura de infiltração é comprometida se as folhas não são totalmente imersa na suspensão de infiltração. Este problema é minimizado, garantindo que o nível da suspensão atinge a superfície superior do titular da planta, e que o titular de planta tem um ajuste apertado para o banho de infiltração. Observação da Figura 2 que a superfície superior do titular da planta é embutida para o banho de infiltração quando estava no lugar. Isto é conseguido através de painéis nas bordas médios do titular que formam o ponto de ancoragem com a parte superior do banho de infiltração. A suspensão de infiltração exigirá adições periódicas para manter o nível de suspensão. Isto é melhor conseguido pela adição de suspensão de infiltração em excesso para evitar a redução gradual do OD600 ao longo de uma grande infiltração batch-wise. No entanto, em nossas mãos, substituição por água não parece ter um efeito perceptível sobre rendimentos esperados em escala preparativa, embora isso não tenha sido quantitativamente investigada. Como muitas plantas podem estar infiltradas de um lote de suspensão de infiltração é ainda uma questão em aberto. Nós rotineiramente se infiltrar entre 100 e 200 plantas com um único lote de suspensão de infiltração. Além disso, é normal para um solo lixiviar para a suspensão de infiltração ao longo do processo de infiltração. Isto não foi encontrado para ter um efeito perceptível sobre a eficácia da infiltração.
Durante a colheita, é aconselhável (mas não críticos) para colher somente as folhas que foram infiltradas (algumas folhas terá crescido pós-infiltração). Colheita seletiva impede a diluição com tecido improdutiva, que caso contrário iria aumentar a proporção de impurezas endógenas relativo para o composto de interesse. Isto tem um impacto nominal sobre a facilidade de purificação a jusante e aumenta a escala destes processos. Ao usar o tHMGR para aumentar o fornecimento de precursor, um fenótipo necrosado é frequentemente observado a desenvolver ao longo do período de crescimento pós-infiltração. Isto é normal e realmente auxilia a colheita seletiva e o processo de secagem a jusante. O pó de folhas secas geralmente pode ser armazenado em um recipiente fechado em local fresco, seco e escuro, mas idealmente em um dessecador, sob vácuo. Isso depende da estabilidade do composto do interessado. Tenha cuidado se optar por armazenar em um freezer-80 ° C. Garantir que as secas folhas são em um recipiente impermeável e à saída do armazém, permitir que este recipiente para aquecer a temperatura ambiente antes da abertura. Para fazê-lo resultará em rewetting das folhas, dificultando o processamento de jusante.
As etapas pós-colheita no presente protocolo são fornecidas para fins ilustrativos, e para ajudar os pesquisadores que podem ter limitado a química prática experimentam. Eles podem ser substituídos por muitas outras técnicas de extração/purificação de produtos naturais. Conforme detalhado na introdução, PSE tem muitas vantagens, no entanto, o capital custo do aparelho comercialmente disponível do PSE pode ser proibitivo e não é essencial. Tratamento de resina de troca iônica básica é um método muito conveniente para substituir o tradicional saponificação seguida de particionamento de líquido/líquido. No entanto, não é apropriado para produtos contendo grupos carboxila ou grupos funcionais que iria ser hidrolisados sob condições básicas, tais como ésteres. Estes produtos se esperaria ser retidos na resina aniões. No entanto, há potencial para explorar isto para uma captação e liberação de procedimento (não documentado). Onde saponificação tradicional seria adequada, tratamento de resina de troca iônica básica serve como uma alternativa conveniente. O método de cromatografia descrito na etapa 9, foi encontrado para ser generalizados para os compostos descritos na Figura 3. No entanto, compostos de polaridade aumentada podem exigir um longo período de eluição de acetato de etila de 100%. Com referência a passo 9.2, purificação bem a jusante é inteiramente composto específico e também é dependente da escala. Repetidas rodadas de cromatografia flash de menor escala com gradientes otimizados, é geralmente suficiente para atingir um grau de pureza adequado para análise de NMR. Em escalas maiores, a cristalização é muitas vezes uma alternativa conveniente. Em casos difíceis, preparativa ou semipreparativa alta cromatografia líquida (HPLC) pode ser empregada dependendo da quantidade desejada de composto isolado. Exemplos de processos de purificação a jusante para uma gama de compostos representativos podem ser encontrados em outro lugar8.
O protocolo atual, tal como apresentado aqui, é usado rotineiramente em nosso laboratório e tem provado a utilidade. No entanto, há ainda ampla margem para mais otimização da plataforma de expressão. Trabalho está em andamento em nosso laboratório para investigar como mais engenharia de via e controle diferencial de níveis de expressão da proteína poderia melhorar a produção de triterpeno ainda mais, enquanto mediando toxicidade às células hospedeiras. Há também potencial para investigar a manipulação de sistemas de transporte intracelular20,21e a direção de enzimas para diferentes compartimentos celulares22,23, avenidas que poderiam melhorar a eficiência de vários eventos de oxidação. Benefícios potenciais para modificar a morfologia subjacente de organelas chaves também podem ser explorados. Por exemplo, a superexpressão do domínio de membrana de Arabidopsis thaliana HMGR tem sido observado para induzir a hipertrofia do retículo endoplasmático em plantas24; um site fundamental para atividade CYP450. Este protocolo é ideal para a produção de miligrama de grama-escala as quantidades de produtos triterpeno e pode ser empregado em um ambiente de pesquisa para acessar compostos para estudo a jusante (por exemplo, a exploração sistemática de estrutura-atividade relacionamentos e investigações preliminares em que as propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas de chumbo compostos de interesse clínico). No entanto, a plataforma é linearmente e confiantemente escalável simplesmente aumentando o número de plantas usadas e o sentido prático da expressão transiente através de agroinfiltration foi demonstrada em escala industrial para a produção de proteínas farmacêuticas 14, portanto há potencial para esta plataforma a ser estendido para a produção comercial de triterpenos de alto valor. Como alternativa, também é possível vislumbrar a produção de transformants estável, carregando o desejo finalizado multigene biossintético, permitindo o cultivo em massa e continuou 'agricultura' de transgénicos N. benthamiana cepas produção de diferentes compostos de valor comercial.

Os triterpenos são uma das maiores e mais estruturalmente diversas famílias de produtos naturais. Apesar de sua imensa diversidade, todos os produtos naturais do triterpeno são acreditados para ser derivado do mesmo precursor linear 2,3-oxidosqualene, um produto da via do mevalonato em plantas. Ciclização de 2,3-oxidosqualene é iniciada e controlada por uma família de enzimas denominadas oxidosqualene cyclases (OSCs). Esta etapa de ciclização representa o primeiro nível de diversificação, com centenas de andaimes triterpeno diferentes tendo sido reportados de natureza1. Estes andaimes são ainda mais diversificados ajustando enzimas, incluindo, mas não limitado a, citocromo p450s (CYP450s)1,2. Tais vias biossintéticas podem levar a imensa complexidade, às vezes resultando em produtos finais que são quase irreconhecível de triterpeno o pai. Por exemplo, a estrutura complexa do potente inseticida e antialimentar limonoide azadiractina é acredita para derivar de um triterpeno fosfatase do tirucallane tipo3.
Muitos derivados triterpeno produtos naturais, mesmo aqueles com andaimes pai relativamente inalterado, demonstraram possuir atividade biológica medicinalmente relevantes4,5,6,7. No entanto, até agora este potencial não traduziu em uma infinidade de drogas derivadas do triterpene na clínica. Este é sem dúvida (pelo menos parcialmente) uma consequência de acesso limitado de sintético prático para essa classe de composto, um problema que pode suprimir a exploração das relações estrutura-atividade e desenvolvimento de levar candidatos pelo tradicional medicinais fluxos de trabalho de química.
Expressão transitória da triterpeno enzimas biossintéticas de outras espécies de plantas, em folhas de s. benthamiana pode desviar fontes endógenas de 2,3-oxidosqualene para a produção de novos produtos de alto valor triterpeno (Figura 1). Este processo pode ser usado para caracterizar funcionalmente enzimas candidato e reconstruir as vias biossintéticas de metabólitos importantes ocorrem naturalmente. De igual modo, também pode ser explorada em combinatórias abordagens biossintéticas para produzir produtos de romance triterpeno, uma estratégia que pode resultar em bibliotecas de análogos estruturalmente relacionadas, permitindo a exploração sistemática das relações estrutura-atividade de chumbo biologicamente ativo compostos de8,9.
Agroinfiltration é um meio eficiente e simples de alcançar a expressão transiente em folhas de s. benthamiana . O processo envolve a infiltração das folhas com uma suspensão de a. tumefaciens carregando a expressão binário construct(s) de interesse. Isto é conseguido através da aplicação de pressão que força o líquido sobre os estomas, deslocando o ar no espaço intercelular e substituí-lo com a suspensão da . tumefaciens . As bactérias transferem os respectivos DNAs-T para o interior das células vegetais, resultando na expressão de proteínas localizadas e transitória no tecido folha infiltrados.
Enquanto qualquer vetor binário adequado para gerar plantas transgênicas pode ser empregada para expressão transiente, nós utilizamos o feijão-caupi Mosaic Virus CPMV-derivado Hypertranslational (HT) proteína expressão sistema10, 11. neste sistema, o gene de interesse é ladeado por regiões untranslated (UTR) do RNA o CPMV-2. Os 5' UTR contém modificações, resultando em níveis muito elevados de translação de proteína com nenhuma dependência de replicação viral12. Esta técnica foi desenvolvida para a série de vetor binário de Easy-e-rápido (pEAQ) que inclui o site-specific recombinação clonagem compatível com o protocolo construções (pEAQ -HT- DEST)10,11. A maioria dos vetores pEAQ também contêm um tomate bushy stunt virus-derivado P19 silencioso supressor gene13 dentro a parte do T-DNA da fita expressão, que contorna a necessidade de coinfiltrate uma estirpe P19-carregando separada e proporciona muito expressão de proteínas de alto nível no acolhimento da planta célula10,11.
Uso do s. benthamiana , como um host de expressão tem vantagens particulares quando se trabalha com vias biossintéticas de planta. A arquitetura celular suporta intrinsecamente apropriado mRNA e processamento de proteína e compartimentalização adequada, além de possuir o necessárias co enzimas, redutases (para CYP450s) e precursores metabólicos. A fonte de carbono é fotossíntese; assim, as plantas simplesmente podem ser cultivadas em composto de boa qualidade, exigindo apenas água, CO2 (do ar) e luz solar como entradas. A plataforma também é extremamente conveniente para expressão co de diferentes combinações de proteínas, como isso pode ser conseguido facilely a infiltração de co de diferentes cepas de a. tumefaciens, eliminando a necessidade de construir grande expressão multigene fitas. Além disso, o processo pode ser linearmente e confiantemente escalado simplesmente aumentando o número de plantas utilizadas no experimento.
Trabalhos anteriores em nosso laboratório demonstrou a utilidade desta plataforma para experiências em escala preparativa. Isto incluiu a preparação de novos triterpenos para uso em ensaios de Bioatividade e escala até atingir quantidades de grama do produto isolado. Além disso, o acúmulo de produtos triterpeno heterogêneo pode ser aumentado vários dobram pela expressão co de uma forma N-terminal-truncada, diferenciação de gabarito de 3-hidroxi, 3-methyglutary-coenzima A redutase (tHMGR), um limitante upstream enzima na via do mevalonato8.
Chave para tais experiências em escala preparativa é a capacidade de convenientemente acima-escala o processo de infiltração. Em um experimento típico, dezenas a centenas de plantas podem ser necessária para alcançar a quantidade de destino do produto isolado. Infiltrando-se folhas individuais manualmente (usando uma seringa desnecessária) é operacionalmente exigentes e muitas vezes exageradamente demorado, tornando este método impraticável para escala-up de rotina. Infiltração de vácuo oferece vantagens sobre a infiltração de mão, pois não é dependente do nível de habilidade do operador e permite a infiltração de uma maior área de superfície da folha. Este procedimento é usado comercialmente para a produção em larga escala de proteínas farmacêutica14. Este protocolo utiliza um aparelho de infiltração facilmente replicável de vácuo, que pode ser construído a partir de peças disponíveis comercialmente. Isto permite a infiltração simultânea de até 4 plantas, proporcionando rápida e prática batch-wise infiltração de centenas de plantas em um curto período de tempo (Figura 2a -2b). O aparelho de vácuo infiltração consiste em um forno a vácuo que forma a câmara de infiltração (Figura 2f). O forno é ligado a uma bomba através de um reservatório de vácuo. Isso reduz muito o tempo necessário para atingir o vácuo desejado na câmara de infiltração. As plantas são fixadas em um suporte sob medido e invertidas em um banho de água de aço inoxidável de 10 L repleto da . tumefaciens suspensão (Figura 2a -2C). Imersão completa das partes aéreas das plantas é importante para a infiltração eficiente. O banho de água é então colocado dentro da câmara de infiltração (Figura 2d -2e) e o vácuo aplicado para desenhar o ar fora dos espaços intersticiais de folha. Uma vez que a pressão foi reduzida em 880 mbar (um processo que leva aproximadamente 1 min) câmara de infiltração é trazida rapidamente à pressão atmosférica 20-30 s, abrindo a válvula de entrada do forno, após infiltração é completa.
Cinco dias após a infiltração do material vegetal está pronto para colheita e subsequente de extração e isolamento do produto desejado. A partir deste ponto o processo é simplesmente um de extração de produtos naturais e purificação do material da folha, um fluxo de trabalho que é familiar para qualquer farmácia de produtos naturais. Muitos métodos diferentes para extração inicial e purificação subsequente existem15. A escolha mais adequada dos métodos e as condições exatas usadas é altamente dependente as propriedades químicas específicas do composto de interesse, além da disponibilidade de habilidades e/ou equipamento. Não é possível incluir no presente protocolo, um método totalmente generalizável, passo a passo para o processamento a jusante de material da folha da planta colhida ao produto isolado que pode ser seguido cegamente para qualquer produto triterpeno de interesse, nem seria apropriado para tentar fazê-lo. No entanto, este protocolo irá fornecer uma visão geral do fluxo de trabalho básico usado em nosso laboratório e alguns métodos para a fase inicial do processo, que, em nossa experiência provou generalizável para produtos de triterpeno aglicona mais oxigenados. Isso inclui duas técnicas relativamente incomuns, ou seja, extração de solvente pressurizado (PSE) e um método conveniente de fase heterogêneas para remoção de clorofila, utilizando uma resina de troca de íon fortemente básico.
PSE é uma técnica altamente eficiente para a extração de pequenas moléculas orgânicas de matrizes sólidas. As extrações são realizadas sob pressão (ca. 100-200 bar), a principal vantagem, sendo a capacidade de usar aliviadas temperaturas que excedam a ebulição ponto do solvente de extração. Isto pode significativamente reduzir o tempo e a quantidade de solvente necessária para alcançar uma extração exaustiva, quando comparado a outras técnicas de solventes quentes como refluxo simples ou Soxhlet extrações16. Instrumentos PSE de bancada comerciais estão disponíveis, que utilizam células de extração intercambiáveis e solvente automatizado, manipulação, aquecimento e monitoramento. Isto torna esta técnica extremamente conveniente. Também é indiscutivelmente menos nocivos, particularmente para os operadores com experiência limitada química prática.
Saponificação de extratos de folha crua sob refluxo seguido de particionamento de líquido/líquido é uma técnica comum para a remoção de massa de clorofilas antes da purificação subsequente ou análise. No entanto, isto pode muitas vezes ser operacionalmente exigentes em escalas maiores. Além disso, a deteção da interface, ou perda de produto devido à formação de emulsões pode ser problemática. A utilização de resinas de permuta iónica fortemente básicas para realizar a hidrólise heterogênea fase pode servir como uma alternativa conveniente. A porção pigmentada de clorofila a hidrolisado permanece aderida à resina e pode ser simplesmente removida por filtração. Este protocolo utiliza uma adaptação da escala preparativa de um procedimento analítico anteriormente relatados17 que emprega uma resina de troca iônica básicas disponíveis comercialmente.
Abaixo descrevemos um protocolo detalhado e rápido para a produção em escala preparativa de triterpenos utilizando esta plataforma baseada em vegetais. Este protocolo é usado rotineiramente em nosso laboratório para preparar dezenas a centenas de miligramas de produto triterpeno isolado para aplicações tal uma caracterização estrutural por espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR), e/ou um estudo mais aprofundado em funcional ensaios.

<table><tbody><tr><td>GC-MS instrument</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler suitable for performing PCR reactions</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Gel electrophoresis apparatus</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Adjustable air displacement micropipettes (Sizes : 1000 &amp;micro;L, 200 &amp;micro;L, 100 &amp;micro;L, 20 &amp;micro;L, 10 &amp;micro;L, and 2 &amp;micro;L )</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Wide top liquid nitrogen carrier (size: 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop microcentrifuge (Capacity: 24 x 1.5/2mL, Max. speed: =/&gt; 15000 rpm)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop centrifuge (Capacity: 20 x 50 mL, Max. speed: =/&gt; 4000 rpm)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Large Floor-standing centrifuge (Capacity: 4 x 1L, Max. speed: =/&gt; 4000 rpm)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Standing incubator</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Shaking incubator (Flask Clamp sizes: 10 mL, 50 mL, 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge bottles (1 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum infiltration apparatus</td><td>bespoke</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>9 x 9 cm plant pots</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Freeze drying apparatus (=/&gt; 8 litre condenser capacity)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Buchi SpeedExtractor 914 with 120 mL extraction cells (PSE instrument)</td><td>Buchi</td><td>SpeedExtractor E-914</td><td></td></tr><tr><td>Rotary evaporator apparatus</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Evaporation flasks (Sizes: 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Duran bottles (Sizes: 1 L, 10 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Conical flasks (Sizes 100 mL, 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Spatulas (assorted sizes)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Analytical balance (5 figures)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Balance (2 figures)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Measuring cylinders (10 mL, 100 mL, 1 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>A -80 freezer</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Biotage Isolera instrument with 250 mL collection rack and bottles (automated flash chromatography instrument</td><td>Biotage</td><td>ISO-1EW</td><td></td></tr><tr><td>Safety glasses</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Lab coat</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Consumables&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipette tips (Sizes : 1000 &amp;micro;L, 200 &amp;micro;L, 100 &amp;micro;L, 20 &amp;micro;L, 10 &amp;micro;L, and 2 &amp;micro;L )</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes (Size: 2 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tubes (Sizes: 15 mL, 50 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Transfer pipettes (size 2 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes (Size: 100 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Biotage&amp;reg; SNAP KP-SIL 100 g flash cartridges</td><td>Biotage</td><td>FSK0-1107-0100</td><td></td></tr><tr><td>HPLC vials (1 mL), vial inserts and caps</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Disposable purple nitrile gloves</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Top filter for E-914, cellulose</td><td>Buchi</td><td>51249</td><td></td></tr><tr><td>Bottom filter for E-916 / 914, glass fiber</td><td>Buchi</td><td>11055932</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quartz sand, 0.3 - 0.9 mm</td><td>Buchi</td><td>37689</td><td></td></tr><tr><td>Celite 545 (diatomaceous earth)</td><td>Simga-Alrich</td><td>22140-1KG-F</td><td></td></tr><tr><td>Silica gel 60 (0.040 -0.0063 mm)</td><td>Merck</td><td>1.09385.5000</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-morpholino)-ethanesulphonic acid</td><td>Melford</td><td>B2002</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Simga-Alrich</td><td>208337-100G</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Simga-Alrich</td><td>60377-1KG</td><td></td></tr><tr><td>3&amp;rsquo;5&amp;rsquo;-dimethoxy-4&amp;rsquo;-acetophenone (acetosyringone)</td><td>Simga-Alrich</td><td>D134406-1G</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60836</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>Gibco</td><td>11815-032</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Simga-Alrich</td><td>S6501-100G</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>MP biomedicals</td><td>190057</td><td></td></tr><tr><td>Agarose LE gel</td><td>Melford</td><td>MB1203</td><td></td></tr><tr><td>LB broth Millar</td><td>Simga-Alrich</td><td>L3522-250G</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Simga-Alrich</td><td>A5306-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Simga-Alrich</td><td>S5886-500G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Simga-Alrich</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Alrich</td><td>M2773-500G</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Alrich</td><td>G7021-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ambersep&amp;reg;&amp;nbsp;900 hydroxide (basic ion exchange resin)</td><td>Sigma-Alrich</td><td>06476-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Fisher</td><td>H/0406/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl acetate</td><td>Fisher</td><td>E/0900/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Fisher</td><td>D/1852/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>M/4056/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Sigma-Alrich</td><td>E7637-1G</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>20821-330</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q water</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Levington F1 Compost</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Levington F2 Compost</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (Plasmid purification kit).</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alpha Competent E. coli</td><td>Supplier New England Biolabs Ltd</td><td>C2987I</td><td></td></tr><tr><td>pEAQ-HT-DEST1 vector</td><td>Lomonossoff laboratory John Innes Center</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>pDONR207</td><td>Thermo-Fisher</td><td>pDONR207</td><td></td></tr><tr><td>A. tumefaciens LBA4404</td><td>Thermo-Fisher</td><td>18313015</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY LR CLONASE(tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11791020</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY BP CLONASE (tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11789020</td><td></td></tr><tr><td>GO TAQ G2 GREEN MASTER MIX</td><td>Promega UK Ltd</td><td>M7822</td><td></td></tr><tr><td>PHUSION HIGH FIDELITY DNA POLYMERASE</td><td>New England Biolabs Ltd</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP SET 100mm</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>RNEASY PLANT MINI KIT</td><td>Qiagen Ltd</td><td>74904</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 RNASE-FREE DNASE</td><td>Promega UK Ltd</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen SuperScript III First-Strand Synthesis System</td><td>Fisher</td><td>10308632</td><td></td></tr><tr><td>Trytone</td><td>Sigma-Alrich</td><td>T7293-250G</td><td></td></tr><tr><td>Nicotiana benthamiana seeds</td><td>any reputable supplier</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

transient expression in nicotiana benthamiana leaves for triterpene production at a preparative scale

Os triterpenos são uma das maiores e mais estruturalmente diversas famílias de produtos naturais. Muitos derivados de triterpeno demonstraram possuir atividade biológica medicinalmente relevante. No entanto, até agora este potencial não traduziu em uma infinidade de drogas derivadas do triterpene na clínica. Este é sem dúvida (pelo menos parcialmente) uma consequência de acesso limitado de sintético prático para essa classe de composto, um problema que pode suprimir a exploração das relações estrutura-atividade e desenvolvimento de levar candidatos pelo tradicional medicinais fluxos de trabalho de química. Apesar de sua imensa diversidade, triterpenos são derivados de um precursor único e linear, 2,3-oxidosqualene. Expressão heteróloga transitória de enzimas biossintéticas em s. benthamiana pode desviar fontes endógenas de 2,3-oxidosqualene para a produção de novos produtos de alto valor triterpeno que não são produzidos naturalmente por esse host. Agro-infiltração é um meio eficiente e simples de alcançar a expressão transiente em s. benthamiana. O processo envolve a infiltração de folhas de plantas com uma suspensão de Agrobacterium tumefaciens , carregando o construct(s) expressão de interesse. Co infiltração de um adicional a. tumefaciens estirpe carregando uma expressão construção codificação uma enzima que aumenta significativamente o fornecimento de precursor aumenta rendimentos. Após um período de cinco dias, o material da folha infiltrados pode ser colhido e processado para extrair e isolar o produto (s) triterpeno resultante. Este é um processo que é linearmente e confiantemente escalável, simplesmente aumentando o número de plantas utilizadas no experimento. Aqui é descrito um protocolo para produção em escala preparativa rápida de triterpenos utilizando esta plataforma baseada em vegetais. O protocolo utiliza um aparelho facilmente replicável infiltração de vácuo, que permite a infiltração simultânea de até quatro plantas, permitindo a infiltração batch-wise de centenas de plantas em um curto período de tempo.

Típicos rendimentos isolados são dependentes da combinação enzima/enzima sob investigação, a estabilidade química do composto alvo, e como foi o desafio do processo de purificação. Informamos anteriormente isolados rendimentos de β-amirina derivados de nossas experiências de biossíntese combinatorial variando de 0,12 a 3,87 mg por grama de seco em pó de folha de s. benthamiana . Estes compostos variaram amplamente no nível de oxidação e incluíram antinaturais combinações de enzimas (Figura 3)8. Este protocolo é usado rotineiramente em nosso laboratório para produzir dezenas ou centenas de miligramas de produto purificado para caracterização estrutural por espectroscopia RMN e ensaios funcionais a jusante. Também demonstrámos o utilitário preparativa desta plataforma, produzindo 0,8 g do triterpeno andaime β-amirina em um grau de pureza superior a 98%. Este experimento 459 plantas usadas e representa um rendimento isolado de 3,3 mg por grama de seco N. benthamiana folha pó8.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig1.jpg"> Figura 1: Resumo esquemático. Representação esquemática do processo de exploração expressão transiente de enzimas biossintéticas na folha de s. benthamiana para desviar fontes endógenas de 2,3-oxidosqualene para produção de novos produtos de alto valor triterpeno preparativa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig2.jpg"> Figura 2: vácuo infiltrador construção e processo. um) Bespoke planta titular uma ala separada. asas da titular da planta b) Bespoke anexadas. c) inversão e submersão das plantas. d) inserção do banho de infiltração. banho e) infiltração no lugar dentro da câmara de infiltração. f) Complete infiltrador de vácuo: bomba de vácuo (1) (2) Conexão da bomba de vácuo, a válvula de isolamento do reservatório de vácuo (3) vácuo reservatório (4) a Conexão entre o reservatório de vácuo e a válvula de admissão de ar (5) medidor de pressão (6) (7) infiltração câmara Reservatório de vácuo de câmara (8) infiltração. g) representante folhas de uma planta, infiltrou-se com uma expressão de construção para a proteína verde fluorescente (GFP), após crescimento de infiltração após cinco dias. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig3.jpg"> Figura 3: anteriormente relatados resultados representativos para a produção preparativa de derivados de β-amirina usando este protocolo8. Esta tabela é ordenada por rendimentos isolados. Colunas são formatadas condicionalmente com indicação de cor de valor relativo. Vermelho = alta, verde = baixa (embora intermediário amarelo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Expressão transiente em Nicotiana Benthamiana deixa triterpeno produção em escala preparativa

Expressão heteróloga transitória de enzimas biossintéticas em folhas de Nicotiana benthamiana pode desviar fontes endógenas de 2,3-oxidosqualene para a produção de novos produtos de alto valor triterpeno. Aqui é descrito um protocolo detalhado para produção em escala preparativa rápida (5 dias) de triterpenos e analogs utilizando esta poderosa plataforma baseada em vegetais.

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

transient-expression-nicotiana-benthamiana-leaves-for-triterpene

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

17.2K visualizações.  John Innes Centre. Expressão heteróloga transitória de enzimas biossintéticas em folhas de Nicotiana benthamiana pode desviar fontes endógenas de 2,3-oxidosqualene para a produção de novos produtos de alto valor triterpeno. Aqui é descrito um protocolo detalhado para produção em escala preparativa rápida (5 dias) de triterpenos e analogs utilizando esta poderosa plataforma baseada em vegetais.

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Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

Expressão Gênica transiente em tabaco usando Assembleia Gibson eo Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Ambiente

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture organisms, such as hyphae-building fungi and anaerobic bacteria, has hastened the use of recombinant technologies in this field. Plant expression methods are a desirable system for large-scale production of enzymes and other industrially useful proteins. Herein, methods for the transient expression of a fungal endoglucanase, Trichoderma reesei Cel5A, in Nicotiana tabacum are demonstrated. Successful protein expression is shown, monitored by fluorescence using an mCherry-enzyme fusion protein. Additionally, a set of basic tests are used to examine the activity of transiently expressed T. reesei Cel5A, including SDS-PAGE, Western blotting, zymography, as well as&#160;fluorescence and dye-based substrate degradation assays. The system described here can be used to produce an active cellulase in a short time period, so as to assess the potential for further production in plants through constitutive or inducible expression systems.

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Tobacco plants were used to produce a fungal cellulase, TrCel5A, via a transient expression system. The expression could be monitored using a fluorescent fusion protein, and the protein activity was characterized post-expression.

Expressão da proteína recombinante a partir da celulase Cel5A<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; Em Plantas de tabaco

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug used to treat depression and anxiety by binding to the serotonin transporter with high-affinity, blocking serotonin reuptake. Here we report an efficient procedure and a set of tools to stabilize, express, purify, and crystallize serotonin transporter-antibody complexes bound to S-citalopram and other antidepressants. Mutations which stabilize the serotonin transporter were identified using an S-citalopram binding assay. Serotonin transporter expressed in baculovirus-transduced HEK293S GnTI- cells, was reconstituted into proteoliposomes and used to raise high-affinity antibodies. We have developed a strategy to discover antibodies that are useful for structural studies. A straightforward approach for the expression of antibody fragments in Sf9 cells has also been established. Transporter-antibody complexes purified using this procedure are well-behaved and readily crystallize, producing complexes with S-citalopram that diffract X-rays to 3-4 &#197; resolution. The strategies developed here can be utilized to determine the structure of other challenging membrane proteins.

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

This manuscript describes how to screen for thermostabilizing mutations, purify the human serotonin transporter, generate high affinity antibodies, and crystallize the serotonin transporter-antibody complex bound to the antidepressant drug S-citalopram. This protocol can be adapted to the study of other challenging membrane transporters, receptors, and channels.

Termoestabilização, expressão, purificação e cristalização do transportador de serotonina humano Bound to<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Bioquímica

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological functions in developmental processes, interorganismal interactions, and environmental adaptation. Due to these various bioactivities, many diterpenoids are also of economic importance as pharmaceuticals, food additives, biofuels, and other bioproducts. Advanced genomics and biochemical approaches have enabled a rapid increase in the knowledge of diterpenoid-metabolic genes, enzymes, and pathways. However, the structural complexity of diterpenoids and the narrow taxonomic distribution of individual compounds in often only a single species remain constraining factors for their efficient production. Availability of a broader range of metabolic enzymes now provide resources for producing diterpenoids in sufficient titers and purity to facilitate a deeper investigation of this important metabolite group. Drawing on established tools for microbial and plant-based enzyme co-expression, we present an easily operated and customizable protocol for the enzymatic production of diterpenoids in either Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, and the purification of desired products via silica chromatography and semi-preparative HPLC. Using the group of maize (Zea mays) dolabralexin diterpenoids as an example, we highlight how modular combinations of diterpene synthase (diTPS) and cytochrome P450 monooxygenase (P450) enzymes can be used to generate different diterpenoid scaffolds. Purified compounds can be used in various downstream applications, such as metabolite structural analyses, enzyme structure-function studies, and in vitro and in planta bioactivity experiments.

Here we present easy to use protocols for producing and purifying diterpenoid metabolites through the combinatorial expression of biosynthetic enzymes in Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, followed by chromatographic product purification. The resulting metabolites are suitable for various studies including molecular structure characterization, enzyme functional studies, and bioactivity assays.

Uma abordagem personalizável para a produção enzimática e purificação de produtos naturais de Diterpenóides

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Agroinfiltration eficiente de plantas para alto nível de expressão transiente de proteínas recombinantes

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Biologia

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short period of time. However, this technology is only just beginning to be applied to large-scale production as many technological obstacles to scale up are now being overcome. Here, we demonstrate a simple and reproducible method for industrial-scale transient protein production based on vacuum infiltration of Nicotiana plants with Agrobacteria carrying launch vectors. Optimization of Agrobacterium cultivation in AB medium allows direct dilution of the bacterial culture in Milli-Q water, simplifying the infiltration process. Among three tested species of Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana &#215; N. excelsior) was selected as the most promising host due to the ease of infiltration, high level of reporter protein production, and about two-fold higher biomass production under controlled environmental conditions. Induction of Agrobacterium harboring pBID4-GFP (Tobacco mosaic virus-based) using chemicals such as acetosyringone and monosaccharide had no effect on the protein production level. Infiltrating plant under 50 to 100 mbar for 30 or 60 sec resulted in about 95% infiltration of plant leaf tissues. Infiltration with Agrobacterium laboratory strain GV3101 showed the highest protein production compared to Agrobacteria laboratory strains LBA4404 and C58C1 and wild-type Agrobacteria strains at6, at10, at77 and A4. Co-expression of a viral RNA silencing suppressor, p23 or p19, in N. benthamiana resulted in earlier accumulation and increased production (15-25%) of target protein (influenza virus hemagglutinin).

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Transient protein production in Nicotiana plants based on vacuum infiltration with Agrobacteria carrying launch vectors (Tobacco mosaic virus-based) is a rapid and economic approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins. We simplified the procedure and improved target accumulation by optimizing conditions of bacteria cultivation, selecting host species, and co-introducing RNA silencing suppressors.

Otimização e Utilização de<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Mediada produção de proteína transiente em<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the flexible, low-cost production of high-quality, bioactive products.
In this study, we compared the expression of a target human recombinant protein in traditional fermenter-based cell cultures (bacterial and insect) with plant-based expression systems, both transient and stable.
For each platform, we described the set-up, optimization and length of the production process, the final product quality and the yields and we evaluated provisional production costs, specific for the selected target recombinant protein.
Overall, our results indicate that bacteria are unsuitable for the production of the target protein due to its accumulation within insoluble inclusion bodies. On the other hand, plant-based systems are versatile platforms that allow the production of the selected protein at lower-costs than Baculovirus/insect cell system. In particular, stable transgenic lines displayed the highest-yield of the final product and transient expressing plants the fastest process development. However, not all recombinant proteins may benefit from plant-based systems but the best production platform should be determined empirically with a case-by-case approach, as described here.

In this study the expression of a target human recombinant protein in different production platforms was compared. We focused on traditional fermenter-based cultures and on plants, describing the set-up of each system and highlighting, on the basis of the reported results, the inherent limits and advantages for each platform.

Uma análise comparativa de Expressão de proteínas recombinantes em Diferentes biofábricas: bactérias, células de insectos e Sistemas de Plantas

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

Luciferase complementação Imaging ensaio em folhas de Nicotiana benthamiana de transitoriamente determinação dinâmica da interação da proteína-proteína

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing need in developing efficient methods for recombinant antibody production. As of 2019, there were more than 70 FDA-approved monoclonal antibodies, and there is exponential growth potential. Despite their promise, limiting factors for widespread use are manufacturing costs and complexity. Potentially, plants offer low-cost, safe, and easily scalable protein manufacturing&#160;strategies. Plants like Nicotiana benthamiana not only can correctly fold and assemble complex mammalian proteins but also can add critical post-translational modifications similar to those offered by mammalian cell cultures. In this work, by using native GFP and an acid-stable variant of green fluorescent protein (GFP) fused to human monoclonal antibodies, we were able to visualize the entire transient antibody expression and purification process from N. benthamiana plants. Depending on the experiment&#39;s purpose, native GFP fusion can ensure easier visualization during the expression phase in the plants, while acid-stable GFP fusion allows for visualization during downstream processing. This scalable and straightforward procedure can be performed by a single researcher to produce milligram quantities of highly pure antibody or antibody fusion proteins in a matter of days using only a few small plants. Such a technique can be extended to the visualization of any type of antibody purification process and potentially many other proteins, both in plant and other expression systems. Moreover, these techniques can benefit virtual instructions and be executed in a teaching laboratory by undergraduate students possessing minimal prior experience with molecular biology techniques, providing a foundation for project-based exploration with real-world applications.

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

We describe here a simple method for expression, extraction, and purification of recombinant human IgG fused to GFP in Nicotiana benthamiana. This protocol can be extended to purification and visualization of numerous proteins that utilize column chromatography. Moreover, the protocol is adaptable to the in-person and virtual college teaching laboratory, providing project-based exploration.

Produção de Proteínas IgG Fusion Transitóriamente Expressa em Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

Extração e purificação eficientes de GFP-His de folhas de N. benthamiana

Apoplast-Extraction Based Method to Improve the Purity of Plant Produced Recombinant Protein

Plants are a newly developing eukaryotic expression system being explored to produce therapeutic proteins. Purification of recombinant proteins from plants is one of the most critical steps in the production process. Typically, proteins were purified from total soluble proteins (TSP), and the presence of miscellaneous intracellular proteins and cytochromes poses challenges for subsequent protein purification steps. Moreover, most therapeutic proteins like antigens and antibodies are secreted to obtain proper glycosylation, and the presence of incompletely modified proteins leads to inconsistent antigen or antibody structures. This work introduces a more effective method to obtain highly purified recombinant proteins from the plant apoplastic space. The recombinant Green fluorescent protein (GFP) is engineered to be secreted into the apoplast of Nicotiana benthamiana and is then extracted using an infiltration-centrifugation method. The GFP-His from the extracted apoplast is then purified by nickel affinity chromatography. In contrast to the traditional methods from TSP, purification from the apoplast produces highly purified recombinant proteins. This represents an important technological improvement for plant production systems.

Autor em destaque: Otimizando a extração de proteínas Apoplast para recuperação eficiente de proteínas recombinantes de células vegetais

The purification of recombinant proteins from plant systems is usually challenged by plant proteins. This work provides a method to effectively extract and purify a secreted recombinant protein from the apoplast of Nicotiana benthamiana.

Método baseado em extração de apoplastos para melhorar a pureza da proteína recombinante produzida pela planta  

Plants are a newly developing eukaryotic expression system being explored to produce therapeutic proteins. Purification of recombinant proteins from ...

Expressão transiente em Nicotiana Benthamiana deixa triterpeno produção em escala preparativa

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