Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo do cloroplasto, por exemplo, a composição do maquinário de importação de proteínas cloroplastas. É essencial para o esverdeamento e fotossíntese e, portanto, para a produção de alimentos no planeta. A máquina molecular consiste em dois complexos separados no membro externo e interno do cloroplasto chamado TOC e TIC, mas a composição não é totalmente conhecida.
A principal vantagem desta técnica é que a purificação do complexo Arabidopsis TOC/TIC pode ser realizada em um método de purificação de uma única etapa, purificação tap-toc. É um método específico e eficiente. Geralmente, pesquisadores novos neste método podem lutar porque não estão familiarizados com o isolamento de frações de membrana de cloroplasto, detergente, solubilização ou purificação de afinidade.
Depois de preparar as plantas arabidopsis, triture 10 gramas de mudas de três semanas de idade em nitrogênio líquido, usando uma argamassa fria e pilão com areia. Adicione 20 mililitros de tampão de moagem a frio aos tecidos moído. Misture bem e deixe a mistura descongelar no gelo.
Em seguida, mergulhe duas camadas de material de filtragem rápida com tampão de moagem. Filtre o homogeneizar através das duas camadas de material de filtragem em um tubo de centrífuga cônica de 50 mililitros. Centrifugar o filtrado a 1.500 vezes g em quatro graus Celsius por 10 minutos e transferir o supernasal para um tubo de centrífuga córica fresco de 50 mililitros.
Repita a centrifugação mais uma vez nas mesmas condições. Transfira o supernatante para um tubo de ultracentrifuge frio de 38,50 mililitros e cubra-o até 35 mililitros com tampão de moagem a frio. Use uma ultracentrifugação para centrifugar a amostra a 100.000 vezes g e quatro graus Celsius durante uma hora.
Usando um homogeneizador de Teflon de vidro, resuspenque a pelota verde no tampão de moagem. Centrifugar a 100.000 vezes g e quatro graus Celsius por uma hora e descartar o supernaspe. Use o homogeneizador de teflon de vidro para resuspensar a pelota verde em 18,75 mililitros de um x tampão de moagem.
Em seguida, adicione outros 9.375 mililitros de um x buffer de moagem. Adicione 9.375 mililitros de quatro x solução de solubilização para trazer o volume final para 37,5 mililitros e incubar em um agitador rotativo a quatro graus Celsius por 30 minutos. Depois disso, use uma ultracentrifugação para centrifugar a amostra a 100.000 vezes g e quatro graus Celsius por uma hora.
Transfira o supernatante contendo as membranas solubilizadas para um tubo de centrífuga cônica fresco de 50 mililitros. Depois de preparar a resina de agarose IGG, transfira a resina de agarose IGG anteriormente lavada para o tubo cônico de 50 mililitros contendo os 37,5 mililitros de membranas solubilizadas anteriormente lavadas. Incubar durante a noite em um shaker rotativo a quatro graus Celsius.
No dia seguinte, sedimente a resina IGG agarose a 100 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos. Use uma pipeta para remover o supernatante. Foi a resina de agarose IGG em 37,5 mililitros de tampão A e incubar em um shaker rotativo à temperatura ambiente por 10 minutos.
Continue sedimentando e lavando a resina conforme descrito no protocolo de texto. Depois disso, transfira a resina de agarose IGG para uma coluna de giro de 500 microliter com um filtro de 35 mícrons. Lave as contas duas vezes com 300 microliters de tampão de eluição TEV para equilíbrio.
Em seguida, adicione 300 microliters de tampão de eluição TEV contêm 10 microliters de protease TEV. Incubar a coluna de giro com contas em um Thermomixer a 16 graus Celsius e 350 rpm por duas horas. Em seguida, abra a coluna de giro e coloque-a em um tubo novo, limpo, de 1,5 mililitro.
Gire este tubo a 100 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos para coletar o elunato. Neste estudo, um complexo proteico de envelope de cloroplasto da TAP das plantas transgênicas A.thaliana é purificado. A análise do imunoblot confirma que o isolar o TAP-TOC159 interage com TOC75 e TOC33 do complexo TOC.
A quinase da membrana externa do cloroplasto, KOC1, que é conhecida por fosforilato TOC159 também é co-isolada. A presença do TIC110 revela que o complexo isolado TAP-TOC159 também contém os componentes do complexo TIC. O anticorpo FBN1A não reconheceu o complexo TAP-TOC159, indicando a ausência de contaminações.
No controle negativo, a proteína NTAP imunoprecipitada não co-isolou com nenhuma das proteínas TOC, TIC e confirma a especificidade da purificação TAP-TOC159. Embora este método possa fornecer informações sobre a importação de proteínas de cloroplasto, ele pode potencialmente ser aplicado a qualquer outro complexo no sistema de garrafas Arabidopsis thaliana. Após este procedimento, outros métodos podem ser aplicados, como manchas ocidentais ou espectrometria de massa para demonstrar a presença de componentes conhecidos ou identificar novos componentes dos complexos TOC e TIC.
Esta técnica abriu caminho para a pesquisa no campo de importação de proteínas cloroplásticas para explorar a função de novos componentes dos complexos TOC e TIC.
