A disfunção do locus coeruleus tem sido implicada em distúrbios neurológicos e neuropsiquiátricos, incluindo doença de Parkinson, doença de Alzheimer, depressão, transtorno bipolar e ansiedade. Dadas essas funções, a análise do lócus coeruleus é crucial para estudar sua função e disfunção. Durante a seção cerebral do camundongo, o lócus coeruleus pode ser facilmente perdido em seções coronais ou sagiais devido ao seu pequeno tamanho.
Assim, para oferecer orientação para a localização do locus coeruleus, descrevemos um protocolo que desenvolvemos para localizar essa região no cérebro do camundongo para diversas aplicações. Comece colocando cérebro recém-isolado de um camundongo anestesiado e depois perfumado em 4% PFA em um tubo de 50 mililitros. Incubar o cérebro por 24 horas a 4 graus Celsius.
Use fórceps para transferir o cérebro para um tubo cônico de 50 mililitros cheio de 25 mililitros de solução de 30% de sacarose. Incuba-o a 4 graus Celsius por 48 a 72 horas até que o cérebro afunde no fundo do tubo. Para incorporar a seção do tronco cerebral, coloque sua superfície cortada na parte inferior de um molde de incorporação, e adicione o composto de temperatura de corte ideal para cercar o tronco cerebral.
Congele o cérebro embutido em um congelador de menos 80 graus Celsius por pelo menos 12 horas até que use mais. Coloque o molde com o cérebro no criostat e incuba-o por várias horas para ajustar sua temperatura à do criostat. Para expor o bloco de OCT contendo o cérebro, use uma lâmina de barbear para cortar as quatro bordas do molde até o fundo, e depois retire o molde de incorporação dele.
Use lâminas de barbear para remover o excesso de OCT da superfície do bloco, certificando-se de não tocar no cérebro. Em seguida, monte o bloco oct no mandril do criostat, expondo a superfície cortada do cérebro em direção à frente. Para ajustar o cérebro, oriente a superfície de corte paralela às lâminas de barbear do criostat.
Orientar adequadamente o espécime é um passo crucial neste protocolo. Como estamos usando características anatômicas da superfície dorsal do cérebro para localizar LC, como limite entre cerebelo e coloculus inferior, é importante que as seções estejam alinhadas corretamente. Isso requer cuidado em colocar adequadamente o cérebro na matriz de cortador cerebral do camundongo.
Corte o cérebro começando na medula, cortando seções de 100 micrômetros rostrally. Uma vez que o cerebelo e o tronco cerebral comecem a cortar como uma fatia contínua ao nível do quarto ventrículo, comece a coletar fatias com espessura de 50 micrômetros. Use fórceps para coletar cada fatia cerebral e colocá-la em um poço de uma placa de 24 poços cheia de PBS.
O lócus coeruleus será mais perceptível em uma fatia onde o cerebelo e o colliculus inferior se encontram a cerca de 5,52 milímetros posteriores de bregma. No primeiro dia, lave as fatias cerebrais na placa de 24 poços três vezes por cinco minutos cada na PBS. Em seguida, adicione 0,5% PBS com detergente e permeabiliza-os a quatro graus Celsius por 24 horas.
No dia seguinte, lave as fatias três vezes por cinco minutos cada uma com 0,5% de PBSD. Em seguida, adicione o anticorpo primário a uma diluição de um a 500 em 0,5% PBSD e incubar a quatro graus Celsius por 18 horas. No terceiro dia, lave as fatias três vezes por 10 minutos cada uma com 0,5% de PBSD, em seguida, adicione o anticorpo secundário a uma diluição de um a 1000 em 0,5%PBSD.
Enrole a placa com papel alumínio e incubar a quatro graus Celsius por 16 horas. Após a incubação, lave as fatias três vezes por cinco minutos cada uma com 0,5% de PBSD e, em seguida, por cinco minutos na PBS. Cubra as seções usando meio de montagem de conjunto rígido sem DAPI.
Cubra com uma tampa de vidro e seque por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, use um microscópio confocal com configurações para detectar sinal do comprimento de onda de fluorescência apropriado para cortar o cérebro da imagem. Depois de ajustar o microscópio ao plano focal da fatia cerebral, use 10 vezes a ampliação para tirar uma única imagem.
Use o quarto ventrículo localizado abaixo do cerebelo e acima de pons e tronco cerebral para localizar uma possível região de LC na fatia cerebral. Concentre-se nas bordas laterais do quarto ventrículo e a LC estará localizada a partir das bordas do quarto ventrículo e apontando para a região do tronco cerebral dos pons. A distribuição intracelular da dopamina beta-hidroxilase, proteína expressa na LC, foi avaliada utilizando este protocolo para estudar a morfologia lc e a densidade neuronal.
Outra proteína expressa na LC, a hidroxilase de tyrosina, também mostrou um forte sinal fluorescente verde em fatias cerebrais contendo o LC.Alterações na homeostase metálica são frequentemente observadas em distúrbios neurológicos, incluindo alterações na LC.In este exemplo, quando uma fatia cerebral cortada através da LC foi medida para fosfato, potássio, zinco e cobre, apenas o cobre mostrou um aumento específico do sinal. Recomendamos cortar cerca de 500 mícrons mais tecido anterior e posterior para LC para evitar a falta do núcleo, e cortar mais seções do que o necessário, especialmente se a primeira vez realizar este protocolo. Um estudo cuidadoso das imagens do atlas cerebral antes da coloração é muito útil.
Uma vez que a LC é localizada por imunohistoquímica, fatias cerebrais adjacentes podem ser usadas para estudos posteriores, incluindo análise morfológica e metabólica, bem como estudos de imagem metálica através de microscopia de fluorescência de raios-X. As seções cerebrais geradas usando o protocolo descrito podem ser usadas para quantificar os níveis de cobre e outros metais na LC e compará-los com os níveis em regiões fora da LC, o que é necessário para a compreensão do mecanismo da doença. Outras aplicações possíveis deste protocolo incluem a detecção de abundância e distribuição intracelular de dopamina beta-hidroxilase, hidroxilase de tyrosina e outras proteínas expressas na LC individualmente, ou nos ensaios de co-coloração, estudos de morfologia LC e densidade neuronal.
