Authors would like to thank Charisse Montgomery for her editing service. A. Alomran&#8217;s work partially fulfills the requirements for a master&#8217;s degree in Pharmacology.This work is funded by The University of Toledo&#8217;s intramural startup fund for W.A.A and NIH grant (DK080640) for S.M.N.

Os procedimentos para o uso de animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal Institucional (IACUC) da Universidade de Toledo, em conformidade com as orientações do Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional dos Institutos Nacionais de Saúde e do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. 1. Extração de cérebro, Seccionamento e Preparação de tecidos <ol><li> Sacrifício de tipo selvagem estirpe de ratinhos C57BL / 6 por profundamente eutanásia com CO2 asfixia por 5 min. Assegurar morte por deslocamento cervical. </li><li> Limpe a cabeça de rato com etanol 70%. </li><li> Execute craniectomia usando tesouras e pinças esterilizadas por primeira puxando a pele fora, começando com o topo da cabeça para expor o crânio. </li><li> Então, quando o crânio é exposta, remover o crânio por raspagem a peça-a-peça óssea, a partir do lado posterior e movendo-se para o lado anterior. Seja cauteloso para não destruir os ventrículos cerebrais. </li><li>Recolher todo o cérebro. </li><li> Inserir o cérebro em um prato de 100 milímetros de Petri contendo DMEM / alta de glucose suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e solução de penicilina / estreptomicina a 1% contendo 10.000 unidades / ml de penicilina e 10.000 ug / ml de estreptomicina e pré-aquecido a 37 ° C. </li><li> Corte o cérebro sobre o plano sagital mediano à mão com uma lâmina afiada, e obter a primeira seção de 100-200 mm de cada metade usando um vibratome. </li><li> Lavar o tecido cerebral com uma solução pré-aquecida até 37 ° C de fosfato tamponado salino (PBS 1x). </li><li> Colocar imediatamente a secção do cérebro em meio DMEM / Glucose de alta pré-aquecido a 37 ° C. </li></ol> 2. Ao vivo de imagem Configuração e instalação <ol><li> Coloque as secções de tecido de cérebro em placas de cultura de 30 milímetros de fundo de vidro contendo 1 ml de meio DMEM / alta concentração de glicose. Ajuste ambiente câmara fechada do microscópio a 37 ° C, 95% / 5% de O2 / CO2 teor (Figura 1 </strong&gt;). </li><li> Usando uma lente de imersão em óleo objetivo 60X, recolher as células ependimárias / imagens cílios colocando primeiro uma gota de óleo na lente objetiva 60X e incidindo sobre as células com DIC normal transmitida luz. </li><li> Em seguida, segue a direcção do movimento da bolha de DMEM como um guia para a localização dos cílios ependimária móveis como agressões ciliares criar uma espécie de movimento de espuma na área. Escolha uma área que contém as células saudáveis ​​com cílios móveis no ventrículo lateral do cérebro usando o filtro DIC. Uma vez que o cílios ependimária são encontrados, ajustar a luz e concentrar para se obter uma imagem satisfatória. </li><li> Defina os parâmetros de imagem ao vivo de acordo com um propósito específico usando software de imagem Metamorph. No presente demonstração, adquirir vinte imagens de quatro bits com o conjunto de binning câmera para 1 x 1 combinado com 60X objetiva e 5-10 tempo de exposição ms. </li><li> Recolher as imagens DIC abrindo a abertura microscópio para um nível óptimo de forma a ter um mínimo de exposure tempo. Observe as imagens ao vivo da câmera para fornecer aquisição de imagem rápida e imediata, sem atraso. Calcula-se a velocidade de batimento ciliar com base no requisito de os tempos de exposição mínimos a obter suficiente contraste de imagem. </li></ol> 3. Visualização e Análise de Dados <ol><li> Calcular o número de batimentos ciliares através da contagem do número de pancadas em 1 min. Para fazer isso, diminuindo a velocidade de vídeo e contando o número de batidas, utilizando um contador de células ou ferramenta semelhante. </li><li> Para calcular a frequência de espancamentos, multiplicar o tempo de exposição em que o vídeo é gravado pelo número de quadros ou imagens de lapso de tempo adquiridos para obter o número de segundos. (Exemplo: o tempo de exposição 5 ms 200 frames = 1.000 ms ou 1 seg). </li><li> Calcular o número de pancadas em um segundo para obter a frequência que é expressa como o número de bater por uma seg. Fazer isso através da divisão do número de espancamentos cílios mais de um segundo de tempo entreval (Exemplo: cílios bate 50 vezes em um vídeo gravado em 200 frames tempo de exposição de 5 ms ou seja, 5 ms x 200 quadros = 1 seg; agora dividir 50 batimentos por 1 segundo = 50 Hz). </li><li> Calcule o ângulo de batimento ciliar por avaliar o caminho percorrido pelos cílios ependymal durante tanto os cursos de potência e recuperação. Executar esta de acordo com um método previamente descrito, com modificações menores 11. O movimento preciso de cílios individual é observada durante o ciclo de batimento completa. </li><li> Numa folha de etilo colocado sobre o monitor, desenhar uma linha horizontal ao longo da borda ependimal e uma linha vertical através da posição de linha média dos cílios no início do curso de expansão. </li><li> Traçar a posição precisa do quadro a quadro cílio como ele se move para a frente durante o golpe de energia. De um modo semelhante, o movimento de traçar o cílios durante o curso de recuperação. </li><li> Calcule o ângulo de batimento ciliar do desvio máximo do cílio da linha média durante tele curso de potência, bem como o curso de recuperação. </li></ol> 4. O cálcio gravação de sinal <ol><li> Depois de cortar o cérebro, brevemente enxaguado a fatia de cérebro com 1x PBS ou PBS de Dulbecco (pH 7,0). Preparar uma solução fresca de Fluo-2 para evitar a extinção de fluorescência e para obter uma boa relação sinal-para-ruído. </li><li> Preparar uma solução-mãe mM de Fluo-2 solução em dimetilsulfóxido (DMSO), misturar e agitar com vortex a solução durante pelo menos 5 minutos para assegurar que Fluo-2 é homogeneamente dissolvido em DMSO. </li><li> Dilui-se a solução stock de Fluo-2 em 500 ml de DMEM / alta de glucose suplementado com 2% B27 pré-aquecido a 37 ° C, a uma concentração final de 20 mg / ml. NOTA: B-27 é um suplemento sem soro optimizado contendo vitamina A, antioxidantes e cocktail de insulina usado para suportar a viabilidade a curto ou a longo prazo do hipocampo e outros neurónios do SNC. </li><li> Incubar imediatamente a fatia de cérebro com 20 mg / ml de Fluo-2 durante 30 min a 37 ° C em uma placa com fundo de vidro. </li><li> Para determinar a concentração de carga óptima de cálcio fluoróforo Fluo-2 e para evitar toxicidade celular corante de cálcio, as células com falta de ATP, e verificar a viabilidade celular através da determinação do decurso de tempo e magnitude do pico de sinais de cálcio em resposta a ATP. </li><li> Gravar o vídeo de oscilação de cálcio a uma taxa de captura de 5 ms para um mínimo de 1 seg (200 quadros por segundo), com excitação e emissão de comprimentos de onda de 488 nm e 515 nm, respectivamente (Filme 2). </li><li> Para distinguir o sinal de Fluo-2 cálcio de autofluorescência ou artefatos de movimento, assegurar que as intensidades emitidos em 515 nm é monitorizada separadamente. NOTA: Fluo-2 não é o cálcio fluoremetric adequado para quantificar o cálcio intracelular. No entanto, é um corante de cálcio dinâmica excelente para detectar mudanças rápidas de cálcio, tais como oscilações de cálcio. Para a quantificação mais precisa de cálcio, recomenda Fura-2. No entanto, as alterações dinâmicas de Fura-2 estão limitadas pela sua raciométricanatureza do corante. </li><li> Siga as fórmulas fornecidas pelo fabricante para calcular exatamente os valores de cálcio intracelulares livres. Exemplo [Ca2 +] = K d × (R - R min) / (Rmax - R). Onde K d é a constante de dissociação do corante a partir do cálcio libertado, R é a fluorescência medida a 488, e Rmin e Rmax é a proporção de fluorescência no mínimo e máximo de concentração de iões 12. </li></ol> 5. imunofluorescência Microscopia <ol><li> Fixar as secções de cérebro com solução salina tamponada de fosfato contendo 4% de paraformaldeído (PFA) e sacarose a 2% durante 10 min. Em alternativa, fixar todo o cérebro com 4% PFA seção e, em seguida, em 50 seções mm utilizando um criostato. </li><li> Lavar o tecido três vezes com 1x PBS durante 5 min de cada vez. </li><li> Incubar a fatia do cérebro com um solutiem 0,1% de Triton-X em 1x PBS durante 5 min, em seguida, lavar três vezes com 1x PBS durante 5 min de cada vez. </li><li> Incubar a fatia cerebral com o anticorpo primário do rato, um antiacetylated-tubulina, utilizado a uma diluição de 1: 5000 em FBS a 10% em 1x PBS, durante uma hora à temperatura ambiente (TA) ou durante a noite a 4 ° C. </li><li> Lavar o tecido três vezes com 1x PBS durante 5 min de cada vez. </li><li> Incubar a fatia de cérebro de anticorpo secundário, IgG anti-rato fluoresceína, a uma diluição de 1: 500 em FBS a 10% em solução de PBS 1x durante 1 h à TA. </li><li> Antes de observação sob um microscópio de fluorescência, a secção de contraste com 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) durante 5 min para corar o núcleo (ou ADN) 13. Para minimizar fotobranqueamento, imagem as seções imediatamente com tempo mínimo de exposição possível. </li></ol>

<ol>
	<li>AbouAlaiwi, W. A., Lo, S. T., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia:+Highly+sophisticated+biological+sensors.">Primary cilia: Highly sophisticated biological sensors.</a> Sensors. 9 (9), 7003-7020 (2009).</li><li>Nonaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomization+of+left-right+asymmetry+due+to+loss+of+nodal+cilia+generating+leftward+flow+of+extraembryonic+fluid+in+mice+lacking+kif3b+motor+protein.">Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking kif3b motor protein.</a> Cell. 95 (6), 829-837 (1998).</li><li>Satir, P., Christensen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+structure+and+function+of+mammalian+cilia.">Overview of structure and function of mammalian cilia.</a> Annual review of physiology. 69, 377-400 (2007).</li><li>Delbigio, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ependyma+-+a+protective+barrier+between+brain+and+cerebrospinal-fluid.">The ependyma - a protective barrier between brain and cerebrospinal-fluid.</a> Glia. 14 (1), 1-13 (1995).</li><li>Genzen, J. R., Platel, J. C., Rubio, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bordey+A.+Ependymal+cells+along+the+lateral+ventricle+express+functional+p2x(7)+receptors.">Bordey A. Ependymal cells along the lateral ventricle express functional p2x(7) receptors.</a> Purinergic signalling. 5 (3), 299-307 (2009).</li><li>Appelbe, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+mouse+jhy+gene+causes+abnormal+ciliary+microtubule+patterning+and+juvenile+hydrocephalus.">Disruption of the mouse jhy gene causes abnormal ciliary microtubule patterning and juvenile hydrocephalus.</a> Developmental biology. 382 (1), 172-185 (2013).</li><li>Sawamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+neurons+follow+the+flow+of+cerebrospinal+fluid+in+the+adult+brain+(New+York,+N.Y.).">New neurons follow the flow of cerebrospinal fluid in the adult brain (New York, N.Y.).</a> Science. 311 (5761), 629-632 (2006).</li><li>Banizs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+cilia+lead+to+altered+ependyma+and+choroid+plexus+function,+and+result+in+the+formation+of+hydrocephalus.">Dysfunctional cilia lead to altered ependyma and choroid plexus function, and result in the formation of hydrocephalus.</a> Development. 132 (23), 5329-5339 (2005).</li><li>Kawanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilostazol+prevents+endothelin-induced+smooth+muscle+constriction+and+proliferation.">Cilostazol prevents endothelin-induced smooth muscle constriction and proliferation.</a> PloS one. 7 (9), e44476 (2012).</li><li>Liu, T., Jin, X., Prasad, R. M., Sari, Y., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+types+of+ependymal+cells+with+intracellular+calcium+oscillation+are+characterized+by+distinct+cilia+beating+properties.">Three types of ependymal cells with intracellular calcium oscillation are characterized by distinct cilia beating properties.</a> J Neurosci Res. 92 (9), 1199-1204 (2014).</li><li>Chilvers, M. A., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+ciliary+beat+pattern+and+beat+frequency+using+digital+high+speed+imaging:+Comparison+with+the+photomultiplier+and+photodiode+methods.">Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: Comparison with the photomultiplier and photodiode methods.</a> Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).</li><li>Nauli, S. M., Jin, X., AbouAlaiwi, W. A., El-Jouni, W., Su, X., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-motile+primary+cilia+as+fluid+shear+stress+mechanosensors.">Non-motile primary cilia as fluid shear stress mechanosensors.</a> Methods in enzymology. 525, 1-20 (2013).</li><li>AbouAlaiwi, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survivin-induced+abnormal+ploidy+contributes+to+cystic+kidney+and+aneurysm+formation.">Survivin-induced abnormal ploidy contributes to cystic kidney and aneurysm formation.</a> Circulation. 129 (6), 660-672 (2014).</li><li>AbouAlaiwi, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+polycystin-2+is+a+mechanosensitive+calcium+channel+involved+in+nitric+oxide+signaling+cascades.">Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades.</a> Circulation research. 104 (7), 860-869 (2009).</li><li>Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilioplasm+is+a+cellular+compartment+for+calcium+signaling+in+response+to+mechanical+and+chemical+stimuli.">Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli.</a> Cell Mol Life Sci. 71 (11), 2165-2178 (2014).</li><li>Praetorius, H. A., Spring, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bending+the+mdck+cell+primary+cilium+increases+intracellular+calcium.">Bending the mdck cell primary cilium increases intracellular calcium.</a> The Journal of membrane biology. 184 (1), 71-79 (2001).</li><li>Smith, C. M., Radhakrishnan, P., Sikand, K., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+ethanol+and+acetaldehyde+on+brain+ependymal+and+respiratory+ciliary+beat+frequency.">The effect of ethanol and acetaldehyde on brain ependymal and respiratory ciliary beat frequency.</a> Cilia. 2 (1), 5 (2013).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Descrito aqui é um protocolo para a preparação do tecido cerebral do rato, tanto para live-imagem e microscopia de fluorescência que fornece uma observação atenta rápido e sensível dos cílios ependymal dentro dos ventrículos cerebrais. Esta técnica não é limitada apenas ao ventrículo lateral; que poderia ser utilizado para observar o cílios nas outras ventrículos cerebrais. Esta técnica de imagem fornece uma transmissão ao vivo que se assemelha o movimento do CSF por batimento ciliar num ambiente e...

Os cílios são organelos à base de microtúbulos sensoriais que se estendem a partir da superfície da célula para o meio extracelular. Dependendo da sua organização de microtúbulos, cílios podem ser classificados em dois tipos - &quot;9 + 0&quot; ou &quot;9 + 2&quot;. Funcionalmente, com base na sua motilidade, estes podem ser classificados como motilidade ou não-móveis cílios 1. Cílios é um termo comumente usado para designar &quot;9 + 0&quot; cílios não-móveis. Estes têm nove microtúbulos doublet paralelas (indicado por &#39;9&#39;) e um par central de microtúbulos está ausente no interior da bainha central (indicado por &quot;0&quot;). No entanto, alguns &quot;9 + 0&quot; cílios, cílios, como nodal, que regulam lateralidade embrião são móveis 2. Por outro lado, os cílios móveis são caracterizados, para além das nove dupletos microtúbulos paralelas, por um par central adicional de dupletos microtúbulo e com proteínas do motor associado dineína para facilitar a motilidade. Além disso, alguns &quot;92 &quot;cílios, como cílios olfatórios são não-móveis 3. Células ependimárias que revestem os ventrículos cerebrais e no canal central da medula espinhal são caracterizados por cílios móveis que impulsionam o líquido cefalorraquidiano (LCR) ao longo dos ventrículos cerebrais 4. O objetivo geral deste método é facilitar o estudo da dinâmica cílios e anormalidades estruturais móveis. Saúde e desenvolvimento do cérebro dependem fortemente a circulação eficiente de líquor dentro dos ventrículos cerebrais. Por exemplo, o fluxo de FCS normal e equilíbrio de fluidos necessitam de batimento normal e funcional cílios ependimária 5,6, o que por sua vez, desempenham papéis críticos na regulação do movimento direccional de células neuronais e migração de células estaminais 7. Como tal, a função dos cílios ependimária anormal ou estrutura pode conduzir ao fluxo CSF ​​anormal, que está associada com hidrocefalia, uma condição médica na qual há uma acumulação anormal de CSF nos ventrículos do bchuva. Isto pode, por conseguinte, causar aumento da pressão intracraniana e alargamento progressivo da cabeça, convulsões, visão em túnel, e deficiência mental 8. As vantagens desta técnica em relação aos métodos existentes é que ele permitiu, pela primeira vez para relatar três tipos de células ependymal distintas: I, II, e III, com base em sua única freqüência de batimento ciliar e batendo ângulo. Estas células ependimárias são localizados dentro de certas regiões nos ventrículos cerebrais. Além disso, os efeitos da idade e agentes farmacológicos, tais como álcool e cilostazol na alterando os tipos de células ependimais ou suas localizações pode ser demonstrada, o que não era possível antes de esta classificação de células ependimais. Cilostazole é um inibidor da fosfodiesterase-3, uma enzima que metaboliza cAMP em AMP e também regula o cálcio intracelular 9. Usando a análise de imagens de fluorescência de alta velocidade permite imagens e de quantificação do intracelular exclusivoPropriedades de oscilação de cálcio das células ependimárias. Por exemplo, tanto o álcool e o cilostazol alterou significativamente a frequência de batimento ciliar ependimal, bem como as oscilações de cálcio intracelulares propriedades, que por sua vez, pode conduzir a uma mudança no volume do fluido cerebrospinal de substituição pelos cílios ependimária 10. Em resumo, esta técnica foi a chave para proporcionar a primeira evidência de três tipos distintos de células ependimais com diferentes propriedades de oscilação de cálcio. Na seção seguinte, um panorama detalhado passo-a-passo do procedimento é fornecida, prestando muita atenção a preparação do tecido e manuseio.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM/HIGH GLUCOSE</td>
			<td>Cellgro Mediatech Inc.</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30088-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30256-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-2395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-2&#160;</td>
			<td>TEF Labs</td>
			<td>#0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetylated a-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7451&#160;</td>
			<td>clone 6-11B1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Anti-mouse antibody</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>FI-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture plate</td>
			<td>VWR Vista Vision</td>
			<td>30-2041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip (18x18)</td>
			<td>VWR Vista Vision</td>
			<td>16004.326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica CM1860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>Nikon TE2000</td>
			<td>60X oil&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass 24x60mm</td>
			<td>VWR Vista Vision</td>
			<td>16004-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI filter cube</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of the ependymal cilia in the lateral ventricles of the mouse brain

Células ependimárias Multiciliated alinhar os ventrículos no cérebro adulto. Função ou estrutura de cílios ependimária anormal está associado com várias deficiências neurológicas. A corrente ex vivo de imagens ao vivo da motilidade técnica cílios ependymal permite um estudo detalhado da dinâmica ciliares seguir várias etapas. Essas etapas incluem: ratos eutanásia com dióxido de carbono de acordo com protocolos de The University of Animal Care Institucional de Toledo e Comitê de Uso (IACUC); craniectomia seguido por remoção do cérebro e dissecção cérebro sagital com um vibratome ou lâmina afiada para obter secções muito finas através dos ventrículos laterais do cérebro, onde os cílios ependimária podem ser visualizadas. A incubação das fatias do cérebro de uma placa com fundo de vidro personalizado contendo meio de Eagle modificado (DMEM) / alta concentração de glicose de Dulbecco a 37 ° C na presença de 95% / 5% de O2 / CO2 mistura é essencial para manter o tecido vivo duranteo experimento. Um vídeo do espancamento cílios é então gravado utilizando um de alta resolução de contraste de interferência diferencial microscópio. O vídeo é então analisado quadro a quadro para calcular a freqüência de batimento ciliar. Isso permite a classificação distinta das células ependimárias em três categorias ou tipos com base na sua freqüência de batimento ciliar e ângulo. Além disso, esta técnica permite o uso de análise de imagem de fluorescência de alta velocidade para caracterizar as propriedades únicas de oscilação de cálcio intracelulares de células ependimais, bem como o efeito de agentes farmacológicos sobre as oscilações de cálcio e a frequência de batimento ciliar. Além disso, esta técnica é adequado para imagiologia de imunofluorescência para a estrutura ciliar e localização de proteínas ciliar estudos. Isto é particularmente importante em estudos de diagnóstico da doença e fenótipo. A principal limitação da técnica é atribuída à diminuição no movimento ciliar móveis vivo como o tecido cerebral começa a morrer.

Medir a função dos cílios ependymal no cérebro do rato vivo O método descrito neste protocolo é usado para monitorar a função dos cílios ependymal e estrutura no tecido fresco dissecado do cérebro do rato, bem como para monitorar e estudar freqüência de batimento ciliar. Os passos seguidos para alcançar uma experiência completa estão descritos em um fluxograma esquemático (Figura 1). É altamente recomendável que o experimento é conduzido dentro de um curto...

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Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Usando contraste de interferência diferencial (DIC) microscopia de alta resolução, uma observação ex vivo do espancamento de cílios ependymal móveis localizados dentro dos ventrículos do cérebro do rato é demonstrado pelo live-imagiologia. A técnica permite que uma gravação da frequência de batimento ciliar ângulo único e batendo bem como as suas propriedades de estimulação do cálcio intracelular oscilação.

Imagens ao vivo da ependimária Cilia nas laterais ventrículos do cérebro do rato

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

live-imaging-ependymal-cilia-lateral-ventricles-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.6K visualizações.  University of Toledo, College of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences.  Usando contraste de interferência diferencial (DIC) microscopia de alta resolução, uma observação ex vivo do espancamento de cílios ependymal móveis localizados dentro dos ventrículos do cérebro do rato é demonstrado pelo live-imagiologia. A técnica permite que uma gravação da frequência de batimento ciliar ângulo único e batendo bem como as suas propriedades de estimulação do cálcio intracelular oscilação. 

Vídeo: Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured neurons for extended durations1-3. This is now possible through the use of vital dyes and fluorescent proteins with which cytoskeletal components, organelles, and other structures in living cells can be labeled and then visualized via dynamic fluorescence microscopy. For example, in embryonic chicken sympathetic neurons, mitochondrial movement was characterized using the vital dye rhodamine 1234. In another study, mitochondria were visualized in rat forebrain neurons by transfection of mitochondrially targeted eYFP5. However, imaging of primary neurons over minutes, hours, or even days presents a number of issues. Foremost among these are: 1) maintenance of culture conditions such as temperature, humidity, and pH during long imaging sessions; 2) a strong, stable fluorescent signal to assure both the quality of acquired images and accurate measurement of signal intensity during image analysis; and 3) limiting exposure times during image acquisition to minimize photobleaching and avoid phototoxicity.
Here, we describe a protocol that permits the observation, visualization, and analysis of mitochondrial movement in cultured hippocampal neurons with high temporal resolution and under optimal life support conditions. We have constructed an affordable stage-top incubator that provides good temperature regulation and atmospheric gas flow, and also limits the degree of media evaporation, assuring stable pH and osmolarity. This incubator is connected, via inlet and outlet hoses, to a standard tissue culture incubator, which provides constant humidity levels and an atmosphere of 5-10% CO2/air. This design offers a cost-effective alternative to significantly more expensive microscope incubators that don't necessarily assure the viability of cells over many hours or even days. To visualize mitochondria, we infect cells with a lentivirus encoding a red fluorescent protein that is targeted to the mitochondrion. This assures a strong and persistent signal, which, in conjunction with the use of a stable xenon light source, allows us to limit exposure times during image acquisition and all but precludes photobleaching and phototoxicity. Two injection ports on the top of the stage-top incubator allow the acute administration of neurotransmitters and other reagents intended to modulate mitochondrial movement. In sum, lentivirus-mediated expression of an organelle-targeted red fluorescent protein and the combination of our stage-top incubator, a conventional inverted fluorescence microscope, CCD camera, and xenon light source allow us to acquire time-lapse images of mitochondrial transport in living neurons over longer durations than those possible in studies deploying conventional vital dyes and off-the-shelf life support systems.

We describe a protocol that allows imaging of mitochondria in living neurons via fluorescence microscopy over long durations. Imaging over extended periods is accomplished through lentivirus-mediated expression of a mitochondrially targeted fluorescent protein and use of an inexpensive stage-top incubator that was designed and built in our laboratory.

Neuromodulação e Transportes mitocondrial: Imagens ao vivo em neurônios do hipocampo durante muito tempo

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Neurociência

Manual Drainage of the Zebrafish Embryonic Brain Ventricles

Cerebrospinal fluid (CSF) is a protein rich fluid contained within the brain ventricles. It is present during early vertebrate embryonic development and persists throughout life. Adult CSF is thought to cushion the brain, remove waste, and carry secreted molecules1,2. In the adult and older embryo, the majority of CSF is made by the choroid plexus, a series of highly vascularized secretory regions located adjacent to the brain ventricles3-5. In zebrafish, the choroid plexus is fully formed at 144 hours post fertilization (hpf)6. Prior to this, in both zebrafish and other vertebrate embryos including mouse, a significant amount of embryonic CSF (eCSF) is present . These data and studies in chick suggest that the neuroepithelium is secretory early in development and may be the major source of eCSF prior to choroid plexus development7.
eCSF contains about three times more protein than adult CSF, suggesting that it may have an important role during development8,9. Studies in chick and mouse demonstrate that secreted factors in the eCSF, fluid pressure, or a combination of these, are important for neurogenesis, gene expression, cell proliferation, and cell survival in the neuroepithelium10-20. Proteomic analyses of human, rat, mouse, and chick eCSF have identified many proteins that may be necessary for CSF function. These include extracellular matrix components, apolipoproteins, osmotic pressure regulating proteins, and proteins involved in cell death and proliferation21-24. However, the complex functions of the eCSF are largely unknown.
We have developed a method for removing eCSF from zebrafish brain ventricles, thus allowing for identification of eCSF components and for analysis of the eCSF requirement during development. Although more eCSF can be collected from other vertebrate systems with larger embryos, eCSF can be collected from the earliest stages of zebrafish development, and under genetic or environmental conditions that lead to abnormal brain ventricle volume or morphology. Removal and collection of eCSF allows for mass spectrometric analysis, investigation of eCSF function, and reintroduction of select factors into the ventricles to assay their function. Thus the accessibility of the early zebrafish embryo allows for detailed analysis of eCSF function during development.

We present a method to collect cerebrospinal fluid (CSF) and to create a system which lacks CSF within the embryonic zebrafish brain ventricular system. This allows for further examination of CSF composition and its requirement during embryonic brain development.

Drenagem Manual dos Zebrafish ventrículos cerebrais embrionárias

Cerebrospinal fluid  (CSF) is a protein rich fluid contained within the brain ventricles. It is  present during early vertebrate embryonic development and ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Imagens ao vivo da mitose no desenvolvimento Cortex embrionárias de camundongos

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and lifespan. In addition, telomerase protects the mitochondria from oxidative stress and confers resistance to apoptosis, suggesting its possible importance for the surviving of non-mitotic, highly active cells such as neurons. We previously demonstrated the ability of novel telomerase activators to increase telomerase activity and expression in the various mouse brain regions and to protect motor neurons cells from oxidative stress. These results strengthen the notion that telomerase is involved in the protection of neurons from various lesions. To underline the role of telomerase in the brain, we here compare the activity of telomerase in male and female mouse brain and its dependence on age. TRAP assay is a standard method for detecting telomerase activity in various tissues or cell lines. Here we demonstrate the analysis of telomerase activity in three regions of the mouse brain by non-denaturing protein extraction using CHAPS lysis buffer followed by modification of the standard TRAP assay.
In this 2-step assay, endogenous telomerase elongates a specific telomerase substrate (TS primer) by adding TTAGGG 6 bp repeats (telomerase reaction). The telomerase reaction products are amplified by PCR reaction creating a DNA ladder of 6 bp increments. The analysis of the DNA ladder is made by 4.5% high resolution agarose gel electrophoresis followed by staining with highly sensitive nucleic acid stain.
Compared to the traditional TRAP assay that utilize 32P labeled radioactive dCTP&#39;s for DNA detection and polyacrylamide gel electrophoresis for resolving the DNA ladder, this protocol offers a non-toxic time saving TRAP assay for evaluating telomerase activity in the mouse brain, demonstrating the ability to detect differences in telomerase activity in the various female and male mouse brain region.

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.

A atividade da telomerase nas diversas regiões de cérebro de camundongo: A telomerase não-radioativo Repetir Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

3D Modeling of the Lateral Ventricles and Histological Characterization of Periventricular Tissue in Humans and Mouse

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional units of the ventricles are ciliated epithelial cells termed ependymal cells, which line the ventricles and through ciliary action are capable of generating laminar flow of CSF at the ventricle surface. This monolayer of ependymal cells also provides barrier and filtration functions that promote exchange between brain interstitial fluids (ISF) and circulating CSF. Biochemical changes in the brain are thereby reflected in the composition of the CSF and destruction of the ependyma can disrupt the delicate balance of CSF and ISF exchange. In humans there is a strong correlation between lateral ventricle expansion and aging. Age-associated ventriculomegaly can occur even in the absence of dementia or obstruction of CSF flow. The exact cause and progression of ventriculomegaly is often unknown; however, enlarged ventricles can show regional and, often, extensive loss of ependymal cell coverage with ventricle surface astrogliosis and associated periventricular edema replacing the functional ependymal cell monolayer. Using MRI scans together with postmortem human brain tissue, we describe how to prepare, image and compile 3D renderings of lateral ventricle volumes, calculate lateral ventricle volumes, and characterize periventricular tissue through immunohistochemical analysis of en face lateral ventricle wall tissue preparations. Corresponding analyses of mouse brain tissue are also presented supporting the use of mouse models as a means to evaluate changes to the lateral ventricles and periventricular tissue found in human aging and disease. Together, these protocols allow investigations into the cause and effect of ventriculomegaly and highlight techniques to study ventricular system health and its important barrier and filtration functions within the brain.

Using MRI scans (human), 3D imaging software, and immunohistological analysis, we document changes to the brain&#8217;s lateral ventricles. Longitudinal 3D mapping of lateral ventricle volume changes and characterization of periventricular cellular changes that occur in the human brain due to aging or disease are then modeled in mice.

Modelagem 3D do lateral ventrículos e histológica Caracterização do Tecido Periventricular em humanos e mouse

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

Imagiologia Fibras Serotoninérgicos na medula espinhal mouse usando o CLARIDADE / Técnica CUBIC

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Gravação de plasticidade sináptica em fatias Hippocampal agudas, mantidas em um pequeno volume reciclagem - perfusão- e sistema de câmara de submersão-tipo

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

Viver a imagem das células do córtex Cerebral primário usando um sistema de cultura 2D

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Exploring Deep Space - Uncovering the Anatomy of Periventricular Structures to Reveal the Lateral Ventricles of the Human Brain

Anatomy students are typically provided with two-dimensional (2D) sections and images when studying cerebral ventricular anatomy and students find this challenging. Because the ventricles are negative spaces located deep within the brain, the only way to understand their anatomy is by appreciating their boundaries formed by related structures. Looking at a 2D representation of these spaces, in any of the cardinal planes, will not enable visualisation of all of the structures that form the boundaries of the ventricles. Thus, using 2D sections alone requires students to compute their own mental image of the 3D ventricular spaces. The aim of this study was to develop a reproducible method for dissecting the human brain to create an educational resource to enhance student understanding of the intricate relationships between the ventricles and periventricular structures. To achieve this, we created a video resource that features a step-by-step guide using a fiber dissection method to reveal the lateral and third ventricles together with the closely related limbic system and basal ganglia structures. One of the advantages of this method is that it enables delineation of the white matter tracts that are difficult to distinguish using other dissection techniques. This video is accompanied by a written protocol that provides a systematic description of the process to aid in the reproduction of the brain dissection. This package offers a valuable anatomy teaching resource for educators and students alike. By following these instructions educators can create teaching resources and students can be guided to produce their own brain dissection as a hands-on practical activity. We recommend that this video guide be incorporated into neuroanatomy teaching to enhance student understanding of the morphology and clinical relevance of the ventricles.

This paper demonstrates the effective use of a fiber dissection method to reveal the superficial white matter tracts and periventricular structures of the human brain, in three-dimensional space, to aid student comprehension of ventricular morphology.

Explorando o espaço profundo - descobrindo a anatomia das estruturas periventriculares para revelar os ventrículos laterais do cérebro humano

Anatomy students are typically provided with two-dimensional (2D) sections and images when studying cerebral ventricular anatomy and students find this ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.