Neste vídeo, descrevemos um método simples e eficiente para visualizar e analisar um repertório de anticorpos em nível global. É possível descrever repertórios inteiros de células B em indivíduos e suas mudanças dinâmicas em resposta à estimulação imunológica. Este método pode ser aplicado para analisar amostras patológicas de pacientes de infecções virais emergentes e para obter os dados com uma visão sem precedentes sobre a patogênese da infecção.
Uma das áreas mais emocionantes para a aplicação é o controle de vacinas. A eficácia da vacina pode ser avaliada analisando a dinâmica do repertório global de anticorpos em indivíduos administrados por vacinas. O indivíduo é novo neste método pode precisar otimizar as condições de PCR porque a eficiência da amplificação genética de anticorpos depende dos tipos de materiais iniciais.
Fla-cher para identificação de amplicons de imunoglobulina. É importante demonstrar essas ações visualmente. Demonstrando o procedimento estarão a Srta. Sayuri Yamaguchi e o Sr. Hanbing Xue, um técnico e estudante de pós-graduação do meu laboratório.
Para iniciar este procedimento, disseque o tecido de um rato preto C57 de oito semanas de idade e passe-o através de uma malha de aço inoxidável com dois mililitros de PBS para obter células dispersas. Transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros e centrífuga a 600 vezes g e a quatro graus Celsius por cinco minutos. Descarte o supernatante e adicione 800 microliters de tampão de lise ACK à pelota.
Incubar no gelo por dois minutos para lise os glóbulos vermelhos no tecido. Em seguida, lave as células teciduais três vezes usando três mililitros de PBS para cada lavagem. Centrifugar novamente a 600 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos.
Descarte o supernascer e adicione 800 microlitadores de reagente de isothiocyanato fenol/guanidina à pelota e vórtice completamente. Incubar a 25 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, adicione 200 microliters de clorofórmio e agite manualmente por 15 segundos.
Incubar a 25 graus Celsius por dois minutos. Centrifugar a 12.000 vezes g e a 25 graus Celsius para separar as fases. Transfira a fase superior aquosa para um tubo fresco.
Adicione um volume de 70% de etanol. Vórtice brevemente e aplique esta mistura na coluna de giro de sílica. Elute o RNA com 30 a 100 microliters de água.
Depois disso, use um fluorômetro para quantificar a concentração inicial de RNA. Armazene o RNA purificado a menos 80 graus Celsius. Primeiro, sintetize o cDNA de primeira linha de dois a 10 microgramas do modelo total de RNA usando o primer 5'RACE CDS e o oligonucleotídeo SMART-PCR de acordo com as instruções do fabricante.
Para a imunoglobulina do camundongo, o PCR amplifica o DNA com polimerase de DNA de alta fidelidade, usando o primer dianteiro universal e primers reversos específicos da classe imunoglobulina, conforme descrito no protocolo de texto. Para a imunoglobulina humana, execute o primeiro PCR usando o primer dianteiro universal e primers reversos específicos da classe imunoglobulina com sequências de tag. Inclua as sequências de índice para cada amostra por segundo PCR usando primers de sequência de índice.
Em seguida, eletroforese qualquer um dos produtos PCR em um gel de 2%agarose. Visualize as bandas de DNA em um transilluminador UV e extirve a fatia de gel contendo a banda larga entre 600 e 800 pares de base. Adicione 10 microliters de solução de ligação de membrana por 10 miligramas de fatia de gel.
Misture e incubar a 50 a 65 graus Celsius até que as fatias de gel se dissolvam completamente. Em seguida, transfira a solução de gel para a coluna de rotação da membrana de sílica. Lave a coluna uma vez com tampão de lavagem e elute o DNA com 50 microliters de água sem nuclease.
Usando um fluorômetro, quantifique os amplicons purificados e acumule os amplicons de cada classe de imunoglobulina em quantidades iguais para sequenciamento de NGS. Depois disso, use uma eletroforese à base de microcapilary com chip de dimensionamento de DNA para determinar o tamanho e concentração das bibliotecas. Armazene as bibliotecas a menos 20 graus Celsius.
Primeiro, gerar uma planilha amostral do sequenciamento executado conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, descongele um cartucho de reagente e as bibliotecas. Faça uma solução normal de hidróxido de sódio 0,2 e dilua as bibliotecas para obter as concentrações molares desejadas.
Em seguida, enxágüe e seque a célula de fluxo e adicione 600 microlitadores da solução de biblioteca diluída e desnaturada no poço do cartucho de reagente, e inicie a execução de sequenciamento. Uma perspectiva de um repertório de anticorpos murinos como um todo pode ser obtida a partir de células ou tecidos como o baço, medula óssea, linfonodo ou sangue. Resultados representativos dos repertórios da cadeia de luz IgM, IgG1, IgG2c e imunoglobulina de um baço de rato ingênuo são mostrados aqui.
No rearranjo V(D)J por gráfico 3D V(D)J, o tamanho de cada bola representa o número relativo de leituras. Em outras palavras, representa o número de anticorpos mRNAs em células B inteiras. A malha 3D consiste em 110 genes de cadeia pesada de imunoglobulina V, 12 genes de cadeia pesada de imunoglobulina D, e quatro genes de cadeia pesada de imunoglobulina J, que estão alinhados para refletir sua ordem no cromossomo.
A trama 2D VJ mostra o perfil do rearranjo de VJ no repertório IGL. O comprimento de cada barra representa o número relativo de leituras. O eixo X representa 101 genes V-kappa da cadeia de luz de imunoglobulina, e três genes V-lambda da cadeia de luz de imunoglobulina, e o eixo Y representa quatro genes J-kappa da cadeia de luz da imunoglobulina, e três genes J-lambda da cadeia de luz de imunoglobulina.
Uma perspectiva de um repertório de anticorpos humanos como um todo pode ser analisada a partir de vários tecidos, incluindo células mononucleares de sangue periféricos ou tecidos patológicos. Os resultados representativos do IgM, IgG total, IgA total, IgD, IgE e IgL de células mononucleares periféricas normais são mostrados aqui. Como o modelo murino, o perfil de repertório do rearranjo V(D)J é mostrado no gráfico 3D V(D)J no qual o tamanho de cada bola representa o número relativo de leituras.
A malha 3D consiste em 56 genes de cadeia pesada de imunoglobulina V, 27 genes de cadeia pesada de imunoglobulina D, e seis genes de cadeia pesada de imunoglobulina J, alinhados na ordem em que aparecem no cromossomo. O perfil do rearranjo de VJ no repertório IgL é retratado no enredo 2D VJ no qual o comprimento de cada barra representa o número relativo de leituras. O eixo X representa 41 genes V-kappa da cadeia de luz de imunoglobulina, e 32 genes V-lambda da cadeia de luz de imunoglobulina, e o eixo Y representa cinco genes J-kappa da cadeia de luz da imunoglobulina, e cinco genes J-lambda da cadeia de luz de imunoglobulina.
No material de estudo deste protocolo, um pequeno número de células classificadas por citometria de fluxo ou mesmo crioseções de amostras patológicas são utilizáveis. No entanto, será necessária uma otimização cuidadosa das condições da PCR. Como as informações de saída deste protocolo são enormes, a alfabetização bioinformática ajudaria a encontrar a estrutura da rede de anticorpos.
Isso levaria sem previsão à profunda compreensão do sistema imunológico.
