Besouro-de-madeira sua superfície corporal são sempre difíceis em SEM. O Tween-20 é adicionado em solução fixativa e de lavagem. A superfície corporal do besouro-de-madeira No TEM, o Tween-20 pode aumentar a penetração fixa na parede do corpo e melhor fixar tecido e órgão no corpo.
O microscópio de fluorescência é útil para melhorar a precisão do corte. A técnica é útil para lavar a superfície do corpo e penetrar na parede do corpo no besouro de madeira. Assim, limparia a visão SEM e TEM.
O microscópio de fluorescência é útil para melhorar a precisão do corte no TEM. Demonstrando o procedimento estará Zhang Yanru, um estudante de pós-graduação do nosso laboratório. Em uma área onde o Cloroforo caragana vive, coloque armadilhas de campo iscas com atrativos de plantas, como isophorone em uma armadilha de funil.
Atrair adultos de besouros para as armadilhas. Preserve os corpos limpos de caragana de cloroforo adulto em 0,1 mol por litro PBS em pH 7,2, 2,5% de peso por glutaraldeído de volume e volume de 0,06% em volume Tween-20. Conserte a amostra a 4 graus Celsius por três dias.
Remova os corpos do líquido de preservação e enxágue em PBS. Sob um microscópio estéreo, use fórceps para remover os apêndices e limpá-los ultrassonicamente a 40 kilohertz em PBST. Após a limpeza por 100 segundos, transfira a amostra para o microscópio para verificar se está limpa.
Não limpe por mais de 400 segundos para evitar danos. Em seguida, mergulhe as amostras em etanol em uma série de concentrações por 20 minutos cada para realizar a desidratação. Após a desidratação, sob um microscópio estéreo, use fita adesiva de dois lados de carbono para fixar separadamente três superfícies de observação, dorsal, ventral e lateral, em stubs.
Certifique-se de que todas as superfícies de visualização sejam mantidas limpas e livres de contaminação. Coloque o estágio da amostra em uma placa de Petri contendo um dessecante de gel de sílica por 48 horas. Em seguida, em um instrumento de sputtering de íons, gire a válvula principal para a posição aberta, remova a tampa da câmara da amostra e coloque a amostra na câmara.
Ligue o interruptor de alimentação e certifique-se de que a luz pronta está acesa. Defina o tempo de sputtering como 45 segundos e a espessura do revestimento como 70.875 angstrom. Uma vez que o índice de mostrador de vácuo da bomba mecânica caia abaixo de sete, pressione a descarga e comece a pulverizar platina.
No final do procedimento, desligue a fonte de alimentação e tire a amostra da câmara. Calcule a espessura do filme de spray D em angstrom igualando K vezes I times V times T.K é uma constante determinada pelo metal e gás sputtered. Eu sou o fluxo de plasma em miliamperes enquanto V é a tensão aplicada em kilovolts e T é o tempo em segundos.
Insira o stub contendo a amostra no estágio do SEM. Certifique-se de que o estágio da amostra com o stub amostral tenha altura suficiente para permitir uma boa imagem. Abra o software SEM e selecione a tensão de operação desejada a partir de 20 kilovolts.
Depois de obter os apêndices de cloroforo caragana adulto, lave as amostras em PBST em um banho ultrassônico por três horas e depois depois corrija-as em 1%de peso por volume de tetroxida de ósmio na PBS por uma hora a 25 graus Celsius. Desidrate as amostras utilizando tratamentos sucessivos de 20 minutos em 50%60%70%80%85%90%95%100% e 100% de volume de etanol em temperatura ambiente. Com fórceps, aplique resina aquecida em um molde de incorporação plana e incorpore as amostras na resina.
Certifique-se de que a amostra está na parte inferior da placa e coloque o mais perto possível da borda da ranhura rebaixada. Rotule e, em seguida, incubar a placa contendo a amostra a 60 graus Celsius por 72 horas. Após a incubação, retire a placa da incubadora e verifique se a resina foi polimerizada.
Uma vez que a amostra tenha se solidificado, coloque cada bloco de resina sob um microscópio de fluorescência, mova a fonte de luz fluorescente do microscópio para irradiar a amostra com luz azul de cima e fotografá-las. Certifique-se de que a sensilla no bloco de resina esteja claramente visível. Meça a distância entre a borda do bloco de resina e o sensor de destino para atingir a sensilla.
Consulte a imagem SEM das palpas e corte aproximadamente o bloco de resina com uma lâmina de barbear perto do receptor alvo. Em seguida, sob uma microscopia de fluorescência de luz azul, ajuste a fonte de luz de cima para que a sensilla seja observada claramente. Adicione o micrômetro objetivo ao estágio do microscópio de fluorescência.
Fotografe o bloco de resina aproximadamente cortado e, em seguida, usando ImageJ medir a distância entre o alvo e a borda da resina. Coloque a amostra de resina em um ultramicroome e corte seções de 50 a 60 nanômetros de espessura até que a posição alvo seja atingida. Monte as seções em 100 grades de cobre revestidas de formvar em placas de Petri.
Manche as grades com uma solução filtrada saturada de acetato de urânyl à temperatura ambiente. Cubra as seções durante a coloração para bloquear precipitados induzidos pela luz. Mancha por 10 minutos.
Em um capô de fumaça, enxágue duas vezes em 50% de metanol, depois duas vezes em água desgaseada filtrada. Coloque gotas de mancha de citrato de chumbo preparado nas praças das placas de Petri de plástico e deixe-as sentar por oito minutos. Enxágüe em água filtrada desgasegada e seque.
Monte as grades em um estágio de amostra dentro da máquina TEM. Coloque a tensão em 80 quilovolts e examine as seções. Neste protocolo, utilizando-se solução de limpeza e fixação com Tween-20, observou-se uma imagem SEM clara do que a sem Tween-20.
Com a solução de fixação Tween-20 permitindo que a solução de fixação de glutaraldeído penetrasse no tecido, as estruturas de microtúbulos foram claramente vistas na imagem TEM enquanto a estrutura interna da amostra preparada sem Tween-20 estava embaçada. As visões transversais contínuas do pino do tipo um sensilla twig basiconica nas palpas maxilais mostraram que a bainha dendrítica cercou os segmentos dendríticas externas e estendeu-se até o poro de ponta. Sete segmentos dendráticos externos não arrepiados existiam dentro da cavidade linfática do receptor interno que estava cercada por uma cavidade externa.
O corpo tubular foi separado por uma baá dendrítica de outros segmentos dendráticos externos em cada base de soquetes sensilares. Na região ciliar, foram identificados oito dendritos de diferentes diâmetros indicando a presença de oito neurônios bipolares. A técnica pode ser usada para estudar melhor a função de nervos como gravação de célula única ou hibridização in situ.
