A síntese proteica é propensa a erros. No entanto, erros podem ser adaptativos sob estresse fisiológico. Já mostramos anteriormente que erros específicos de tradução no micobacterium são contribuídos para a tolerância a antibióticos.
Ser capaz de medir taxas de erro específicas nos permite direcionar esse mecanismo adaptativo de bactérias. As principais vantagens dessas técnicas são que os repórteres de ganho de função podem ser extremamente sensíveis na medição de pequenas taxas de erro que não são fáceis de detectar pela espectrometria de massa. O ensaio Niuc/GFP permite a triagem de rendimento médio, uma vez que evita o manuseio excessivo e a lise das bactérias.
Demonstrando o procedimento será o doutorando Yue-Meng Chen. Hoje vamos demonstrar o procedimento de usar esses dois repórteres através deste vídeo. Para começar, inocular dois mililitros de 7H9 médio com tipo selvagem e mutação de repórteres micobacterianos.
Agite a 37 graus Celsius por um a dois dias ou até que o OD a 600 nanômetros atinja a fase estacionária. Alíquota e diluição para obter um OD a 600 nanômetros em torno de 0,5 a 1. Em seguida, adicione ATC a uma concentração final de 50 nanogramas por mililitro.
Adicione imediatamente diferentes doses de ksg à cultura de acordo com o manuscrito para medir seus efeitos sobre as taxas de tradução errada. Incubar a 37 graus Celsius com agitação de quatro a seis horas. Em seguida, transfira as culturas bacterianas para um tubo de dois mililitros.
E centrífuga a 3.220 vezes g à temperatura ambiente por cinco minutos para derrubar as bactérias. Após a etapa de centrifugação, descarte o supernascer e interrompa as bactérias adicionando 40 microliters de 1x tampão de lise passiva. Transfira o lise bacteriano resuspended para uma placa branca de 96 poços, um poço por amostra, e agite à temperatura ambiente por 20 minutos.
Adicione 80 microliters de substrato de vagalume a cada poço. Agite por 15 segundos e meça a luminescência por um luminômetro. Em seguida, adicione 80 microliters de renilla substrato a cada poço.
Agite por 15 segundos e meça a luminescência pelo luminômetro. Use os valores corrigidos para calcular as taxas de tradução errada de cada condição. Para começar, inocular dois mililitros de meio 7H9 com a cepa de repórter bacteriano.
Agite a 37 graus Celsius por um a dois dias ou até que o OD a 600 nanômetros atinja a fase estacionária. Em seguida, a subcultura em 50 mililitros de 7H9 médios e crescer até que o OD a 600 nanômetros atinja a fase estacionária tardia. Antes de aliquor a bactéria a uma placa de 96 poços, adicione ATC em uma concentração final de 50 nanogramas por mililitro e misture bem.
Adicione 100 microliters por poço a uma placa clara de 96 poços de fundo redondo. Em seguida, adicione diferentes doses de ksg aos poços selecionados para testar seus efeitos sobre as taxas de tradução errada. Adicione 200 microliters de água estéril aos poços de borda da placa para limitar a evaporação dos poços de amostra.
Sele a placa, agite e induza as amostras a 37 graus Celsius por 16 a 20 horas. Use uma pipeta multicanal para tirar 80 microliters de cada poço. Transfira as amostras para uma placa de 96 poços de fundo preto e meça o sinal GFP pelo luminômetro.
Depois de medir o sinal GFP, centrifugar a placa a 3.220 vezes g durante 10 minutos. Em seguida, transfira 50 microliters do supernatante para uma placa de 96 poços de fundo branco. Em seguida, adicione 50 microliters de niuc substrato a cada poço.
Misture bem e meça a luminescência pelo luminômetro. Finalmente, determine a razão NLuc/GFP dividindo o valor de luminescência nluc corrigido pela fluorescência GFP. Neste trabalho, o sistema de repórteres de vagalume Renilla foi usado para medir a taxa de tradução errada na presença de kasugamycina em tipo selvagem e em uma cepa de S.Smegmatis que ksgA foi excluído.
Os resultados mostraram uma maneira clara dependente de dose de ksg diminuindo a taxa de transferência incorreta enquanto na cepa ksgA-exclusão, ksg foi menos potente e a linha de base da taxa de tradução errada foi maior devido à resistência à modulação por kasugamycin. A ação de kasugamycin sobre a tradução errada também foi medida por meio do repórter do NIUC/GFP. Tanto Renilla firefly quanto repórter niuc/GFP envolvem medir a atividade da luciferase.
Pequenos erros de pipetação podem causar grandes flutuações nas leituras. Para começar, sugerimos aumentar o número de réplicas para minimizar a chance de obter leituras não confiáveis.
