Name: analysis of lymphocyte extravasation using an in vitro model of the human blood-brain barrier
Uploaded: 2017-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
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This study has been supported by the Collaborative Research Centre CRC TR128 "Initiating/Effector versus Regulatory Mechanisms in Multiple Sclerosis-Progress towards Tackling the Disease" (Project A9 to H.W. and C.C.G., project B1 to N.S.).

1. Cultura de células de cérebro humano Células Endoteliais Microvasculares (HBMEC) <ol><li> Revestimento de frascos de cultura de células <ol><li> Para preparar a solução de fibronectina, adicionar 10 mL de PBS para um tubo de centrífuga de 15 mL. Adicionar 150 mL de fibronectina e misture bem. </li><li> Para cobrir o fundo de um frasco de cultura de células T-25, adicionar 2 ml de solução de fibronectina. Incubar o balão de cultura de células durante pelo menos 3 h a 37 ° C na incubadora. Revestidas com fibronectina frascos podem ser armazenados durante 2 semanas a 37 ° C / 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Sementeira e cultura de células de HBMEC <ol><li> Aspirar solução de fibronectina a partir do fundo do frasco de cultura de célula. Adicionar 7,2 x 10 4 HBMEC / cm² suspenso em 6 ml de meio de ECM-b (= ECM-b suplementado com 5% de soro fetal bovino, 1% de penicilina / estreptomicina e 1% de suplemento de crescimento de células endoteliais). Incubar a 37 ° C / 5% de CO 2. Verifique o crescimento de células diariamente usando um microscópio. </li><li> Mudar o meio cada 3 dias.Colheita ou células divididas, quando HBMEC atingir aproximadamente 80% de confluência. HBMEC deve ser usado entre a passagem 1 e 15 para evitar a perda de propriedades fisiológicas. </li></ol></li><li> Colheita HBMEC. <ol><li> Prepare Accutase solução por mistura de Accutase (1x) com PBS numa proporção de 1: 1. Manter Accutase solução a 37 ° C em um banho de água até à sua utilização. </li><li> Transferência médio ECM-b a partir do balão de cultura de células para um tubo de centrífuga de 15 mL. Lavar HBMEC por adição de 5 mL de PBS para o fundo do frasco de cultura de células. Aspirar PBS e repetir o passo de lavagem mais duas vezes. </li><li> Adicionar a solução de 2 ml pré-aquecido Accutase. Incubar a 37 ° C durante 2 min. Posteriormente, HBMEC são re-suspensos batendo firmemente o frasco de cultura de células várias vezes. destacamento das células é controlada usando um microscópio </li><li> O ECM-b-forma previamente armazenado num tubo de 15 ml é adicionado de volta ao frasco de cultura de células, logo que HBMEC começar a separar. Lavar o fundo do frasco repetidamente até que a maioria são HBMECre-suspensa. </li><li> Transferir a suspens celular para um tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Elimine o sobrenadante e as células em 1 mL de meio de ECM-b re-suspender. Contar as células e dilui-se a suspensão de células para se conseguir uma concentração final de 3 x 10 5 mL HBMEC por meio de ECM-b. </li></ol></li></ol> 2. Preparação do celular Cultura Insere <ol><li> Revestimento de inserções de cultura de células Nota importante: Evite tocar a membrana das inserções de cultura de células. <ol><li> Adicionar 100 de soluo de fibronectina (ver 1.1.1) de cada inserção de cultura de células (Figura 1A) e uma cavidade de uma placa de 96 poços de fundo plano (controlo óptico bem). Incuba-se durante pelo menos 3 h a 37 ° C. Depois da solução de incubação aspirado fibronectina. </li><li> Adicionar 100 mL HBMEC suspensão para as inserções de cultura de células e o controlo óptico bem. Adicionar 600 ul de ECM-b meio para o compartimento inferior da célulainserções cultura. Incubar durante 3 - 4 dias a 37 ° C / 5% de CO2 até que a integridade da barreira (Figura 1B) é atingido, verificar o crescimento celular por avaliação microscópica do HBMEC no controlo óptico bem. Nota: O crescimento celular para além de quatro dias não é recomendado. </li><li> Opcional: Para imitar as condições inflamatórias aspirar o meio a partir do compartimento inferior e substituí-la por ECM-b meio suplementado com 500 U / mL de IFN-γ / TNF-α 24 h antes do ensaio de migração. </li></ol></li></ol> 3. Controle de Qualidade com azul Evans no dia do ensaio Transmigração <ol><li> Preparação de solução de azul de Evans <ol><li> Para preparar PBS / B27 solução mistura de 10 mL de PBS com suplemento B27 200 ul utilizando um tubo de 15 ml de centrífuga. Diluir solução mãe de azul de Evans (20 mg / mL PBS) 1: 1000 com PBS / B27. </li></ol></li><li> ensaio de permeabilidade de azul de Evans <ol><li> Aspirar o meio do compartimento inferior seguido pelo compartimento superiorde uma inserção de cultura de célula contendo uma monocamada confluente HBMEC. Adicionar 100 mL Evans solução azul para a inserção de cultura de célula. </li><li> Adicionar 600 de PBS / B27 para o compartimento inferior e incubar durante 60 min a 37 ° C / 5% de CO 2. Cuidadosamente remover a inserção de cultura de célula usando uma pinça. </li></ol></li><li> medição de azul de Evans <ol><li> Remover PBS / B27 a partir do compartimento inferior e transferir 100 ul cada um de dois pos de uma polistirol preto placa de 96 poços de fundo plano. Inserir a placa num leitor de placas Tecan Pro Infinito M200 e determinar-z posição óptima. </li><li> excitação medida de azul de Evans, utilizando respectivas configurações (por exemplo: de excitação: 620 nm, emissão: 680 nm, largura de banda de excitação: 9 nm, largura de banda de emissão: 20 nm, realce 175x, 25 flashes, tempo de integração: 20 mS). </li><li> Para determinar as funções de barreira HBMEC comparar os dados adquiridos para uma curva padrão representando Evans permeação azul através HBMEC em diferentes pontos de tempo após a sementeing células (Figura 1B, à direita). </li></ol></li></ol> 4. Migração Assay <ol><li> Preparação de células mononucleares de sangue periférico (PBMC). <ol><li> Adicionar 10 mL de meio RPMI para um tubo de centrífuga de 15 ml e adiciona-se 200 uL suplemento B27. Contagem de células PBMC e de centrifugação a 300 xg durante 5 min. Re-suspender as PBMC a uma concentração final de 5 x 10 6 culas / mL de RPMI / B27. </li></ol></li><li> Defina-se o ensaio de migração <ol><li> Meio aspirado a partir do compartimento inferior seguido pelo compartimento superior de inserções de cultura de células contendo monocamadas confluentes HBMEC (Figura 1A). Por doador, adiciona-se 100 uL de suspensão de PBMC de cada para as inserções de cultura de células e também a um poço de uma placa de 24 poços por (in vitro de controlo). </li><li> Adicionar 600? L de RPMI / B27 para o compartimento inferior das inserções de cultura de células e 500 ul para o PBMC do controlo in vitro e incubar 6 h a 37 ° C / 5% de CO 2. </li&gt; </ol></li><li> Colheita de PBMC migrado <ol><li> Retire a inserção de cultura de célula usando uma pinça e lavar cuidadosamente a parte inferior com 400 uL de PBS sem tocar na membrana. Descartar a inserção de cultura de célula. </li><li> Adicionar 20 ul fluorosferas contagem de fluxo (cerca de 1000 esferas / uL) para o compartimento inferior da cultura celular inserir, bem como para o controlo in vitro e misturar bem. Transferir 1 ml da resultante suspensão de PBMC para tubos de citometria de fluxo. </li></ol></li></ol> 5. Citometria de Fluxo <ol><li> Preparação de amostra <ol><li> Centrífuga PBMC a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Preparar a soluo de anticorpo através da adição de anticorpos fluorocromo-conjugados com 100 uL de tampão de citometria de fluxo (PBS / BSA a 1% / EDTA a 2 mM) por amostra. Para os resultados apresentados abaixo 1 uL de CD4-FITC, um μLCD3-PerCP / Cy5.5, 1 uL de CD56-PC7, 1 uL CD8-A700, e 1 uL de CD16-A750 foram usadas por amostra. </li><li> Re-suspender PBMC em 100 mL da solução de anticorpo e incubar durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Adicionar 250 uL de tampão de citometria de fluxo e centrifugar a 300 xg durante 5 min. </li></ol></li><li> aquisição amostra <ol><li> Re-suspender as PBMC na quantidade necessária (varia de acordo com o citetro de fluxo utilizado) de tampão de citometria de fluxo. </li><li> Adquirir manchado de PBMC utilizando um citómetro de fluxo com um detector activa entre 525 e 700 nm comprimento de onda para detectar fluorosferas contagem de fluxo (excitação 488 nm, emissão a 525-700 nm). (Os passos seguintes são um exemplo, se um fluxo Gallios citómetro operado com o software Kaluza G é usada:. (1) Iniciar o computador (2) Quando o sistema de operação está completamente carregado, iniciar o citómetro de fluxo por prensagem a &quot;citómetro no&quot; botão . (3) Coloque o respectivo protocolo de aquisição, premindo o botão &quot;protocolo aberto&quot;. (4) Escolha o protocolo necessário e selecione &quot;abrir&quot;. (5) Duplicar o protocolo para cada amostra, clicando com o direitobotão do mouse sobre o protocolo visível no carrossel virtual e um clique esquerdo no campo &quot;duplicado&quot;. (6) Rotular cada amostra na lista de amostra. (7) Transferir as amostras para as posições indicadas do carrossel e iniciar a aquisição.) </li></ol></li><li> análise de amostras <ol><li> Abrir fluxo resultante citometria de dados usando o respectivo software. Determinar o número de sub-populações de interesse para PBMC transmigradas, bem como células in vitro a partir de poços de controlo e fluir fluorosferas contagem usando o respectivo software de análise. (Um exemplo da estratégia de intermitcia é dada na parte resultados (Figura 1 C: Para analisar a transmigração de subconjuntos de culas NK, seleccionar primeiro os linfócitos em um canal de dispersão para um lado (SSC) em relação ao canal de dispersão FSC) trama (linfócitos são. então exibidos num CD3 contra CD56 trama e CD56 + CD3 -. As células NK são seleccionados para distinguir entre os subconjuntos de células NK, células NK são exibidas emum contra CD56 CD16 CD56 CD16 trama e brilhante dim / - células NK, bem como CD56 CD16 + são seleccionadas dim. Além disso, fluorosferas contagem de fluxo são seleccionados a partir de um FSC SSC contra trama e posteriormente apresentado numa trama de um canal com uma emissão entre 525 e 700 nm versus tempo para determinar o seu número.) </li><li> Para calcular o número total de células de cada amostra, normalizar o número de células detectadas usando fluorosferas contagem de fluxo: <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/55390/55390eq1.jpg" /></li><li> Determinar a percentagem de células que migraram como a razão entre células que migraram totais e de células totais no controlo in vitro. </li></ol></li></ol>

The author(s) declared the following potential conflicts of interest with respect to the research, authorship, and/or publication of this article: A.S.-M. and U.B. have no financial disclosures. T. S.-H. received travel and conference expenses from Biogen. N.S. received speaker and advisory board honoraria from Biogen and Novartis Pharma, as well as travel expenses from Biogen. H.W. received compensation for serving on Scientific Advisory Boards/Steering Committees for Bayer Healthcare, Biogen, Merck Serono, Novartis, and Sanofi-Genzyme. He also received speaker honoraria and travel support from Bayer Vital GmbH, Bayer Schering AG, Biogen, CSL Behring, Fresenius Medical Care, Glaxo Smith Kline, GW Pharmaceuticals, Lundbeck, Merck Serono, Omniamed, Novartis, and Sanofi-Genzyme. He received compensation as a consultant from Biogen, Merck Serono, Novartis, and Sanofi-Genzyme. H.W. received research support from Bayer Vital, Biogen, Genzyme, Merck Serono, Novartis, Sanofi-Aventis Germany, and Sanofi US. C.C.G. received speaker honoraria and travel expenses for attending meetings from Genzyme, Novartis Pharma GmbH, and Bayer Health Care.

Aqui apresentamos uma técnica para investigar a transmigração de linfócitos através da barreira sangue-cérebro humano. A análise in vitro de migração de linfócitos para o SNC é importante para estudar processos básicos de extravasamento de linfitos, potenciais alterações relacionadas com a doença, e de novas abordagens terapêuticas. Várias modificações do modelo de barreira sangue-cérebro são possíveis. Por exemplo, as células do compartimento superio...

migração de linfócitos a partir do sangue para os tecidos é crucial para a vigilância imunitária. Uma sequência de interacções moleculares específicos assegura extravasamento local específico para o intestino delgado, de pele, nódulos linfáticos, o sistema nervoso central (CNS), e outros tecidos 1. Alterações na migração de linfócitos estão envolvidos na patofisiologia de uma série de doenças ampla disseminação 2. Migração para o SNC imuno-privilegiado é fortemente regulada e, consequentemente, alterações deste processo estão envolvidos em doenças relacionadas com o SNC, como encefalomielite 3, neuromielite óptica, acidente vascular cerebral, e esclerose múltipla (MS), 2, 4, 5, 6, 7. Portanto, é importante estudar o extravasamento de linfócitos para melhor compreender a fisiopatologia da doença e desenvolver ferramentas para uma<html> melhoramento da doença de carga 8, 9, 10, 11, 12. Os linfócitos migra para o SNC através de rotas distintas. Extravasamento através de vénulas pós-capilares para o espaço subaracnóide através da barreira sangue-fluido cerebrospinal dentro do plexo coróide e através da barreira sangue-cérebro ter sido descrito um, 13, 14, 15. Migração através da barreira sangue-cérebro é conduzida pela interacção de linfócitos com células endoteliais 14. Em contraste com as células endoteliais na periferia, as células endoteliais do SNC expressar quantidades elevadas de moléculas de juno apertadas, assim limitar rigorosamente a quantidade de células e proteínas capazes de atravessar a barreira sangue-cérebrolass = &quot;xref&quot;&gt; 16. Inflamação resulta em afrouxamento de junções apertadas e induz a expressão de moléculas de adesão; assim, aumentando a migração de linfócitos para o SNC 1, 17, 18. Extravasamento através da barreira sangue-cérebro é um processo de múltiplos passos. Linfócitos do tirante para as células endoteliais e, em seguida, rolar ao longo do endotélio em um processo mediado principalmente por selectinas 1, 15. Posteriormente, as interacções entre as quimioquinas segregadas pelo endotélio e os respectivos receptores de quimiocinas expressas em linfócitos induzir mudanças conformacionais de integrinas, promovendo assim a adesão firme para as células endoteliais 1. Finalmente, quer linfócitos de rastreamento ao longo da barreira endotelial contra o fluxo de sangue antes transmigrando para o espaço perivascular, ou parar imediatamente e directamente transmigrate no local da empresa de aderência 1, 19, 20. Todos estes passos de extravasamento de linfitos pode ser analisada in vitro utilizando técnicas distintas 21. Microscopia de lapso de tempo vídeo é usado para estudar o tethering inicial e rolando 15. Os ensaios de adesão fornecem informações detalhadas sobre a prisão firme endoteliais barreiras 22. Os ensaios de transmigração como demonstrado aqui permitem a análise de transmigração de células imunes 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29. Usando o modelo humano in vitro barreira hematoencefálica, que recentemente poderia mostrar que uma maior migrAtory capacidade de CD56 CD16 brilhante dim / - células NK em comparação com o seu CD56 dim CD16 + homólogos foi reflectida por uma predominância deste subconjunto de células NK no compartimento 21 intratecal. Assim, a instalação experimental parece ser adequado para mimetizar a situação in vivo.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>without CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; or MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Fibronectin 1 mg/mL</td><td>Sigma</td><td>F1141-5MG</td><td>from bovine plasma</td></tr><tr><td>T-25 cell culture flask</td><td>Greiner BioOne</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>HBMEC</td><td>ScienCell</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pelobiotech</td><td>PB-H-6023</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ECM-b</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial cell growth supplement</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Corning</td><td>3472</td><td>clear, 6.5 mm diameter, 3.0 &amp;micro;m pore size</td></tr><tr><td>96-well flat bottom plate</td><td>Corning</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Evans blue</td><td>Sigma</td><td>E2129-10G</td><td>stock solution: 1 g/50 mL PBS</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>50x concentrated</td></tr><tr><td>Infinite M200Pro</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well black flat bottom plate</td><td>Greiner BioOne</td><td>675086</td><td></td></tr><tr><td>48-well plate</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Flow Count Fluorospheres</td><td>Beckman Coulter</td><td>7547053</td><td></td></tr><tr><td>Na-EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Gallios 10-color flow cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaluza 1.5a</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNF-&amp;alpha;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&amp;gamma;</td><td>Peprotech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>CD3-PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>300430</td><td>clone UCHT1</td></tr><tr><td>CD56-PC7</td><td>Beckman Coulter</td><td>A21692</td><td>clone N901</td></tr><tr><td>CD16-A750</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66330</td><td>clone 3G8</td></tr><tr><td>CD4-FITC</td><td>Biolegend</td><td>300506</td><td>clone RPA-T4</td></tr><tr><td>CD8-A700</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66332</td><td>clone B9.11</td></tr></tbody></table>

analysis of lymphocyte extravasation using an in vitro model of the human blood-brain barrier

Linfócitos extravasão para o sistema nervoso central (SNC) é crítica para a vigilância imunitária. alterações relacionadas com a doença de extravasamento de linfócitos pode resultar em alterações fisiopatológicas no SNC. Assim, investigação sobre a migração de linfócitos para o SNC é importante para entender as doenças inflamatórias do sistema nervoso central e o desenvolvimento de novas abordagens de terapia. Aqui apresenta-se um modelo in vitro da barreira sangue-cérebro humano para estudar o extravasamento de linfitos. células endoteliais humanas microvasculares cerebrais (HBMEC) são cultivadas em confluently um tereftalato de polietileno poroso Transwell Insert para imitar o endotélio da barreira sangue-cérebro. a função de barreira é validado por zonula occludens imuno-histoquímica, a resistência eléctrica transendotelial (TEER) medidas bem como a análise de Evans permeação azul. Este modelo permite a investigação da diapedese de subconjuntos de linfócitos raras, tais como CD56 CD16 brilhante dim / - células NK. Furthermminério, os efeitos de outras células, citocinas e quimiocinas, alterações relacionadas com a doença, e regimes de tratamento diferentes na capacidade migratória de linfócitos podem ser estudados. Finalmente, o impacto de estímulos inflamatórios, bem como diferentes regimes de tratamento sobre a barreira endotelial pode ser analisado.

Os resultados representativos, mostrando a transmigração de células NK e subconjuntos de células T utilizando o modelo de barreira sangue-cérebro humano (Figura 1A) são mostrados. A integridade da monocamada HBMEC foi validado por coloração da molécula de junção estanque ZO-1, a resistência eléctrica medições transendotelial (TEER), e Evans permeação azul (Figura 1B). Seguindo 3 - 4 dias de cultura HBMEC expressa a molécula de junção ...

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Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Análise de Linfócitos extravasamento Usando um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo do Sangue-Cérebro humano Barreira

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

20.3K visualizações.  University Hospital Münster. Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro. 

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Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Melhoria da Metodologia para a Elaboração de um baseado em celular, Contact Modelo Humano da barreira hemato-encefálica

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Bioengenharia

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

Criação de um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de Rato barreira hemato-encefálica (BBB): A Focus on BBB impermeabilidade e Transportes Receptor mediada

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Medicina

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

A<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo da barreira sangue-cérebro que usa espectroscopia de impedância: Um foco na interação celular T Cell-endotelial

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Imunologia e Infecção

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of non-essential ions and toxic substances. Tight junctions (TJ) effectively seal the paracellular space in the monolayers resulting in an intact barrier. This study describes a LY-based fluorescence assay that can be used to determine its apparent permeability coefficient (Papp) and in turn can be used to determine the kinetics of the formation of confluent monolayers and the resulting tight junction barrier integrity in hCMEC/D3 monolayers. We further demonstrate an additional utility of this assay to determine TJ functional integrity in transfected cells. Our data from the LY Papp assay shows that the hCMEC/D3 cells seeded in a transwell setup effectively limit LY paracellular transport 7 days-post culture. As an additional utility of the presented assay, we also demonstrate that the DNA nanoparticle transfection does not alter LY paracellular transport in hCMEC/D3 monolayers.

We present a fluorescence assay to demonstrate that Lucifer Yellow (LY) is a robust marker to determine the apparent paracellular permeability of hCMEC/D3 cell monolayers, an in vitro model of the human blood-brain barrier. We used this assay to determine the kinetics of a confluent monolayer formation in cultured hCMEC/D3 cells.

Amarelo de Lucifer-um marcador Paracellular robusto da permeabilidade em um modelo da pilha do sangue humano-barreira do cérebro

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex vivo transmigration system. Group 2 innate lymphoid cells (ILC2) and CD4+ T helper cells were isolated from spleens and lungs of chicken egg ovalbumin (OVA)-challenged BALB/c mice. We confirmed the expression of CCR4 on both CD4+ T cells and ILC2, comparatively. CCL17 and CCL22 are the known ligands for CCR4; therefore, using this ex vivo transmigration method we examined CCL17- and CCL22-induced movement of CCR4+ lymphocytes. To establish chemokine gradients, CCL17 and CCL22 were placed in the bottom chamber of the transmigration system. Isolated lymphocytes were then added to top chambers and over a 48 h period the lymphocytes actively migrated through 3 &#181;m pores towards the chemokine in the bottom chamber. This is an effective system for determining the chemokinetics of lymphocytes, but, understandably, does not mimic the complexities found in the in vivo organ microenvironments. This is one limitation of the method that can be overcome by the addition of in situ imaging of the organ and lymphocytes under study. In contrast, the advantage of this method is that is can be performed by an entry-level technician at a much more cost-effective rate than live imaging. As therapeutic compounds become available to enhance migration, as in the case of tumor infiltrating cytotoxic immune cells, or to inhibit migration, perhaps in the case of autoimmune diseases where immunopathology is of concern, this method can be used as a screening tool. In general, the method is effective if the chemokine of interest is consistently generating chemokinetics at a statistically higher level than the media control. In such cases, the degree of inhibition/enhancement by a given compound can be determined as well.

In this protocol, lymphocytes are placed in the top chamber of a transmigration system, separated from the bottom chamber by a porous membrane. Chemokine is added to the bottom chamber, which induces active migration along a chemokine gradient. After 48 h, lymphocytes are counted in both chambers to quantitate transmigration.

Avaliação da migração do linfócito em um sistema de transmigração ex vivo

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

Análise de modelos de barreira hematoencefálica via coloração por imunofluorescência

Use of the MicroSiM (&#181;SiM) Barrier Tissue Platform for Modeling the Blood-Brain Barrier

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, the&#160;&#181;SiM provides experimentalists with new capabilities, including live cell imaging, unhindered paracrine signaling between &#39;blood&#39; and &#39;brain&#39; chambers, and the ability to directly image immunofluorescence without the need for the extraction/remounting of membranes. Here we demonstrate the basic use of the platform to establish monoculture (endothelial cells) and co-culture (endothelial cells and pericytes) models of the BBB using ultrathin nanoporous silicon-nitride membranes. We demonstrate compatibility with both primary cell cultures and human induced pluripotent stem cell (hiPSC) cultures. We provide methods for qualitative analysis of BBB models via immunofluorescence staining and demonstrate the use of the &#181;SiM for the quantitative assessment of barrier function in a small molecule permeability assay. The methods provided should enable users to establish their barrier models on the platform, advancing the use of tissue chip technology for studying human tissues.

Autor em destaque: Avançando o uso da tecnologia de chip de tecido para estudar tecidos humanos 

This report provides protocols for assembly, cell culture, and assays on the &#181;SiM platform for the construction of blood-brain barrier models.

Uso da Plataforma de Tecido de Barreira MicroSiM (μSiM) para Modelagem da Barreira Hematoencefálica

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, ...

<meta charset="utf8"></head><body>Visualização baseada em corante fluorescente da quebra da barreira hematoencefálica em camundongos

Evaluation of Blood-Brain Barrier Breakdown in a Mouse Model of Mild Traumatic Brain Injury

Fluorescent dyes are used to determine the extent of dye extravasation that occurs due to blood-brain barrier (BBB) breakdown. Labeling with these dyes is a complex process influenced by several factors, such as the concentration of dyes in the blood, permeability of brain vessels, duration of dye extravasation, and reduction in dye concentration in the tissue due to degradation and diffusion. In a mild traumatic brain injury model, exposure to blast-induced shock waves (BSWs) triggers BBB breakdown within a limited time window. To determine the precise sequence of BBB breakdown, Evans blue, and fluorescein isothiocyanate-dextran were injected intravascularly and intracardially into mice at various time points relative to BSW exposure. The distribution of dye fluorescence in brain slices was then recorded. Differences in the distribution and intensity between the two dyes revealed the spatiotemporal sequence of BBB breakdown. Immunostaining of the brain slices showed that astrocytic and microglial responses correlated with the sites of BBB breakdown. This protocol has broad potential for application in studies involving different BBB breakdown models.

<meta charset="utf8"></head><body>Avaliação da quebra da barreira hematoencefálica em um modelo de camundongo com lesão cerebral traumática leve

A method was developed to visualize dye extravasation due to blood-brain barrier (BBB) breakdown by administering two fluorescent dyes to mice at different time points. The use of glycerol as a cryoprotectant facilitated immunohistochemistry on the same sample.

Avaliação da quebra da barreira hematoencefálica em um modelo de camundongo com lesão cerebral traumática leve

Fluorescent dyes are used to determine the extent of dye extravasation that occurs due to blood-brain barrier (BBB) breakdown. Labeling with these dyes is ...

Análise de Linfócitos extravasamento Usando um

Resumo

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Melhoria da Metodologia para a Elaboração de um baseado em celular, Contact Modelo Humano da barreira hemato-encefálica

Criação de um

A

Amarelo de Lucifer-um marcador Paracellular robusto da permeabilidade em um modelo da pilha do sangue humano-barreira do cérebro

Avaliação da migração do linfócito em um sistema de transmigração ex vivo

Uso da Plataforma de Tecido de Barreira MicroSiM (μSiM) para Modelagem da Barreira Hematoencefálica

Uso da Plataforma de Tecido de Barreira MicroSiM (μSiM) para Modelagem da Barreira Hematoencefálica

Uso da Plataforma de Tecido de Barreira MicroSiM (μSiM) para Modelagem da Barreira Hematoencefálica

Avaliação da quebra da barreira hematoencefálica em um modelo de camundongo com lesão cerebral traumática leve

Avaliação da quebra da barreira hematoencefálica em um modelo de camundongo com lesão cerebral traumática leve