Estudos em animais foram realizados em conformidade com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo cuidado institucional do Animal e uso Comitê de Texas A & M University. Revisão e aprovação de um oficial de segurança de risco biológico ou comitê em sua instituição podem ser necessárias.
Atenção: Todos os procedimentos requerem BSL3 contenção. Os funcionários são obrigados a usar equipamentos de proteção individual em todos os momentos. Todas as manipulações são executadas dentro do gabinete de biossegurança (BSC) e todos os farelos são descartados em recipientes para objectos cortantes. BSC e superfícies de trabalho são limpas com álcool etílico fenol e 70% tamponado antes de iniciar o trabalho e depois do trabalho. Procedimentos normalmente seria feitos no nível de biossegurança 3 com Mycobacterium tuberculosis, mas para fins de filmagens e ilustração, os autores demonstram esses procedimentos no nível de biossegurança 2 com bactérias menos virulentas.
1. cepas e as condições de cultura
Nota: Cepa de M. tuberculosis CDC1551 é utilizada neste estudo, mas qualquer estirpe de M. tuberculosis pode ser usado da mesma maneira.
<ol><li>Crescem as bactérias em M-OADC-TW (7H 9 caldo suplementado com 0,5% de glicerol, ácido oleico de 10% dextrose complexo da catalase e 0,05% Tween-80) médio pé a 37 ° C para uma OD600 de 0.5 (~ 0.2 x 107 UFC).</li>
	<li>Diluir a cultura em M-OADC-TW (série de 01:10 diluições das bactérias). As diluições das bactérias da placa (105, 106, 107, 108) em triplicado em seletiva placas de 11 7 H para permitir a determinação de UFC.</li>
	<li>Incube as placas durante quatro semanas a 37 ° C ou até colônias podem ser contadas com precisão.</li>
	<li>Centrifugue o inóculo bacteriano a 8.534 x g por 5 min obter uma pelota. Lave o pellet uma vez com 10 mL de solução salina (0,9% NaCl) e ressuspender o sedimento em 15 mL de solução salina (0,9% NaCl).</li>
</ol>2. infecção de aerossol de ratos utilizando uma câmara de Madison
<ol><li>Permitir que os ratos se adaptar ao novo ambiente por uma semana.</li>
	<li>Pese os ratos antes de carregá-los para a câmara.</li>
	<li>Ligue os cabos de três para a faixa de poder: o poder da câmara principal, bomba de vácuo e o compressor de ar, nessa ordem.</li>
	<li>Cuidadosamente desparafuse o frasco de vidro. Trazer o frasco de vidro para a biossegurança do armário e adicionar o inóculo de desafio suspendido em 15 mL de solução salina (0,9% NaCl) para alcançar ~ 104 - 106 UFC de bactérias nos pulmões.</li>
	<li>Feche a tampa da jarra de vidro no armário a biossegurança. Anexar o frasco para a unidade de nebulização e ajustar o tubo vertical de aço inoxidável, de modo que a extremidade inferior (ingestão) é cerca de um quarto de uma polegada abaixo do nível do líquido no frasco.</li>
	<li>Carregar todos os animais que precisava para a experiência (a câmara pode conter até 90 ratos) na câmara e feche todas as travas na porta.</li>
	<li>Verifique a principal (quarto) medidor de fluxo de ar. Certifique-se de que o centro da boia (bola) funciona cerca de 50 L/min, medida na escala à esquerda.</li>
	<li>Pressione o botão Start no painel de controle da câmara. Defina a taxa de fluxo de ar através do medidor de fluxo de ar do compressor (o menor medidor no canto esquerdo) como 4 L/min na escala. Verificar visualmente para garantir que o inóculo de desafio é ser nebulizado.</li>
	<li>Depois de 15 min, quando a luz vermelha na parte frontal do painel de controle aparece, e um sinal sonoro indica o final da corrida, pressione o botão Reset no canto inferior direito do painel de controle para redefinir o timers.</li>
	<li>Mantenha pressionado o botão vermelho pequeno na porta da câmara para liberar o vácuo.</li>
	<li>Abra a porta da câmara e remover os animais. Coloque os ratos volta em suas gaiolas.</li>
	<li>Retire o copo do nebulizador e coloque em um recipiente de transporte selado, à prova de vazamentos. Coloque o recipiente dentro do armário de bio-segurança e descarte a suspensão de desafio dentro de um recipiente de recolha designado.</li>
	<li>Coloque o frasco nebulizador usado dentro de um saco de risco biológico e selar o saco para o transporte para a autoclave.</li>
	<li>No final do processo de infecção, pulverizar o interior da câmara com fenol e 70% de etanol tamponada e permitir que a câmara se sentar por 10 min.</li>
	<li>Em seguida, limpe todas as superfícies interiores acessíveis muito cuidadosamente. Elimine todas as toalhas de papel contaminadas, etc. para o lixo de risco biológico. Autoclave o lixo, recipiente de resíduos e utilizados frascos de nebulização.</li>
	<li>Coloca os animais na sala de contenção até o tempo-ponto de imagem.</li>
	<li>No dia da imagem latente, transferi os animais em um recipiente secundário para a sala da imagem latente.</li>
</ol>3. animal anestesia
<ol><li>Anestesia os ratos com isoflurano, usando um sistema de anestesia de gás personalizado.</li>
	<li>Pese cada uma cuba do filtro carvão dois, localizado no topo da unidade de anestesia.</li>
	<li>Substitua com um novo cilindro se o peso é de 50 g acima do peso inicial.</li>
	<li>Verificar se a unidade de vaporizador para garantir isoflurano suficiente para o procedimento.</li>
	<li>Coloque o suporte do cone de nariz dentro da câmara de imagem. Coloque o número de cones de nariz, necessário para o procedimento e selar as aberturas restantes com bloqueadores de cone de nariz.</li>
	<li>Ligue o fornecimento de oxigênio do cilindro de alta pressão e defini-lo em 55 libras por polegada quadrada.</li>
	<li>Ligue a bomba de evacuação, localizada em frente a unidade de anestesia e configurá-lo para 8 L/min.</li>
	<li>Ative a alternância de oxigênio localizada na frente da unidade de anestesia.</li>
	<li>Liga o fluxo de gás para a câmara de indução da anestesia para definir o fluxo de gás em vez de 1,5 L/min, o fluxo de gás fora.</li>
	<li>Liga o fluxo de gás para a câmara de imagem para definir o fluxo de gás em vez de 0,25 L/min, o fluxo de gás fora.</li>
	<li>Ligue o vaporizador de isoflurano e configurá-lo de 2-2,5%. Ajuste o nível de isoflurano, de acordo com o número e o peso dos animais sendo utilizados para o experimento, girando o dial sobre o vaporizador de isoflurano (2-2,5% para um mouse pesando ~ 20 g; 4% para um porquinho da Índia, pesando 300 g).</li>
	<li>Coloque os ratos na câmara de anestesia e feche a tampa. Liga o fluxo de gás para a câmara de indução da anestesia.</li>
	<li>Deixe os ratos na câmara de indução de anestesia, por 5-10 min até completamente anestesiada.</li>
	<li>Uma vez que os ratos são anestesiados, aplica uma pomada ótica para os olhos para protegê-los enquanto imagem.</li>
	<li>Coloque os ratos em prostração ventral ou esternal, tal que seus narizes são colocados no nariz cone para facilitar a anestesia de ratos durante o procedimento da imagem latente.</li>
</ol>4. imagens de fluorescência (REF) enzima repórter
<ol><li>Injete o substrato (20 µM, 2,5 µ l/g de peso) por injeção intraperitoneal para os infectados, bem como os ratos controle. Os ratos estão sob anestesia no interior da câmara de imagem por menos de 1 min.</li>
	<li>Inicie o sistema da imagem latente.</li>
	<li>Inicialize o sistema, clicando em Initialize. Espere até que a barra de temperatura se transforma em verde. Nota: A câmara de imagem consiste em uma plataforma aquecida para manter a temperatura corporal do animal enquanto imagem.</li>
	<li>Para configuração de aquisição de imagem, selecione fluorescente | Trans-iluminação para todo animal ou para os tecidos do pulmão, estrutura e sobreposição no painel de controle de aquisição de Epi-iluminação.</li>
	<li>Definir campo de visão de B para único rato e nível de lâmpada de alta.</li>
	<li>Definir o tempo de exposição para auto, binning médio, 2-3 para o f/stop e filtro de excitação em 745 filtros nm e emissão de 780 nm a 840 nm.</li>
	<li>Para configuração de sequência, clique em sequência de instalação, selecione 9-12 pontos de Trans-iluminação na área de pulmão.</li>
	<li>Clique em Acquire para aquisição de imagens.</li>
	<li>Coloque o mouse para a pós-imagem gaiola.</li>
	<li>Monitorar os ratos até totalmente recuperada ou sacrificar para quantificar o UFC se de imagem em um tempo-ponto do experimento. Execute uma pontuação de Karnofsky modificada para monitorar o bem estar dos ratos pós-imagem latente.</li>
</ol>5. análise de REF de imagem
<ol><li>Abra o software de imagem.</li>
	<li>Carrega arquivos de imagem clicando no ícone procurar.</li>
	<li>Para desagregação espectral, clique em desfazer espectral na paleta de ferramentas e clique em espectros de necessário para atrás. Clique em Iniciar desagregação.</li>
	<li>Para reconstrução da superfície óptica, clique na topografia de superfície.</li>
	<li>Selecione a orientação para dorsal, objecto de rato de peles e, clique em gerar superfície.</li>
	<li>Desenhar cortar imagem e conjunto imagem de limiar para uma região de interesse. Clique em concluído.</li>
	<li>Para o registro do órgão, vá para a aba de registro em 3D menu suspenso de instrumentos ópticos.</li>
	<li>Registre-se órgãos de interesse em um atlas do órgão.</li>
	<li>Ajuste tamanho do órgão ou local para a topografia da superfície gerada usando a ferramenta de transformação de ligar/desligar localizada sobre as ferramentas do painel de registro.</li>
	<li>Vá para tomografia computadorizada fluorescente reconstrução 3D (FLIT), e selecione analisar Tab. Selecione as imagens para ser incluído para análise, tipo a eficiência de fluorescência de transmissão normalizados (NTF) de imagem, clique em Iniciar.</li>
	<li>Verifique em selecionar tudo e reconstruir na guia de visualização de dados.</li>
	<li>Para quantificação de fluorescência, vá para ferramentas da região de interesse (ROI), adicionar o cubo ROI ao órgão de interesse e ajustar o tamanho do cubo para cobrir o órgão de interesse. Clique em medir ROIs 3D.</li>
	<li>Na janela de medições de ROI, ir para medições de ROI 3D, selecione o tipo de dados para unidade voxels e medições da fonte de pmolM-1cm-1.</li>
	<li>Salvar e/ou exportar o resultado da análise de reconstrução 3D de FLIT em um arquivo de dados ou figura.</li>
</ol>6. quantificação de bactérias pela UFC
<ol><li>Eutanásia em ratos por injeção intraperitoneal de 0,1 mL pentobarbital de sódio (390 mg/mL).</li>
	<li>Verifique se há reflexo pedal apertando as almofadas dos pés de ratos para assegurar que não há nenhuma reação reflexa.</li>
	<li>Explantes de tecido pulmonar de ratos usando uma tesoura e pinça estéril. Homogeneizar o tecido pulmonar em 1 mL de tampão fosfato salino (PBS) de 1x.</li>
	<li>Faça 10 vezes diluições em série do homogenate pulmão em PBS 1x estéril.</li>
	<li>Para o chapeamento, identificar três alíquotas de 20 µ l cada as respectivas diluições na placa de ágar.</li>
	<li>Incube as placas em uma incubadora a 37 ° C e monitor para o crescimento bacteriano.</li>
	<li>Contagem de colônias em cada local após o tempo de incubação e expressam como CFU / mL corrigindo para volume e diluição utilizando a seguinte equação: UFC / mL = (C/V) x M Onde C = colônia contagens por ponto, V = volume da amostra inoculada em cada placa (mL) e M = fator de multiplicação (recíproca da diluição utilizada). Nota: Se 11 colônias são contadas em um local para um volume de amostra de 0,002 mL a uma diluição de amostra de 10-4, utilizando a equação, a contagem de colônia será calculada como (11/0.02) x 104 = 5,5 x 106 UFC / mL</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lewinson, D. 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J., Riedel, E., Glickman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+radiographic+differentiation+of+lung+nodules+caused+by+mycobacteria+and+lung+cancer:+a+case-control+study.">Clinical and radiographic differentiation of lung nodules caused by mycobacteria and lung cancer: a case-control study.</a> BMC Infect Dis. 15 (482), (2015).</li></ol>

Ao usar técnicas de imagem, tais como REF, existem estratégias-chave que permitem a geração de dados robustas e consistentes. Imagem latente ótica produz luz espalhada em tecidos que podem afetar a profundidade de penetração, uma vez que é difícil de captar a luz emitida em todas as direções. Uso de um fluoróforo de infravermelho próximo (NIR) substrato para REF tendo um comprimento de onda de excitação e emissão no Querange de 700-900 nm de imagem facilita a absorção mínima do sinal fluorescente por tecidos de mamíferos. O substrato personalizado projetado foi construído, ligando um fluoróforo NIR, IRDye 800Cw para um quencher, QC IRDye-1, por um anel lactâmico permitindo fluorescência ressonância energética baseada em transferência têmpera. IRDye tem penetração de tecido excelente e características de dispersão de luz e não tem qualquer efeito prejudicial evidente mamíferos36, sendo liberado do sangue e órgãos por 24 h. fluorescência sinal significativamente aumenta começando 4 h após Administração de substrato, atingir o máximo níveis 6 h após a administração.
A dose infecciosa bacteriana, modo de administração da dose infecciosa e o substrato, bem como os pontos de tempo de imagem post infecção através da realização de estudos-piloto deve ser padronizada antes de embarcar em grandes e complexas, experiências. Estudos-piloto podem reduzir tempo e custo quando a imagem de um grande número de animais porque um procedimento padrão pode ser otimizado antes de fazer o experimento chave. Cargas bacterianas devem ser determinadas nos órgãos/tecidos de interesse, seguindo a imagem de corpo inteiro usando trans-iluminação e ex vivo pulmão imagem usando epi-iluminação para validar a fonte do sinal e determinar a qualidade da correlação com números bacteriana presente8. Estudos-piloto irão fornecer insights sobre o limiar da deteção, gama dinâmica da técnica, bem como a determinação das condições experimentais ideais para a imagem latente.
As principais vantagens de usar REF imagem como em comparação com outras estratégias de fluorescentes e bioluminescentes são sua alta sensibilidade e capacidade de imagem natural M. tuberculosis estirpes. REF de imagem utiliza a enzima cataliticamente robusta BlaC que é conservada em todos os isolados clínicos de M. tuberculosis e cepas de tuberculose-complexo. A grande sensibilidade de REF de imagem é devido à rápida taxa catalítica de BlaC em combinação com a retenção do produto fluorescente clivada pela célula hospedeira. O sinal continuamente aumenta enquanto o substrato está disponível, resultando em acúmulo quase ilimitado do sinal dentro da células infectadas e tecidos. Este aumento da sensibilidade de REF de imagem em comparação com abordagens alternativas de imagem permite a detecção específica de M. tuberculosis ambos em vitro e em vivo8,23,24, 29.
REF de imagem pode ser usado para a deteção bacteriana sem modificações genéticas, permitindo sua aplicação direta para qualquer modelo de infecção, de qualquer laboratório animais8,37 ou materiais clínicos humanos29,38 . REF pode ser usado para detectar e imagem de uma grande variedade de patógenos39,40, desde fluorogenic carcaças podem ser desenvolvidas para inúmeros alvos enzimáticos diferente BlaC como proteases, quinases, ureases e β-galactosidases. No entanto, cuidado pensamento deve ser dada ao alvo para garantir ele exibe as características ideais para a imagem latente. BlaC representa uma enzima bom modelo para características que garantam a aplicação bem sucedida desta estratégia. REF de imagem fornece uma leitura imediata na carga bacteriana presente nos pulmões durante infecções, que se apressa muito progresso no estudo da patogênese da tuberculose, uma vez que a determinação dos números bacterianas normalmente requer três a seis semanas, mas mesmo no mais organismos de crescimento rápido esta abordagem vai poupar uma grande quantidade de tempo. REF também pode ser usado para discriminar carcinomas de tuberculose, dos principais problemas no diagnóstico de lesões nodulares em pacientes41,42. REF serve como uma nova ferramenta para acelerar a imagem latente de tuberculose translacional e pode ser aplicada aos seres humanos, potencialmente permitindo rápida predição dos resultados terapêuticos.

A taxa de crescimento lento de M. tuberculosis é um obstáculo importante no diagnóstico rápido da tuberculose1,2,3. Enquanto a cultura com base em diagnóstico leva semanas para produzir resultados, esfregaço ácido-álcool resistentes tem limitações de diagnóstico4 em crianças de5 e pacientes co infectados com o vírus da imunodeficiência humana6,7. Tecnologias de imagem ópticas têm sido reconhecidas recentemente como uma alternativa aos tradicionais métodos de diagnóstico para tuberculose8,9. Fluorescência e bioluminescência podem ser usados para a imagem opticamente M. tuberculosis em animais vivos em tempo real10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19. Imagem latente ótica tem o benefício de uma avaliação rápida e específica de uma infecção com M. tuberculosis20,21,22.
Nós esboçamos detalhes para a imagem latente ótica de M. tuberculosis em ratos ao vivo usando REF. Este método é muito específico e sensível23,24 e, semelhante a outros métodos ópticos, é menos caro do que outros métodos de tuberculose (TB) de imagem25, incluindo tomografia computadorizada (CT)26, magnético ressonância de imagem (MRI)27e F-fluorodeoxyglucose a tomografia por emissão de pósitrons/CT (F-FDG PET-CT)28. REF utiliza personalizados substratos fluorescentes ou bioluminescentes que após clivagem por uma enzima bacteriana, produzir um produto fluorescente8,29. Portanto, tem a vantagem de não exigir uma estirpe de recombinantes repórter micobacteriana30,31. O substrato FRET descrito é composto por um fluorocromo e um quencher conectado por um anel β-lactâmico que é hidrolisado pela BlaC (β-lactamases), naturalmente constitutivamente expressado por tuberculose-complexo Mycobacterium8, 32. as bactérias diretamente geram sinal devido à atividade catalítica de REF que permite a amplificação por muitas ordens de magnitude e detecção sensível de M. tuberculosis.
O substrato REF utilizado neste estudo tem tecido excelente penetração em animais vivos e reduzido fundo devido ao seu longo comprimento de onda. Com esse substrato de longo comprimento de onda é possível alcançar um limite de detecção para M. tuberculosis de quase 100 formadoras de unidades (CFU) em vitro e < 1000 CFU nos pulmões de ratos na vivo (todo animal)8, 33. REF pode ser usado como uma ferramenta de diagnóstico para expectoração, materiais clínicos e até mesmo diretamente em pacientes com micro sistemas endoscópica16,32,33,34 devido a sua alta sensibilidade e especificidade. REF pode ser aplicado a qualquer tensão clínica de tuberculose, porque usa uma enzima bacteriana produzida naturalmente, BlaC, para a deteção presente em todas as estirpes. Estas características fazem REF imagem uma ferramenta valiosa na pesquisa pré-clínica tuberculose em geral para facilitar a terapêutica e avaliação de vacinas, bem como a análise de patogênese, mas também, em última análise, podem ser aplicadas ao diagnóstico de tuberculose pacientes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:664px;" width="664">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:163px;">VETONE</td>
			<td align="right" style="width:119px;">501027</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:216px;">CNIR800</td>
			<td style="width:163px;">Custom synthesized</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Fatal Plus solution</td>
			<td style="width:163px;">Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">7H9 Middlebrook broth</td>
			<td style="width:163px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">OADC Middlebrook enrichment</td>
			<td style="width:163px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">212351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sporcidin</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;">RE-1284F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">7H11 Middlebrook Agar</td>
			<td style="width:163px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">212203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Madison Chamber</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IVIS Spectrum</td>
			<td style="width:163px;">Perkin Elmer</td>
			<td align="right">124262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">XGI-8-gas Anesthesia System</td>
			<td style="width:163px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Living Imaging software</td>
			<td style="width:163px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Transparent nose cones</td>
			<td style="width:163px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">M. tuberculosis strain CDC1551</td>
			<td style="width:163px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Female BALB/C mice, 5-7 weeks</td>
			<td style="width:163px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging mycobacterium tuberculosis in mice with reporter enzyme fluorescence

Fluorescência de enzima repórter (REF) utiliza substratos específicos para enzimas presentes em organismos alvo de interesse para a imagem latente ou detecção por fluorescência ou bioluminescência. Nós utilizamos BlaC, uma enzima constitutivamente expressada por todas as cepas de M. tuberculosis . REF permite rápida quantificação de bactérias nos pulmões de ratos infectados. O mesmo grupo de ratos pode ser fotografado em muitos pontos do tempo, extremamente reduzindo custos, enumerando as bactérias mais rapidamente, permitindo que novas observações em interações patógeno-hospedeiro e aumentar o poder estatístico, desde que mais animais de cada grupo são facilmente mantidos . REF é extremamente sensível devido à natureza catalítica do repórter enzimática BlaC e específicas devido à transferência de energia de ressonância de flourescence personalizado (FRET) ou fluorogenic carcaças usadas. REF não requer cepas recombinantes, garantindo interações patógeno-hospedeiro normal. Descrevemos a imagem latente da infecção por M. tuberculosis utilizando um substrato de traste com emissão máxima em 800 nm. O comprimento de onda do substrato permite que a imagem sensível tecido profundo em mamíferos. Nós irá delinear a infecção de aerossol de ratos com M. tuberculosis, anestesia de ratos, a administração do substrato REF e óptico de imagem. Este método tem sido aplicado com sucesso para avaliar interações patógeno-hospedeiro e a eficácia dos antibióticos visando o M. tuberculosis.

REF imagem de camundongos infectados com M. tuberculosis juntamente com rato de controle não infectados são mostrados na Figura 1A. Os ratos infectados produziram um significativamente (P = 0.0057) maior sinal de fluorescência dos pulmões a pós-infecção 6 semanas, em relação ao controle após a administração de substrato. Um curso de tempo típico para estudar a eficácia terapêutica contra M. tuberculosis usando REF poderia ser imagens na semana 1, 2, 4, 6, 15, 24 pós infecção. Intensidade da fluorescência é quantificada usando epi-iluminação para tecidos do pulmão (Figura 1B). O sinal constantemente crescente de semana 2 para semana 6 nos pulmões de ratos infectados sugere que REF com sucesso capaz de detectar o M. tuberculosis in vivo. Uma gota no sinal de fundo de ratos controle em um momento posterior do tempo (Figura 1B) poderia ser atribuída ao aumento do corpo massa e volume de ratos durante um período de 6 semanas, reduzindo assim a penetração de comprimento de onda de excitação. Reconstrução 3D do FLIT de fontes de fluorescência em camundongos infectados com M. tuberculosis é representada na Figura 2. As sequências de imagem são adquiridas em vários pontos trans-iluminação do mouse usando a mesma excitação e série de filtros de emissão. Essas sequências de imagem são usadas para reconstrução 3D de FLIT para distribuição fonte fluorescente no âmbito da disciplina de animais. Figura 2 A-D demonstra as diferentes direções (coronal, sagital e transaxial) da tomografia computadorizada do mouse com o registro do órgão de pulmão. Eficiência NTF mapas para verificar a qualidade da reconstrução são representados na Figura 2,E. NTF permite subtrair o vazamento de luz de fundo de imagens trans-iluminação através de uma imagem extra capturado com filtro de densidade neutra. A imagem feita com o filtro de excitação específica (Figura 2E-medido) é normalizada para a imagem de transmissão, medida com o mesmo filtro de emissão e um filtro de excitação aberto (Figura 2E simulada) para dar o sinal produzido pelo substrato sozinho. O semelhante medido e simulado perfil de eficiência NTF tanto na horizontal (Figura 2-F) e vertical (Figura 2G) perfis com quase 0% percentagem erro (Figura 2E-% erro) fornece a evidência de uma reconstrução 3D de boa qualidade com redução de artefatos e sinal melhor localização e sensibilidade.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56801/56801fig1.jpg"> Figura 1 . Imagem de M. tuberculosis com REF. (A) imagem na vivo de ratos infectados e infectados com M. tuberculosis em 2, 4 e 6 semanas pós infecção. A barra de cor representa a intensidade do sinal fluorescente em fótons por segundo por cm2 de baixo (amarelo) para alto (vermelho). (B) a quantificação da intensidade de fluorescência de camundongos infectados com M. tuberculosis. Valores de fluorescência para ambos controle (preto) e infectado (vermelho) é representado junto com o erro-padrão para cada ponto de tempo. O significado dos resultados foi determinado por estudantes t-teste, valores de p de < 0,05 foram considerados significativos. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56801/56801fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56801/56801fig2.jpg"> Figura 2 . Reconstrução 3D do FLIT de fontes de fluorescência em camundongos infectados com M. tuberculosis. Tomografia computadorizada de mouse representada em diferentes direções; A) coronal, B) sagital e C) transaxial com registro de órgão de pulmão D). A região 3D de interesse (ROI) é representada como um cubo vermelho no pulmão para medições de fonte. (E) eficiência NTF mapas do medido e simulado para verificação da qualidade da reconstrução. O perfil de eficiência medido e simulado NTF foi comparado, providing de boa qualidade da reconstrução 3D (eficiência semelhante medida e simulada de NTF). F) Horizontal e G) sinal vertical perfis representando medido (azul) e simulado a curva de eficiência NTF (vermelha). As barras vermelhas horizontais e verticais indicam a posição de origem. A barra de cor representa a intensidade do sinal fluorescente em fótons por segundo por cm2 de baixa (azul) para alto (vermelho). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56801/56801fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Descrevemos a imagem óptica de camundongos infectados com Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) usando fluorescência de enzima repórter (REF). Esse protocolo proporciona uma detecção sensível e específica de M. tuberculosis em modelos animais pré-clínicos para investigação patogenia, terapêutica e vacina.

Mycobacterium tuberculosis em camundongos com fluorescência de enzima do repórter de imagem

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

imaging-mycobacterium-tuberculosis-mice-with-reporter-enzyme

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

7.3K visualizações.  Texas A&M Health Science Center. Descrevemos a imagem óptica de camundongos infectados com Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) usando fluorescência de enzima repórter (REF). Esse protocolo proporciona uma detecção sensível e específica de M. tuberculosis em modelos animais pré-clínicos para investigação patogenia, terapêutica e vacina.

Vídeo: Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) drug-resistant strains threatens to derail current disease control efforts. Thus, there is an urgent need to develop drugs and vaccines that are more effective than those currently available. The genome of M. tuberculosis has been known for more than 10 years, yet there are important gaps in our knowledge of gene function and essentiality. Many studies have since used gene expression analysis at both the transcriptomic and proteomic levels to determine the effects of drugs, oxidants, and growth conditions on the global patterns of gene expression. Ultimately, the final response of these changes is reflected in the metabolic composition of the bacterium including a few thousand small molecular weight chemicals. Comparing the metabolic profiles of wild type and mutant strains, either untreated or treated with a particular drug, can effectively allow target identification and may lead to the development of novel inhibitors with anti-tubercular activity. Likewise, the effects of two or more conditions on the metabolome can also be assessed. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a powerful technology that is used to identify and quantify metabolic intermediates. In this protocol, procedures for the preparation of M. tuberculosis cell extracts for NMR metabolomic analysis are described. Cell cultures are grown under appropriate conditions and required Biosafety Level 3 containment,1 harvested, and subjected to mechanical lysis while maintaining cold temperatures to maximize preservation of metabolites. Cell lysates are recovered, filtered sterilized, and stored at ultra-low temperatures. Aliquots from these cell extracts are plated on Middlebrook 7H9 agar for colony-forming units to verify absence of viable cells. Upon two months of incubation at 37 &deg;C, if no viable colonies are observed, samples are removed from the containment facility for downstream processing. Extracts are lyophilized, resuspended in deuterated buffer and injected in the NMR instrument, capturing spectroscopic data that is then subjected to statistical analysis. The procedures described can be applied for both one-dimensional (1D) 1H NMR and two-dimensional (2D) 1H-13C NMR analyses. This methodology provides more reliable small molecular weight metabolite identification and more reliable and sensitive quantitative analyses of cell extract metabolic compositions than chromatographic methods. Variations of the procedure described following the cell lysis step can also be adapted for parallel proteomic analysis.

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

The metabolomic profile of Mycobacterium tuberculosis is determined after growth in broth cultures. Conditions can be varied to test the effects of nutritional supplements, oxidants, and anti-tuberculosis agents on the metabolic profile of this microorganism. Procedure for extract preparation is applicable for both 1D 1H and 2D 1H-13C NMR analyses.

Preparação de amostras de<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Extractos para Estudos Nucleares metabolômica Ressonância Magnética

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Imunologia e Infecção

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

Crescimento de Mycobacterium tuberculosis Biofilmes

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

Um modelo experimental para estudar a Tuberculose-Malária Coinfection sobre Transmissão Natural de Mycobacterium tuberculosis E Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

Demonstrando um multi-resistente<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Ampliação Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

Um modelo de tecido Pulmão humano 3D para estudos funcionais em<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infecção

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that enhances the phagocytic functionality of neutrophils. Although extensive studies have unveiled the existence and importance of neutrophil priming during infection and injury, means of visualizing this process in vivo have been unavailable. The protocol provided enables monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals by combining three methodologies: 1) DsRed reporter signal &#8212; used as a measure of priming 2) in vivo neutrophil labeling &#8212; achieved by injection of fluorescence-conjugated anti-lymphocyte antigen 6G (Ly6G) monoclonal antibody (mAb) and 3) intravital confocal imaging. Several critical steps are involved in this protocol: oxazolone-induced mouse ear skin inflammation, appropriate sedation of animals, repeated injections of anti-Ly6G mAb, and prevention of focus drift during imaging. Although a few limitations have been observed, such as the limit of continuous imaging time (~ 8 hr) in one mouse and the leakage of fluorescein isothiocyanate-dextran from blood vessels in the inflammatory state, this protocol provides a fundamental framework for intravital imaging of primed neutrophil behavior and function, which can easily be expanded to examination of other immune cells in mouse inflammation models.

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

Imagem intravital de neutrófilos Priming Usando IL-1-driven promotor DsRed Mice Reporter

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

Sistema de Eficácia e citotoxicidade Rastreio de inibidores Segmentação intracelular<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Um ensaio Compatível de alta capacidade para avaliar droga Eficácia contra macrófagos passadas<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

Análise de 18FDG PET-CT Imaging como uma ferramenta para estudar infecção por Mycobacterium tuberculosis e tratamento em primatas não-humanos

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this bacterium causes a wide disease spectrum in humans ranging from a sterilized infection to an actively progressing deadly disease. The most common form is the latent tuberculosis, which is asymptomatic, but has the potential to reactivate into a fulminant disease. Adult zebrafish and its natural pathogen Mycobacterium marinum have recently proven to be an applicable model to study the wide disease spectrum of tuberculosis. Importantly, spontaneous latency and reactivation as well as adaptive immune responses in the context of mycobacterial infection can be studied in this model. In this article, we describe methods for the experimental infection of adult zebrafish, the collection of internal organs for the extraction of nucleic acids for the measurement of mycobacterial loads and host immune responses by quantitative PCR. The in-house-developed, M. marinum-specific qPCR assay is more sensitive than the traditional plating methods as it also detects DNA from non-dividing, dormant or recently dead mycobacteria. As both DNA and RNA are extracted from the same individual, it is possible to study the relationships between the diseased state, and the host and pathogen gene-expression. The adult zebrafish model for tuberculosis thus presents itself as a highly applicable, non-mammalian in vivo system to study host-pathogen interactions.

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Here, we present a protocol to model human tuberculosis in an adult zebrafish using its natural pathogen Mycobacterium marinum. Extracted DNA and RNA from the internal organs of infected zebrafish can be used to reveal the total mycobacterial loads in the fish and the host&#39;s immune responses with qPCR.

Modelagem de tuberculose no Zebrafish adulto infectado de Mycobacterium marinum

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

Mycobacterium tuberculosis em camundongos com fluorescência de enzima do repórter de imagem

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Preparação de amostras de

Crescimento de Mycobacterium tuberculosis Biofilmes

Um modelo experimental para estudar a Tuberculose-Malária Coinfection sobre Transmissão Natural de Mycobacterium tuberculosis E Plasmodium berghei

Demonstrando um multi-resistente

Um modelo de tecido Pulmão humano 3D para estudos funcionais em

Imagem intravital de neutrófilos Priming Usando IL-1-driven promotor DsRed Mice Reporter

Sistema de Eficácia e citotoxicidade Rastreio de inibidores Segmentação intracelular

Um ensaio Compatível de alta capacidade para avaliar droga Eficácia contra macrófagos passadas

Análise de ¹⁸FDG PET-CT Imaging como uma ferramenta para estudar infecção por Mycobacterium tuberculosis e tratamento em primatas não-humanos

Modelagem de tuberculose no Zebrafish adulto infectado de Mycobacterium marinum