Este protocolo de genotipagem da MLB aumentou muito nossa compreensão da epidemiologia e da estrutura populacional global de Yersinia ruckeri, uma bactéria patogênica de peixes de importância internacional. Comparado com esquemas de digitação yersinia ruckeri previamente estabelecidos, ele oferece uma resolução de tensão muito alta. O procedimento é simples, barato e concede resultados portáteis que podem ser facilmente comparados entre laboratórios.
A técnica melhora muito a especificidade do diagnóstico e permite o rastreamento de infecções. Por exemplo, agora podemos muitas vezes distinguir clones virulentos yersinia ruckeri existentes no pano de fundo de cepas ambientais não virulentas. Demonstrando o procedimento estará Saima Nasrin Mohammad, técnica do nosso laboratório.
Para começar, use laços de inoculação estéreis para semear culturas puras de Yersinia ruckeri em qualquer tipo de ágar adequado em placas de Petri. Incubar a 22 graus Celsius por um a dois dias ou 15 graus Celsius por três a quatro dias. Depois disso, usando laços de inoculação, escolha uma única colônia representativa de cada placa de Petri e transfira para tubos de centrífuga de 1,5 mililitro, contendo 50 microliters de água ultra purificada para resuspend.
Vórtice brevemente e incubar por sete minutos em um bloco de aquecimento a 100 graus Celsius. Em seguida, centrífuga a 16.000 g por três minutos e use uma pipeta para transferir cuidadosamente o DNA do modelo supernante em tubos vazios de centrífuga de 1,5 mililitro. Vá para o próximo passo ou armazene o DNA a 20 graus Celsius.
Para preparar misturas mestras, primeiro calcule os volumes de reagentes de acordo com o número de amostras bacterianas a serem analisadas, também contabilizando um controle negativo e um positivo, e um volume final de 10% excedente, conforme detalhado no manuscrito. Observe que diferentes concentrações de primer são usadas. Em dois tubos de centrífugas separados, um por ensaio PCR, adicione multiplex PCR mais mix mestre, primers e água sem RNase.
Vortex o mestre preparado se mistura suavemente em baixa velocidade e, em seguida, distribua 22 microliters de cada mistura mestre separadamente em poços individuais em tiras pcr ou placas. Em seguida, adicione três microliters do modelo de DNA preparado a cada poço contendo mistura mestre;dois poços por amostra de bactérias, um para cada ensaio. Use DNA de uma cepa yersinia ruckeri verificada para um controle positivo, e água ultra purificada para um controle negativo.
Selar e centrífugas brevemente. Carregue as reações preparadas em um ciclo termo de PCR e configure o programa de acordo com o manuscrito. O programa será concluído em menos de três horas.
De acordo com as recomendações do fabricante, adicione pó de gel de agarose em uma vez tampão TBE para atingir 1,5% de peso/volume e calor para dissolver. Antes da fundição, esfrie brevemente a solução de gel dissolvido sob água corrente, adicione 5 microliters de corante de ácido nucleico fluorescente por 50 microliters de solução de gel e misture. Monte e nivele a bandeja de fundição.
Adicione cones conforme apropriado para o número de amostras. Despeje a solução de gel no gesso e espere que ela se solidifique. Depois disso, submergir o molde contendo o gel em uma vez tampão TBE em um sistema de eletroforese gel.
Misture cinco microliters dos produtos PCR junto com dois microliters de corante de carregamento em novas tiras PCR. Transfira cinco microliters das misturas para os poços do gel. Guarde pelo menos um bem vazio.
Adicione cinco microliters de escada de DNA no poço vazio para referência. Ligue os eletrodos e execute o gel a 110 volts por 15 centímetros por aproximadamente uma hora. Use um sistema de imagem em gel baseado em UV para verificar a presença de várias bandas representando amplicons da RPC.
Após a confirmação dos amplicons PCR, use novas tiras ou placas PCR para diluir produtos PCR de um a 10 em água purificada. Vórtice e centrífuga brevemente. Enquanto trabalha em um armário de fumaça, prepare uma mistura mestra em um tubo de centrífuga que consiste em formamida e solução padrão de tamanho de referência.
De acordo com o número de produtos pcr a serem analisados, utilize volumes de reagentes conforme detalhado no manuscrito. Permitir um volume de 10% excedente. Vórtice brevemente e distribua 9,5 microliters em poços individuais em uma placa PCR apropriada para o sistema de eletroforese capilar disponível.
Em seguida, adicione 0,5 microliters de produto PCR diluído. Selar e centrífugas brevemente. Em seguida, carregue a placa contendo as amostras em um ciclo termo de PCR e desnatura as amostras a 95 graus Celsius por três minutos antes de esfriar a quatro graus Celsius indefinidamente.
Centrifugar a 1000 g por um minuto, retire cuidadosamente o selo e carregue a placa em um sistema de eletroforese capilar calibrada de acordo com as instruções do fabricante. Execute a eletroforese capilar de análise de fragmentos, utilizando reagentes conforme apropriado para o aparelho de escolha, e ajuste as condições de execução de acordo com a descrição do manuscrito. Para a chamada de tamanho de eletroforese capilar yersinia ruckeri VNTR, primeiro importar arquivos de resultado de eletroforese capilar no software Gene Mapper 5.
Defina o método de análise para, Microsatélite Padrão, selecione a escolha apropriada do produto sob o padrão de tamanho e pressione o botão Analisar. Através do editor de correspondência de tamanho, verifique a identificação correta dos fragmentos padrão de tamanho e retifice quaisquer alocações visivelmente errôneas. Em seguida, selecione a amostra a ser lida, aperte o botão Exibir plot e pressione o Controle A para ativar a visualização da tabela de dimensionamento.
Enquanto estiver no painel superior, segure o Controle, enquanto clica nos cinco picos que representam os amplicons VNTR. Pressione o Controle G para filtrar a tabela de dimensionamento, mostrando apenas características dos cinco picos destacados e registrar as chamadas de tamanho para cada lócus VNTR para aplicação a jusante. Para explicar os padrões tendenciosos de mobilidade de amplicon durante a eletroforese capilar, calcule as contagens precisas de repetição de VNTR empregando as chamadas de tamanho adquirido em combinação com as variáveis específicas do lócus.
A fórmula pode ser implementada em um modelo de planilha para automação. Na planilha, a repetição vnrt calculada em volta conta para o inteiro mais próximo antes da análise a jusante. No software BioNumerics, crie um novo banco de dados e opte por ativar o plugin MLVA.
No painel do tipo de experimento, pressione Criar novo tipo de experimento, escolher o tipo caractere e usar as configurações padrão quando solicitado. Em seguida, selecione o novo experimento e adicione novos caracteres para cada um dos 10 VNTR loci, empregando de zero a 100 como a faixa de valor. De volta ao painel principal, importe as contagens de repetição do Yersinia ruckeri VNTR e os dados do método, selecionando campos e caracteres de importação.
Localize o arquivo onde este é armazenado e faça seleções na coluna tipo Destino. Para os VNTRs, isso significa selecionar o valor de caractere apropriado, enquanto os metadados diversos são classificados como campos de informações de entrada. As escolhas feitas podem ser armazenadas como um modelo, a fim de facilitar o processo para depois.
Selecione amostras importadas destinadas à análise de cluster MST e clique no novo botão de comparação no painel Comparações. Se desejar a apresentação visual do MST, aloque as amostras para grupos coloridos, por exemplo, de acordo com um recurso de metadados específicos. Em seguida, selecione Análise avançada de cluster e MST para obter dados categóricos para gerar um diagrama de MST com base nas amostras escolhidas.
Modifique ainda mais a apresentação visual do MST adicionando parâmetros de partição, comprimentos cruzados, rotulagem de ramo de nó, etc. Se necessário, exporte o MST finalizado em formato desejado usando a seleção de imagem Exportar. Após o MULTIPLEX PCR, a imagem de eletroforese em gel verifica a presença de múltiplos amplicons em todas as 12 faixas contendo amostras, com a primeira pista representando a escada de DNA utilizada.
Em eletroferómosmos resultantes da eletroforese capilar, os diferentes locis VNTR podem ser identificados de acordo com uma combinação de tamanho e rotulagem de corante. Picos laranja representam o tamanho padrão empregado. Um exemplo de árvore de abrangência mínima, com base nos perfis MLVA de isolados yersinia Ruckeri recuperados de salmão atlântico em cinco fazendas norueguesas diferentes é mostrado.
Uma clara tendência de agrupamento ligada à origem da fazenda pode ser observada. A identificação pela MLVA de diferentes clones yersinia ruckeri dominando, por exemplo, em determinadas regiões geográficas de espécies de peixes, já foi explorada para melhorar as estratégias de vacinação contra esse patógeno.
