Para começar, pegue os fragmentos de DNA da célula escassa puxados com biotina. Prepare uma mistura mestra adicionando os reagentes para o rejeito de dATP e incube a amostra por 30 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, inative o exo-menos de Klenow incubando a amostra por 10 minutos a 65 graus Celsius e resfriando-a no gelo.
Após lavar as esferas com 300 microlitros cada de TB, NTB e 100 microlitros de tampão de ligadura, ressuspendê-las em 50 microlitros de tampão de ligadura. Adicione quatro microlitros de 15 micromolares pré-recozidos e um microlitro de 2000 unidades por microlitro de DNA T4 ligase à amostra. Lave as contas com 400 microlitros de TB, 200 microlitros de NTB e 100 microlitros de tampão de restrição dois.
Depois de amplificar a biblioteca por PCR, agrupe todas as reações de 50 microlitros da mesma amostra em um tubo de baixa ligação de DNA de 1,5 mililitro. Coloque-o em um ímã de tubo e espere até que todas as contas estejam presas à parede. Transfira o sobrenadante que contém a biblioteca para um novo tubo de baixa ligação de DNA de 1,5 mililitro e complemente com tampão TLE para 500 microlitros.
Para realizar uma seleção frente e verso usando purificação de esferas paramagnéticas, adicione 200 microlitros de contas de estoque à biblioteca, misture por vórtice e incube por 10 minutos, girando à temperatura ambiente. Em seguida, coloque a biblioteca em um ímã e espere até que todas as contas fiquem presas à parede. Transfira o sobrenadante que contém a biblioteca para um novo tubo de baixa ligação de DNA de 1,5 mililitro.
Concentre as contas pegando 750 microlitros de contas de estoque e colocando-as em um tubo de 1,5 mililitro em um ímã. Uma vez que todas as contas estão presas à parede, remova o sobrenadante e ressuspenda as contas por vórtice em 300 microlitros de novas contas de estoque. Adicione 300 microlitros de contas concentradas à amostra.
Misture por vórtice e incube por 10 minutos, girando à temperatura ambiente. Coloque em um ímã. Espere até que todas as contas estejam presas à parede e remova o sobrenadante.
Lave as contas adicionando um mililitro de etanol 70% ao tubo com as contas ainda no ímã. Deixe as contas secarem ao ar e ressuspenda-as em 21 microlitros de tampão TLE por vórtice. Para eluir a biblioteca das contas, incube a amostra por 10 minutos a 37 graus Celsius em um termobloco.
Coloque o tubo em um ímã e transfira o sobrenadante que contém a biblioteca para um novo tubo de baixa ligação de DNA de 1,5 mililitro.
