Este protocolo é utilizado para mapeamento e discriminação das transcrições primárias e processadas em mitocôndrias de milho. Esta técnica inclui uma etapa de normalização do RNA e minimiza a influência de cinco triphosfatos instáveis que dificulta uma clara discriminação entre as transcrições primárias e as processadas. Além das mitocôndrias de milho, esse método poderia ser aplicado a plastídeos e outras mitocôndrias vegetais.
Comece coletando 20 gramas de grãos em desenvolvimento em um tubo de 50 mililitros no gelo. Transfira os grãos para uma argamassa pré-resfriada e adicione de 10 a 20 mililitros de tampão de extração gelada. Triture os grãos completamente, adicione mais tampão de extração e filtre o tecido moído através de duas camadas de pano de filtro.
Centrifugar o filtrado a 8.000 vezes G por 10 minutos. Em seguida, transfira o supernasal para um novo tubo e descarte o filtrado. Centrifugar o tubo a 20.000 vezes G por 10 minutos.
Despeje o supernatante e suspenda a pelota em seis mililitros de tampão de lavagem. Aliquot a suspensão em cinco tubos de 1,5 mililitros RNase-free e centrifus-los a 14.000 vezes G por cinco minutos. Descarte o supernatante e congele a pelota mitocondrial em nitrogênio líquido.
Extraia RNA mitocondrial usando reagentes comerciais de acordo com as instruções do fabricante e configure um tratamento de polifosfatose RNA cinco prime. Em seguida, recupere o RNA com um kit de purificação de RNA. O reagente usado para extração de RNA é perigoso.
Sempre trabalhe com ele em um capuz de fumaça e sempre use jaleco e luvas. Prepare duas reações de circularização usando as mesmas quantidades de cinco RNAs mitocondrial tratados e mitocondrial não tratados. Incubar ambas as reações a 16 graus celsius por 12 a 16 horas e, em seguida, recuperar os RNAs auto-ligados com um kit de purificação de RNA usado anteriormente.
Comece preparando uma mistura de primer com uma proporção igual de 26 SCRT e até sete outros primers de transcrição reversa. Monte dois sistemas de reação de transcrição reversa de acordo com as instruções do manuscrito e incuba-os a 42 graus celsius por 50 minutos. Para normalizar o cDNA, prepare duas reações de PCR com o mesmo volume de cDNA's dos cinco RNAs tratados ou não tratados e execute a reação sob condições termociclizantes descritas no manuscrito.
A normalização por rRNA maduro 26S é um passo fundamental para discriminar entre as transcrições primárias e as processadas. Compare a abundância dos dois produtos PCR e, se necessário, otimize a normalização ajustando as quantidades de cDNA's do modelo. Prepare pares de reações pcr com volumes apropriados de cDNA's normalizados e um par de primers divergentes como na junção de cinco prime a três prime das transcrições de destino e execute PCR de acordo com as instruções do manuscrito.
Em seguida, use um kit de recuperação de DNA em gel para isolar as bandas proeminentes que são amplificadas por PCR aninhado. Clone os produtos PCR purificados em gel em um vetor usando técnicas padrão e execute o PCR colônia para selecionar clones positivos contendo as pastilhas de destino. Sequencie os produtos PCR e alinhe os dados de sequenciamento com o genoma mitocondrial de milho usando a ferramenta básica de pesquisa de alinhamento local ou BLAST.
Escolha a coleta de nucleotídeos de milho do organismo e pesquise o banco de dados. Encontre a junção principal de cinco a três primos da transcrição circularizada e determine as posições dos cinco termini de transcrição principal e três prime. Amplie o fragmento de DNA usado para preparar a sonda RNA e cloná-la no vetor usado anteriormente que contém um promotor T7, 17 pares de base a montante do local de inserção.
Rotule as sondas de RNA com dig-11-UTP e realize a hibridização do RNA usando kits comerciais. Discriminar as cinco extremidades primárias e processadas comparando os produtos circulares RT-PCR obtidos a partir dos cinco RNAs tratados e não tratados de polifosfatase normalizados. Em seguida, projete primers RT-PCR quantitativos com base nos resultados do mapeamento e verifique os resultados de discriminação com o RT-PCR.
O gene COX-2 foi usado como exemplo para demonstrar o mapeamento e a discriminação das transcrições mitocondriais de milho com a estratégia circular baseada em RT-PCR. Os cDNAs normalizados foram utilizados como modelos para PCR, o que resultou em duas bandas proeminentes amplificadas a partir da amostra tratada de polifosfatase primindo. As duas bandas foram nomeadas COX-2 um e dois recuperados do gel e clonados em vetores.
Os resultados da COLÔNIA PCR mostraram que os clones positivos contêm inserções com tamanho variável, o que implica que os termini têm cinco termini primos ou três primos. Os resultados de sequenciamento mostraram que cox-2 um e dois têm as mesmas três extremidades primos a 39 nucleotídeos a jusante do codon stop enquanto seus cinco termini primos estão localizados em 992-1, 030 e 1.276 a 1. 283 nucleotídeos a montante do códon inicial, respectivamente. A hibridização da mancha de gel RNA foi realizada para verificar os resultados circulares de mapeamento RT-PCR e duas grandes bandas com tamanhos semelhantes ao COX-2 um e dois foram detectados.
Outro par de primers divergentes foram projetados para amplificar o COX-2 três e quatro bandas detectadas com a mancha de gel RNA, mas não com a primeira vez circular RT-PCR. Os resultados quantitativos do RT-PCR confirmaram que cox-2 um, dois, três e quatro eram sensíveis a cinco polifosfátases primos e que eles tinham cinco termini primários. A análise de extensão do primer poderia ser realizada para verificar os cinco resultados de mapeamento primo, embora não esteja incluído neste protocolo.
