A expansão ex vivo de células-tronco hematopoiéticas da unidade sanguínea do cordão umbilical tem grande promessa para a aplicação do HSC em medicina regenerativa e terapia de transplante. Este protocolo usa um coquetel de citocina combinado com o tratamento de ácido valpróico para expandir rapidamente um grande número de HSCs funcionais com características que se assemelham aos HSCs primitivos primários. Devido aos efeitos imediatos do tratamento do ácido valpróico, este método também tem o potencial de superar a perda de HSCs associados à edição de genes.
Este método pode ser benéfico para a geração de um maior número de células geneticamente modificadas dentro de um período de tempo que é relevante para protocolos de modificação genética atualmente usados. O protocolo de expansão do ácido valpróico ex vivo é relativamente simples e confiável. A purificação de células CD34 positivas com o dispositivo separador de células é altamente reprodutível e rápida, permitindo a recuperação rápida de células CD34 positivas altamente purificadas.
24 horas antes do isolamento das células positivas do CD-34 do sangue do cordão umbilical, prepare o tampão de separação adicionando dois mililitros de 0,5 molar EDTA e 33 mililitros de 7,5% BSA a 465 mililitros de 1X PBS. Misture o tampão suavemente e mantenha-o durante a noite a quatro graus Celsius. No dia da purificação, aqueça a mídia à temperatura ambiente.
Distribua toda a unidade de sangue do cordão umbilical em um frasco de 75 centímetros quadrados. Diluir o sangue com um volume igual de PBS à temperatura ambiente e misturar suavemente. Em seguida, determine o número de tubos necessários para o processamento de toda a unidade sanguínea do cordão umbilical.
Adicione 15 mililitros de mídia gradiente de densidade a cada tubo. Dispense o sangue diluído muito lentamente em cima do gradiente de densidade enquanto segura o tubo em um ângulo de 45 graus para criar duas camadas. Centrifugar o tubo a 400 g por 30 minutos com baixa aceleração e taxa de desaceleração.
Após a centrifugação, as células mononucleares estarão localizadas na camada branca entre as camadas de mídia de plasma e gradiente de densidade. Transfira cuidadosamente a camada do casaco buffy para um novo tubo de 50 mililitros. Colete todas as células mononucleares da mesma unidade sanguínea do cordão umbilical em um tubo de 50 mililitros até atingir 25 mililitros.
Adicione 25 mililitros de PBS frio ao tubo contendo 25 mililitros de células mononucleares e misture bem. Centrífuga a 400 g e a 4 graus Celsius por 10 minutos. Aspire cuidadosamente o supernasce e resuspense a pelota de célula em 50 mililitros de PBS frio.
Depois disso, remova 20 microliters da suspensão celular para contagem. Use um contador automático de células para contar o número de células manchadas com laranja acridina ou iodeto de propídio e calcular o número total de células mononucleares. Em seguida, centrifugar as células a 400 g e a quatro graus Celsius por 15 minutos.
Primeiro, misture 300 microliters de tampão de separação com 100 microliters de IgG humano FCR humano e 100 microliters de contas magnéticas CD34 para isolar as células CD34 positivas de 10 milhões de células mononucleares. Em seguida, remova cuidadosamente o supernacido de um tubo de células mononucleares previamente centrifadas. Resuspend a pelota na solução de contas magnéticas usando 500 microliters por 10 milhões de células.
Misture suavemente e incubar a quatro graus Celsius por 30 minutos. Durante a incubação, prepare o dispositivo separador de células substituindo a solução de armazenamento pelo buffer de trabalho e executando um programa de lavagem seguido de um programa de lavagem. Em seguida, adicione o separador de células frias que corre tampão ao tubo que contém a mistura celular até que o tubo esteja completamente preenchido.
Centrifugar o tubo a 400 g e a 4 graus Celsius por 15 minutos. Aspire o supernasciente e resuspenda a pelota celular em tampão separador frio usando dois mililitros por 10 milhões de células. Transfira a mistura de suspensão celular de dois mililitros em tubos de 15 mililitros.
Carregue três conjuntos dos tubos no rack separador de células, que foi pré-refrigerado a quatro graus Celsius. Um conjunto de tubos contém MMCs, o segundo conjunto de tubos será usado para coletar a fração negativa, e um terceiro conjunto de tubos será usado para coletar células CD34 positivas purificadas. Carregue o rack no dispositivo separador de células e execute o programa predefinido.
Depois disso, centrifufique os tubos contendo a fração positiva a 400 g a e quatro graus Celsius por 15 minutos. Aspire o supernasce e resuspenda as células purificadas CD34-positivos em um mililitro de mídia livre de soro. Em seguida, use um contador de células automatizado para contar as células manchadas com laranja acrídina ou iodeto de propídio.
Primeiro, prepare um volume suficiente de mídia para emplacar as células CD34 positivas purificadas a uma densidade de 33.000 células por mililitro. Aplaque as células CD34 positivas purificadas em uma placa de 12 poços a uma densidade celular de 50.000 células em 1,5 mililitros de mídia por poço. Incubar a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada de dióxido de carbono de 5% por 16 horas.
Adicione ácido valpróico às culturas de tal forma que a concentração final seja de um mililitro. Continue aculturar as células nas mesmas condições por mais sete dias. Neste protocolo ex vivo, aumenta-se o número de células-tronco hematopoiéticas primitivas geradas a partir de células CD34 positivas isoladas do sangue do cordão umbilical.
O número total de células nucleadas é significativamente maior em culturas tratadas apenas com o coquetel de citocinas. Apesar do maior número de células nucleadas totais, o número de células-tronco hematopoiéticas nas culturas que recebem o coquetel de citocinas permanece baixo durante todo o período de expansão, em comparação com culturas tratadas com coquetel de citocina e ácido valpróico. O maior número de células-tronco hematopoiéticas é gerado em culturas tratadas com uma combinação do coquetel de citocinas e ácido valpróico.
Em particular, a maior expansão é alcançada após cinco a sete dias após o tratamento com ácido valpróico. Esse aumento do número de células-tronco hematopoiéticas se correlaciona com um aumento imediato no percentual de células-tronco hematopoiéticas, o que é notável dentro de 24 horas após o tratamento com ácido valpróico. Embora o aumento do percentual seja mantido durante os primeiros quatro dias de cultura ex vivo, ele diminui progressivamente após cinco a sete dias de tratamento.
No entanto, essa diminuição está inversamente correlacionada com um aumento no número absoluto de células-tronco hematopoiéticas. O rápido aumento no percentual de células-tronco hematopoiéticas em culturas tratadas com ácido valpróico deve-se à aquisição do fenótipo CD90. As células CD34 positivas que expressam o marcador fenotípico CD90 atingem quase 40 a 50% das células expandidas em culturas ex vivo tratadas com o coquetel de citocina e ácido valpróico por quatro dias.
A aquisição do fenótipo CD90 é então confirmada pela expansão ex vivo das células CD34-positivas altamente purificadas que carecem de expressão do marcador CD90. Dentro de 24 horas após o tratamento com ácido valpróico, quase 75% das células ex vivo expandidas expressam CD90. Este fenótipo é altamente retido durante os primeiros quatro dias nessas culturas.
O sangue do cordão diluído deve ser dispensado muito lentamente em cima do gradiente de densidade enquanto segura o tubo em um ângulo de 45 graus para criar duas camadas distintas. Após este procedimento de expansão ex vivo, as células expandidas podem ser injetadas nos camundongos NSG imunes mieloblados para testar sua funcionalidade e potencial de enenxerção. As células expandidas podem ser usadas para testar uma variedade de perguntas sobre a biologia do HSC humano e do rato e o papel de diferentes genes ou jogador crítico na integridade funcional dos HSCs.
A funcionalidade do Ex vivo expandido HSC da unidade sanguínea do cordão umbilical humano, utilizando essa técnica, será testada em breve em um ensaio clínico em paciente com malignidades hematológicas que necessitam de transplante alergênico de medula óssea. Essa técnica também nos permitiu investigar o mecanismo subjacente à expansão ex vivo com o tratamento VPA e obter insights sobre a biologia dos HSCs primitivos.
