Este protocolo mede os níveis de ubiquização de proteínas subcelulares e a atividade proteasome no cérebro dos roedores, permitindo que, entre os sujeitos, comparações de como a atividade ubiquitina-proteasome muda em resposta à atividade celular, aprendizagem ou doença. O protocolo permite a coleta de frações sinápticas, citoplasmáticas e nucleares do mesmo cérebro de roedores. Minimizando a perda, poderia ser realizada com pequenas quantidades de tecido e equipamentos básicos de laboratório.
Demonstrando o procedimento será Taylor McFadden, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório. Inicie este procedimento com coleta e dissecção do tecido cerebral de roedores conforme descrito no protocolo de texto. Certifique-se de que o hemisfério utilizado seja contra-equilibrado em todas as condições de extração para cada grupo experimental.
Remova o microtubo centrífugas de 1,5 mililitro contendo um hemisfério da região de interesse do congelador de menos 80 graus Celsius. Usando um bisturi, transfira o tecido cerebral congelado para um homogeneizador de teflon de vidro de dois mililitros. Adicione 500 microliters de tampão de lise ao tubo de Teflon.
Utilizando pilão B, homogeneize o mesmo tecido com 15 derrames até que não haja quantidade visível de material sólido. Use um movimento de giro durante cada golpe. Com uma pipeta de 1.000 microliter, transfira a amostra homogeneizada para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
Coloque o tubo no gelo molhado e incubar por 30 minutos. Coloque o tubo no microcentrifuuge e gire por 10 minutos a 845 vezes g em quatro graus Celsius. Após a conclusão, remova cuidadosamente o supernatante por pipetação e coloque em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
Esta é a fração citoplasmática. Adicione 50 microliters de tampão de extração à pelota resultante e resuspend por pipetação. Não vórtice a pelota.
Coloque o tubo contendo a pelota resuspended no gelo e incubar por 30 minutos. Em seguida, centrifugar o tubo por 20 minutos a 21.456 vezes g em quatro graus Celsius. Após a centrifugação, remova cuidadosamente o supernatante por pipetação e coloque em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
Esta é a fração nuclear. Homogeneize um hemisfério da região de interesse como antes, exceto para usar 500 microliters de tampão TEVP em vez de tampão de lise. Usando uma pipeta de 1.000 microliter, transfira a amostra homogeneizada para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
Centrifugar a amostra a 1.000 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Colete o supernascer e transfira-o para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro usando uma pipeta de 1.000 microliter. Centrifugar a amostra a 10.000 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius.
Descarte a pelota original que contém núcleos e os grandes detritos. Transfira o supernatante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Esta é a fração citosórica.
Adicione 50 microliters de tampão de homogeneização à pelota e resuspend por pipetação até que nenhum material sólido seja visível. Centrifugar a amostra a 20.000 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Transfira o supernatante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
Esta é a fração de membrana sinaptosômica bruta. Para configurar o ensaio, pré-aquecimento o leitor de placas a 37 graus Celsius e segurar durante a corrida. Defina a excitação para 360 nanômetros e emissão para 460 nanômetros.
Se a placa 96 bem utilizada estiver clara, ajuste a posição óptica para baixo. Se uma placa escura de 96 poços for usada, ajuste a posição óptica para cima. Programe uma corrida cinética com um tempo de duas horas de varredura a cada 30 minutos.
Reconstitua o tampão de ensaio 20S 10X fornecido no kit com 13,5 mililitros de água ultrapura. Adicione 14 microliters de 100 mililitros ATP ao agora 1X buffer. Isso melhora significativamente a atividade proteasome nas amostras e melhora a confiabilidade do ensaio.
Reconstitua o padrão AMC fornecido no kit com 100 microliters de DMSO. Execute etapas usando o padrão AMC no escuro ou sob condições de baixa luz, pois o padrão é sensível à luz. Crie uma curva padrão de AMC a partir de uma série de concentrações altas a baixas de AMC.
Esta curva será utilizada para calibração do leitor de placas e análise da atividade proteasome nas amostras homogeneizadas. Reconstitua o subtrato proteasome fornecido no kit com 65 microliters de DMSO. Também realize esta etapa no escuro ou sob condições de baixa luz, pois o substrato é sensível à luz.
Em seguida, crie uma diluição de 1 a 20 do substrato proteasome em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro usando tampão de ensaio 20S. Adicione uma quantidade normalizada das amostras desejadas a uma placa de 96 poços. Execute cada amostra em duplicata.
A quantidade de amostra necessária varia de acordo com a preparação do tecido. Geralmente, 10 a 20 microgramas são suficientes para qualquer fração subcelular. Leve o volume do poço da amostra para 80 microliters com água ultrapura.
A quantidade adicionada depende do volume da amostra adicionada. Em dois poços separados, adicione 80 microliters de água sozinho. Estes serão os ensaios em branco.
Adicione 10 microliters de tampão de ensaio 20S a cada poço, incluindo os espaços em branco de ensaio. Use uma pipeta repetidor ou automatizada para garantir um volume de ensaio consistente nos poços. Desligue as luzes ou entre em uma sala escura.
Adicione todos os 100 microliters de padrões AMC diluídos a um novo poço usando um único poço para cada padrão. No escuro, use uma pipeta repetidor ou automatizada para adicionar 10 microliters de substrato proteasome diluído a poços contendo amostras e ensaios em branco, mas não o padrão AMC. Coloque a placa no leitor de placas e inicie a corrida cinética.
Realize a quantificação de diversas etiquetas de poliubiquitina em diferentes frações subcelulares coletadas do tecido cerebral de roedores usando uma variedade de protocolos de manchas ocidentais padrão em combinação com anticorpos de poliudicequitina específicos de ligação única. Algumas imagens de manchas ocidentais fornecerão colunas de bandas distintas, enquanto outras produzem padrão semelhante a manchas com poucas ou nenhuma linha clara. Para quantificação de manchas ocidentais de ubiquitina imagem, desenhe uma caixa ao redor da coluna que estende toda a escada de padrões moleculares.
Ajuste a caixa se a coloração da ubiquitina se estender por toda a escada. Isso é comum para modificações de lysina 48 e varia amplamente entre compartimentos subcelulares. Finalmente, subtraia o fundo que é calculado como a densidade óptica média do fundo imediatamente em torno da coluna em todos os lados.
Aqui mostrada a quantificação da atividade proteasome em diferentes frações coletadas da amígdala lateral do mesmo animal. Durante o ensaio de atividade proteasome in vitro, unidades fluorescentes relativas detectadas aumentaram do início ao fim do ensaio na fração sináptica, na fração citoplasmática e na fração nuclear. O inibidor proteasome beta-lac impediu que as RFUs mudassem ao longo da sessão.
Diferenças subcelulares foram observadas na atividade proteasome na amígdala lateral do mesmo animal. Foi detectado um aumento da atividade proteasome nuclear em animais treinados em relação aos controles que corresponderam a uma diminuição da atividade dentro da fração sináptica. A atividade proteasome citoplasmática permaneceu na linha de base.
Aqui são mostradas diferenças subcelulares na ubiquitina proteica específica da ligação na amígdala lateral do mesmo animal após o aprendizado. Houve um aumento da ubiquitina geral na fração nuclear após o aprendizado que se correlacionava com uma diminuição da fração citoplasmática. Após o aprendizado, a ubiquitina linear aumentou na fração nuclear, mas não frações citoplasmáticas ou sinápticas.
Curiosamente, a ubiquização K63 aumentou na fração nuclear após o aprendizado que se correlacionava com uma diminuição da fração sináptica. Considerando que a uniquitina K48 aumentou nas frações nucleares e citoplasmáticas após o aprendizado, mas não na fração sináptica. Este protocolo também pode ser usado para entender a distribuição subcelular e função de outras proteínas dentro do mesmo animal.
