Este método baseia-se em protocolos de alcance qualificados para fabricantes de ratos estabelecidos para automatizar o treinamento e os testes, fornecendo um meio eficiente de adquirir grandes conjuntos de dados relativamente rapidamente. Ele minimiza o esforço do experimentador, permitindo a reconstrução tridimensional da cinemática de membros dianteiros. A cinemática pode ser usada para avaliar os efeitos de intervenções precisamente cronometradas ou correlacionadas com gravações fisiológicas.
Com alguns ajustes, essa técnica também pode ser aplicada em camundongos. Comece acendendo as luzes e coloque o rato em uma câmara de alcance habilidosa. Use fórceps para segurar uma pelota através do slot de alcance na frente da caixa.
Deixe o rato comer três pelotas das fórceps. Puxe a pelota de volta da próxima vez que o rato tentar comer a pelota dos fórceps e repetir até que o rato alcance a pelota com uma pata a mais de 11 atinge a preferência da pata indicando. Em seguida, alinhe a haste de entrega de pelotas com o lado da fenda de alcance contralateral à pata preferida do rato.
Coloque uma pelota na haste de entrega. Em seguida, use fórceps para isca o rato com a pelota, mas direcione o rato em direção à vara de entrega para que sua pata bata na pelota na haste. Depois que o rato tentar 10 chegar à vara de entrega sem ser iscado, avance o rato para a próxima fase.
Em seguida, posicione a haste de entrega de pelotas com base na preferência da pata do rato e ajuste-a para a posição dois. Ajuste a posição de altura da haste de entrega da pelota usando o controle remoto do atuador. Uma vez que a haste de entrega esteja na altura correta, segure o número desejado até que a luz pisque em vermelho para definir.
Em seguida, coloque o rato na câmara e isca o rato para trás com uma pelota. Quando o rato se mover o suficiente para a parte de trás da câmara que quebraria o feixe infravermelho se a versão automatizada estivesse funcionando, mova a haste de entrega de pelotas para a posição três. Finalmente, espere o rato pegar a pelota e, em seguida, mova a haste de entrega de pelotas de volta para a posição dois.
Coloque uma nova pelota na haste de entrega se for derrubada. Repita gradualmente esses passos iscando o rato cada vez menos até que o rato comece a um, mova-se para trás para solicitar uma pelota sem ser iscado, e dois, imediatamente mover-se para a frente depois de pedir uma pelota na parte de trás. Depois que o rato tiver feito isso 10 vezes, comece a treinar sobre a tarefa automatizada.
Para configurar o sistema automatizado, acenda as luzes da câmara e reabastete o reservatório de pelotas. Posicione a haste de entrega da pelota de acordo com a preferência da pata do rato. Verifique se as posições do atuador estão definidas corretamente.
Em seguida, ligue o computador e abra o programa de alcance qualificado. Digite o número de identificação do rato no assunto e selecione a preferência da pata no menu suspenso manual. Especifique o caminho de salvamento para os vídeos.
Em seguida, defina a hora da sessão e o número de vídeos máximos. Defina a duração do elevador de pelotas também e habilite a penalidade de alcance antecipado. Em seguida, para tirar imagens de calibração, coloque a mão amiga dentro da câmara de alcance e cutuque o clipe do jacaré através do slot de alcance.
Segure o cubo na frente da fenda de alcance com o clipe do jacaré. Em seguida, posicione o cubo para que o lado vermelho apareça no espelho superior, no lado verde no espelho esquerdo e no lado azul no espelho direito. No programa comportamental, certifique-se de que o limite de ROI seja definido para um valor muito grande.
Clique no botão executar e assim que o botão inicializado da câmera ficar verde, pressione comece a iniciar a aquisição de vídeo. Clique em Modo Cal e, em seguida, tire uma imagem clicando em Take Cal Image. Mova o cubo ligeiramente e tire outra imagem.
Repita novamente para um total de três imagens. Por fim, pare o programa clicando em parar e clique no botão stop sign. Remova a mão amiga e o cubo da caixa.
Tenha cuidado para não bater nada na câmara comportamental depois que as imagens de calibração foram tiradas naquele dia. Primeiro, coloque o rato na câmara de acesso hábil. Clique na seta branca para executar o programa.
Em seguida, ajuste a posição do ROI para detecção da pata ajustando x deslocamento, y offset, largura do ROI e altura do ROI. Posicione o ROI no espelho lateral que mostra o dorso da pata diretamente em frente ao slot de alcance e clique em começar o programa. Enquanto o rato não está alcançando, ajuste o baixo valor do limiar do ROI até que o valor do gatilho do ROI ao vivo esteja oscilando entre zero e um.
Em seguida, defina o limiar de ROI para ser significativamente maior do que o valor do gatilho do ROI ao vivo durante as cutucadas do nariz e menor do que o valor do gatilho do ROI ao vivo quando o rato chegar. Ajuste até que os vídeos sejam constantemente acionados quando o rato chegar, mas não quando ele cutuca o nariz através da ranhura. Monitore os primeiros testes para garantir que tudo esteja funcionando corretamente.
Quando um rato chega antes de solicitar uma pelota, observe o aumento do número de alcances precoces. Quando um rato chega depois de solicitar uma pelota, observe o número de vídeos aumentar enquanto uma cópia do vídeo é salva como um arquivo de lixo. Finalmente, após o tempo de sessão ou o número máximo de vídeos ser alcançado, pressione o botão stop sign.
Os resultados indicam que após 20 dias, os ratos adquirem a tarefa de alcançar qualificados. Aqui, as trajetórias de alcance de uma única sessão são mostradas. Isso representa apenas o avanço inicial da pata para facilitar a apresentação.
Além disso, se o gatilho de detecção da pata não for configurado com precisão, há uma variabilidade significativa no quadro em que a pata rompe o slot de alcance que pode levar à variabilidade quando as intervenções são acionadas durante os movimentos de alcance. Além do manuseio cuidadoso dos animais, nenhuma precaução será tomada neste protocolo. É mais importante definir o limite do ROI corretamente para que vídeos ou outras intervenções sejam acionados nos momentos apropriados.
Este método pode ser emparelhado com várias outras técnicas, como optogenética, imagem de cálcio e modelos genéticos que podem abordar questões que vão desde o controle motor básico até a fisiopatologia da desordem de movimento. Esta técnica permite a correlação de alcance detalhado e compreender cinemática com gravações fisiológicas ou intervenções permitindo que os pesquisadores respondam não apenas se, mas como os movimentos mudam com as mudanças dos circuitos neurais.
