As atuais medidas clínicas de detecção de câncer de ovário são inespecíficas e faltam pontos de detecção de cuidados de células tumorais circulantes. Nosso sistema de fluxo fotoacoustic permite testar amostras de pacientes para marcadores específicos de câncer de ovário na corrente sanguínea. Este procedimento fornece uma tecnologia de plataforma única com melhorias em relação às técnicas atuais em termos de simplicidade, baixo custo, limites promissores de detecção e capacidade de ser aplicado a aplicações amplas.
Através deste trabalho, pretendemos construir a partir do nosso sistema de nanopartículas direcionadas para câncer de ovário para testar amostras de pacientes ex vivo para CTCs. Este sistema PAFC altamente versátil é capaz de expandir para uso clínico, testando a presença de uma ampla gama de biomarcadores no sangue. O alinhamento óptico adequado é fundamental para a detecção de alvos dentro do sistema de citometria de fluxo fotoacâmico.
Além disso, para garantir o acoplamento acústico adequado, certifique-se de que não há bolhas entre o escorregador de vidro e o transdutor. Devido à natureza personalizada do sistema de fluxo e seus componentes, a visualização do método é benéfica para uma reprodução precisa. Em uma capa de fumaça química ventilada, filtrar aproximadamente 300 mililitros de água deionizada através de um filtro estéril de 0,2 micrômetros.
Adicione 0,0134 gramas de cloreto de cobre e 100 mililitros de água deionizada a um frasco fundo redondo limpo de 250 mililitros para criar uma solução de cloreto de cobre mililitro. Adicione 0,015 gramas de ácido fólico ao frasco e use uma barra de mexiça magnética para misturar a solução por aproximadamente cinco minutos. Em seguida, misture 0,024 gramas de nonahidrato de sulfeto de sódio com 100 microliters de água deionizada.
Use uma pipeta de 200 microliter para adicionar lentamente esta solução à mistura de reação durante uma duração de aproximadamente 10 segundos. Tampe a nave de reação. Coloque o navio em um banho de óleo a 90 graus Celsius e continue mexendo.
Após aproximadamente 15 minutos ou quando o banho de óleo atingiu a faixa de temperatura entre 85 e 90 graus Celsius, permita que a reação prossiga por mais uma hora. Quando a reação estiver completa, remova o recipiente de reação do banho de óleo e deixe esfriar à temperatura ambiente por 10 a 15 minutos antes de transferi-lo para um banho de gelo. Uma vez que a reação seja resfriada, ajuste o pH para aproximadamente 10 usando um hidróxido de sódio molar.
Adicione a mistura a uma coluna centrífuga de 30 quilodalton em lotes de 15 mililitros e centrífuga a 3.082 vezes g por 15 minutos para purificar a mistura de reação. Primeiro, misture as nanopartículas de sulfeto de cobre com ácido fólico na concentração adequada em mídia RPMI fresca. Adicione esta solução de nanopartículas a cada poço da placa preparada de 24 poços que contém células SK-OV-3 a uma concentração de 400 microgramas por mililitro.
Incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por duas horas. Depois disso, experimentpsinize as células com 0,5 mililitros de 0,25% de trippsina e EDTA. Para neutralizar a trippsina, adicione pelo menos um mililitro de RPMI 1640 sem ácido fólico e centrifuge as células a 123 vezes g por seis minutos.
Para lavar as células, remova o supernaspeico, resuspenja as células em dois mililitros de PBS e centrífuga a 123 vezes g por seis minutos. Repita esta etapa de lavagem duas vezes para remover quaisquer nanopartículas não ligadas. Em seguida, resuspende as células com um a dois mililitros de uma solução de 2%Tween em PBS.
Conte as células usando um hemócito e o Trypan Blue. Diluir as células em uma solução de 2% Tween em PBS para a concentração escolhida para detecção. Use o arquivo STL tridimensional fornecido para imprimir em 3D o tanque de fluxo com plástico termoplástico ABS ou PLA.
Depois de imprimir o tanque, limpe e monte o sistema para uso. Coloque tampas de vidro sobre a ranhura de um milímetro por três milímetros e o buraco de um centímetro no sistema de fluxo e lacre cuidadosamente com silicone para evitar vazamentos. Em seguida, coloque o tubo capilar nos tubos curados de silicone.
Insira os tubos na câmara de fluxo através do lado do tanque de fluxo de tal forma que o tubo capilar de vidro esteja diretamente acima e na frente da ranhura de três milímetros e do buraco de um centímetro. Sele a tubulação com silicone. Em seguida, conecte o transdutor a um pulsar e receptor de ultrassom.
Amplie o sinal com um ganho de 59 decibéis. Conecte a saída do filtro a um osciloscópio reconfigurável multiuso equipado com uma matriz de portão programável de campo embutido. Conecte um dos tubos provenientes da câmara de fluxo a uma junção T que está conectada a duas bombas de seringa em cada ramo.
Encha uma das bombas de seringa com ar e a outra bomba com a amostra a ser analisada. Coloque a bomba contendo ar a uma taxa de fluxo de 40 microliters por minuto e coloque a bomba contendo a amostra para uma taxa de fluxo de 20 microliters por minuto. Em seguida, conecte o tubo restante que sai do sistema de fluxo a um recipiente de 10% de alvejante para descartar células depois que elas saírem do sistema de fluxo.
Coloque a seção do tubo capilar de quartzo em alinhamento direto com o transdutor na visão de campo do microscópio para permitir a colocação cuidadosa da fibra óptica acima da amostra de tal forma que ilumine toda a largura do tubo. Irradie a amostra usando uma fibra óptica canalizando um laser de estado sólido bombeado por diodo operando a um comprimento de onda de 1.053 nanômetros. Use uma câmera montada no microscópio para registrar o fluxo, o disparo do laser e a passagem de amostras através do sistema de fluxo.
Neste estudo, a citometria de fluxo fotoacústico e o agente alvo de sulfeto de cobre alvo são usados para detectar células tumorais de circulação ovariana. Uma imagem típica de TEM das nanopartículas sintetizadas mostra que o tamanho médio de uma nanopartícula típica é de aproximadamente 8,6 nanômetros. Os diâmetros horizontais e verticais de cada partícula são então medidos perpendiculares entre si e mais mediados.
O diâmetro hidrodinâmico médio dessas partículas é de 73,6 nanômetros. As nanopartículas de sulfeto de cobre têm uma curva de absorção característica que se estende até o infravermelho próximo. Há um pequeno artefato em torno de 850 nanômetros que é causado pela troca de lasers pelo espectrômetro.
Imagens de microscopia de fluorescência de células incubadas com nanopartículas fluorescentes marcadas mostram que a absorção de nanopartículas pode ser visualizada pela presença de fluorescência em toda a célula. Células não incubadas com nanopartículas não mostram sinal fluorescente. A presença deste sinal fluorescente indica a absorção bem sucedida das partículas e sua capacidade de serem detectadas no sistema de fluxo.
Exemplos de sinais típicos de aquisição de dados são mostrados aqui. Os dados brutos indicam as diferenças de sinal entre as células marcadas por nanopartículas, PBS e nanopartículas de sulfeto de cobre com ácido fólico. Utilizando a visão de laboratório personalizada e o software MATLAB, as reconstruções de imagem são feitas dos controles positivos e negativos em tempo real e pós-aquisição, respectivamente.
Os envelopers individuais são posteriormente convertidos em valores de pixel e exibidos como colunas independentes. Diferenças claras no sinal fotoacústico ocorrem entre PBS e as nanopartículas de sulfeto de cobre com ácido fólico a uma concentração de 100 microgramas por mililitro. Durante este procedimento, é fundamental alinhar adequadamente o transdutor de ultrassom, microscópio e fibra óptica dentro do sistema de citometria de fluxo fotoacústico.
Confirme o alinhamento do sistema testando controles positivos e negativos. Devido à versatilidade das técnicas de segmentação fotoacoustica e à ampla gama de aplicações possíveis utilizando PAFC, essa técnica abre caminho para aplicações clínicas e de pesquisa de importância transtracional. Para garantir a aplicação clínica, novos estudos devem focar no teste de amostras de pacientes e na redução das etapas processuais.
A síntese das nanopartículas deve ocorrer em um capô de fumaça química utilizando o equipamento de proteção adequado. As linhas de células humanas devem ser tratadas de acordo com as diretrizes da sua instituição. O uso do laser requer treinamento de segurança de radiação e EPI apropriado.
O uso de laser e os testes fotoacâmicos só devem ser realizados por pessoal altamente treinado.
