This work was supported by the Tau Consortium (M.I.D); National Institutes of Health Grant 1R01NS071835 (M.I.D.), a Department of Defense Grant PT110816 (to M.I.D.), 1F32NS087805 (to J.L.F.), and 1F31NS079039 (to B.B.H.).

NOTA: Este protocolo enfatiza a utilização de citometria de fluxo de FRET para detectar a actividade de sementeira a partir de amostras biológicas do rato. Também é compatível com fibrilas recombinantes e amostras biológicas humanas. Rato eutanásia e do cérebro da colheita foi realizada em conformidade com os procedimentos IACUC-aprovado. 1. Cérebro Extração <ol><li> Após anestesia com isoflurano profunda (2%), perfundir um rato com PBS gelado contendo 0,03% de heparina, e extrair o cérebro seguindo os detalhes descritos nos Gage et al. 18 </li><li> Colocar o tecido extraído num crio-frasco, e encaixe congelamento por colocação em azoto líquido. Alternativamente, congelar tecido em gelo seco. Uma vez congelado, se necessário transferir tecido para -80 ° C e armazenar durante um longo período de tempo,. NOTA: Este protocolo é compatível com homogeneizados de cérebro inteiro ou regiões microdissecadas cerebrais. Veja Hagihara et al. Para um protocolo micro-dissecção detalhada 19. </li></ol&gt; 2. Preparação de material de semente Biológica <ol><li> Preparar tampão de homogeneização por dissolução de inibidores de protease (EDTA livre) em 1x TBS (1 comprimido por 10 mL). Vortex vigorosamente, e armazenar no gelo. Os inibidores de protease deve ser EDTA livre, a fim de preservar a viabilidade das células de biossensor. </li><li> Pesar tecido cerebral congelado em um barco pesa descartável, e transferir para um tubo cônico de 5 ml. Adicionar tampão de homogeneização arrefecido em gelo de tal forma que a solução final é de 10% peso / volume. Temporariamente armazenar no gelo. A massa de tecido e o volume de tampão de homogeneização subsequente irá variar dependendo do tamanho do cérebro e / ou regiões utilizado. Aqui, um rato adulto hemibrain pesando 0,2 g é suspenso em 2 ml de uma solução a 10% w / v. </li><li> Amostras de transferência em uma sala fria, e ajustar um sonicador de sonda para as configurações apropriadas. Para sonicação com sonda com um ruptor Omni (mostrado aqui), ajustar a potência para 20%, o que corresponde a cerca de 75 W. O uso de um modo de pulso para assegurar as amostras não forem ovER-aquecida durante a sonicação. Defina o pulsador a 30%, o que corresponde a cerca de 500 ms. </li><li> Limpar a ponta da sonda de ultra-sons, por lavagem com água, isopropanol, e novamente com água, retirando a sonda entre em cada solução. Certifique-se de lavar e limpar ambos os lados e fundo da sonda com LAB-toalhetes. </li><li> Trabalhando com uma amostra de cada vez, submergir a ponta da sonda em tampão de homogeneização, e iniciar o sonicador. Usando as configurações de energia e pulser descritos acima, entregar 25 pulsos totais. Assegurar que o tecido está completamente em suspensão. Ter cuidado para evitar a formação de espuma da amostra, durante este passo. NOTA: As amostras são suscetíveis à formação de espuma, se a) o volume total é baixo ou b) o homogeneizado aquece. Com este instrumento específico, não sonicate com volumes inferiores a 250 mL. Para assegurar amostras ficar refrigeradas, os tubos podem ser armazenados em gelo durante este passo. </li><li> Limpe a sonda por enxugando ligado residual, em seguida, entregar 10 pulsos para uma proveta oágua limpa f. Lavar os lados e o fundo da sonda com água, isopropanol, e água de novo (como no passo 2.4), limpando secar entre cada passo. Para evitar a contaminação, lavar abundantemente a sonda entre amostras. NOTA: Com agregados tau, não encontramos que os métodos de limpeza mais rigorosos são necessários para prevenir a contaminação da amostra-para-amostra. Outros amilóides, no entanto, pode exigir cuidados adicionais que tem sido extensivamente descritos na literatura 20,21. </li><li> Loja homogeneizados em gelo até que todas as amostras tiverem sido processados. </li><li> Girar a 21.300 homogenatos xg durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Transferir o sobrenadante para um tubo limpo, tomando cuidado para não perturbar o sedimento. Descarte o sedimento. Alíquota o sobrenadante, e armazenar a -80 ° lisados ​​C para posterior utilização. Evitar ciclos de congelamento / descongelamento dos homogeneizados, no entanto, dado que isso reduz a eficiência da semeadura. </li></ol> 3. repique Biosensor Cells NOTA:Use quatro linhas de células para este ensaio: HEK 293T (célula linha # 1), RD-P301S-PCP (célula linha # 2), RD-P301S-YFP (célula linha # 3) e RD-P301S-CFP / YFP ( linha celular # 4). Por favor, refira Tabela 1 para a contribuição de cada linha celular para o ensaio. <ol><li> Em um ambiente estéril, meio de cultura aspirado. Lavar as células com PBS quente, e aspirado. Tripsinizar as células (3 ml de tripsina-EDTA (0,05%)) durante 3 min, diluiu-se com meio de cultura quente (9 ml de DMEM, 10% FBS, 1% de pen / strep, 1% de GlutaMax), e transferir imediatamente as células para um tubo cónico. </li><li> Centrifugar a 1.000 células xg durante 5 min à temperatura ambiente. Aspirar médio e ressuspender pellet celular em meio de cultura quente. </li><li> Usando um hemocitómetro, determinar a densidade celular para cada linha celular. A densidade celular irá variar dependendo da confluência no momento da colheita e o volume de ressuspensão. Ressuspender as células colhidas a partir de uma placa de 10 cm a 90% de confluência em 10 ml de meio, para a densidade celular de aproximadamente 1 milhão de células / ml. </li><li> Façouma mistura principal de células + meios de modo a que cada poço de uma placa de 96 poços conterá 35.000 células em 130 ul de meios de comunicação (por exemplo, para fazer uma mistura principal para 100 poços, ressuspender 3,5 milhões de células em 13 ml de meio). Modifique o número de células para caber projetos experimentais individuais e cronogramas. Para o tratamento de células ~ 18 horas após o plaqueamento, adicionar 35.000 células em cada poço de uma placa de 96 poços. </li><li> Usando uma pipeta de multi-canal, lentamente pipetar 130 ul de suspensão de células de mistura principal para cada poço de um fundo plano, de cultura de tecidos tratados com placa de 96 poços. Enquanto o plaqueamento, colocar a ponta da pipeta no centro do poço, não tocar no fundo da placa. NOTA: Embora o plaqueamento formato pode ser alterado, é recomendado fazer n = 4 para cada um dos poços de linhas de células de 1-3 por placa. O restante da placa (n = 84) é reservado para a linha celular # 4 (células de biossensor). </li><li> Permitir que as células se contentar deixando a placa em repouso durante 10 min à temperatura ambiente. Incubar O / N a 37 ° C, 5% de CO 2, e &amp;# 8805; 80% de umidade relativa. </li></ol> 4. O tratamento de células NOTA: O dia seguinte, quando as células de biossensor de tau são 60-65% confluentes, preparar complexos de transdução de semente da seguinte forma: <ol><li> Num tubo, combinar o reagente de transfecção, tais como Lipofectamina, com meio de soro reduzido, como Opti-MEM para preparar uma mistura principal. Por bem, adicione 1,25 reagente de transfecção ul e 8,75 mL de mídia de soro reduzido. Flick tubo suavemente para misturar, brevemente girar para baixo, e incubar durante 5 min à TA. </li><li> Em um outro tubo, combinar material de semente (alíquota de lisado do passo 2.9) com meios de soro reduzido. NOTA: O volume do material de semente irá variar de acordo com a experiência individual. Ao escolher o volume de sementes, levar em consideração: abundância de sementes em uma amostra e toxicidade potencial. Homogenatos brutos pode ser tóxico para as células. Como tal, usar a menor quantidade possível de monitorar o efeito desejado. Anteriormente testados volumes de lisado / poço gama FRom pi 1-5, correspondendo a 5-20 ug de proteína total. Certifique-se que o volume total por poço (sementes + media de soro reduzido) é 10 jul. </li><li> Juntar o conteúdo dos dois tubos descritos em 4.1 e 4.2, súbito suavemente para misturar, brevemente girar para baixo (1.000 x g, 5 segundos), e incuba-se à temperatura ambiente durante pelo menos 20 minutos e até 2 horas. </li><li> Pipeta suavemente 20 ul de complexo de transdução no lado de poços individuais de biossensor. Use três repetições técnicos, se possível. Células tratadas e volta para a incubadora durante 24-48 hr. Incubar sob as mesmas condições tal como descrito no passo 3.6. NOTA: A condição de controle negativo apropriado para esta configuração é células de biossensor tratados com lipossomas vazios (ou seja, reagente lipossoma + media de soro reduzido) porque a aplicação de fosfolipídios introduz uma ligeira mudança no perfil de fluorescência em relação ao biossensor células não expostas ao reagente lipossoma. </li></ol> 5. As células de colheita para FRET Citometria de Fluxo <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; NOTA: Antes de colher células-geral 24-48 horas pós-tratamento é possível obter uma leitura preliminar de atividade semeadura usando o filtro GFP em um padrão invertido microscópio de fluorescência. As células tratadas sem material de semente (ou seja, lipossomas vazios) irá mostrar fluorescência difusa, enquanto que as células tratadas com material de semente irá mostrar pontuada intensa e inclusões intracelulares reticular (Figura 1A - B). <ol><li> Usando uma pipeta multi-canal, aspirar todo o meio celular (150 mL). Trypsinize (50 ul) as células durante 5 min, e diluiu-se com 150 ul de meio de cultura gelado. Não inclua uma lavagem com PBS antes da tripsinização neste passo, uma vez que pode provocar elevação de células e perda de células subsequente. Excluir todas as células mortas e detritos contaminantes durante a citometria de fluxo através de estratégias de propagação. </li><li> Imediatamente após têmpera, as células de transferência para uma placa de fundo bem rodada 96, e centrifugar a 1000 xg durante 5 min TA. </li><li> Aspirar e descartar meio, tomando cuidado para não perturbar o pellet celular. </li><li> Suavemente, mas completamente, ressuspender o sedimento celular em 50 ul de 2% de paraformaldeído, e incubar durante 10 min. Alternativamente, as células são executados ao vivo, embora a fixação fornece resultados mais limpas e mais consistentes. </li><li> Centrifugar a 1.000 células xg durante 5 min à temperatura ambiente. Aspirar e descartar paraformaldeído, tomando cuidado para não perturbar o pellet celular. </li><li> Suavemente, mas completamente, ressuspender o sedimento celular em 200 ul de tampão de citometria de fluxo gelada (HBSS, 1% de FBS, 1 mM de EDTA) e rodar a placa, o mais rapidamente possível para evitar a aglutinação de células. </li></ol> 6. FRET Citometria de Fluxo NOTA: Usar um citómetro de fluxo tal como o MACSQuant VYB, que está equipado com FRET compatível com linhas de laser e os conjuntos de filtros (Tabela 2). Para cada passo dentro desta seção, clique no bem de interesse usando o modelo de 96 poços do software e clique em&quot;Jogar&quot; para começar a captação de amostra e fluxo. Faça parcelas ou tabelas de estatísticas, clicando no ícone &#39;janela nova análise&#39;. Alterar parâmetros do eixo em lotes individuais bivariadas clicando no título em X ou eixo Y e selecionando o filtro apropriado. Para deslocar as populações de células ou de sinais de fluorescência, aumentar ou diminuir as tensões associadas com os filtros apropriados. Com este instrumento, execute &lt;1.000 eventos / seg para assegurar o acompanhamento de uma única célula precisa. <ol><li> Faça um Scatter-Side Area (SSC-A) vs Forward Scatter-Área (FSC-A) gráfico de duas variáveis, e com a linha celular # 1 em execução, ajustar as tensões e FSC SSC até que a população celular está no quadrante inferior esquerdo. Clique na ferramenta polígono, e definir a população de células (Portão P1). Para todos os parâmetros de propagação veja a Figura 2. </li><li> Faça uma FSC-H (altura) vs enredo FSC-A bivariada, e aplicar Portão P1 para este lote, clicando em &quot;ao vivo&quot; acima da trama, e selecionando P1. Com a linha celular # 1execução, clique na ferramenta polígono, e definir células individuais (Portão P2). </li><li> Faça 3 histograma, uma para cada um dos filtros de interesse: PCP, YFP, e FRET. Aplicar Portão P2 a todas estas parcelas, clicando em &quot;ao vivo&quot; acima das parcelas, e selecionando P2. Com a linha celular # 1 em funcionamento, ajustar tensões de tal modo que a população de células intermédias na PCP, YFP, FRET e histogramas são todos entre 0 e 1. Para medir PCP e de FRET, excitar células com o laser de 405 nm, e com uma captura de fluorescência 450/50 nm e 525/50 nm, filtro, respectivamente. Para medir YFP, excitam células com um laser de 488 nm e captura de fluorescência com um filtro 525/50 nm. As configurações de filtro de laser e são descritos mais adiante na Tabela 2. </li><li> Execute a compensação para PCP spillover para os canais FRET e YFP. NOTA: Compensação é o processo de correção de escape de fluorescência. O escape de fluorescência ocorre quando a emissão de fluorescência de um fluorocromo é detectada dentro de um filtro designed para medir sinal de outro fluorocromo. Com compensação apropriada, o transbordamento de fluorescência PCP pode ser removido a partir dos canais de FRET e YFP. NOTA: Compensação requer a presença de ambas as células -positivas e negativos de fluorescência. Assim, para compensar em células CFP-positiva (linha celular # 2), células negativas (linha celular # 1) devem ser adicionados à amostra antes da passagem. <ol><li> Pico de 30 ul de linha celular # 1 de suspensão de um único poço em 200 ul de linha celular # 2 suspensão imediatamente antes da compensação. </li><li> Clique no ícone &quot;Configurações do instrumento&quot;, depois no separador &quot;compensação&quot;, e verificar &quot;matriz&quot; para abrir a tabela de compensação. </li><li> Adicione uma FRET-A contra-PCP Um gráfico de duas variáveis, e aplicar porta P2, tal como descrito na etapa 6.3. Com linhas celulares 1 + 2 em execução, clique no ícone &quot;quadrante&quot; e desenhar quadrantes tal que os fluorescência -negativas e -positivas populações são separados pelos dois quadrantes inferiores (Portões LL3 umND LR3, respectivamente). </li><li> Criar uma tabela de estatísticas que mostra a intensidade mediana de fluorescência (MFI) de FRET para o LL3 e portões LR3. Ajustar o parâmetro de FRET na matriz de compensação até a MFI do sinal de FRET é equivalente entre LL3 e LR3. Após este passo, o MFI do sinal de FRET é igual entre as células não coradas e células PCP-positivas, sugerindo a ausência de PCP extravasamento para o canal de FRET. </li><li> Adicione uma YFP-A contra-PCP Um gráfico de duas variáveis, e aplicar porta P2, tal como descrito na etapa 6.3. Desenhe quadrantes (LL4 e LR4) semelhante ao que fez no passo 6.4.3. </li><li> Criar uma tabela de estatísticas que mostra o MFI de YFP para LL4 e LR4. Ajustar o parâmetro YFP na matriz de compensação até a MFI do sinal YFP é equivalente entre LL4 e LR4. Após este passo, o MFI de um sinal YFP é igual entre as células não coradas e células PCP-positivas, sugerindo a ausência de PCP extravasamento para o canal de YFP. </li></ol></li><li> Folldevido configuração do portão e compensação, realce poços de interesse e executar o restante do prato. </li><li> Depois de todas as amostras foram executados, arquivos de dados de exportação clicando em &#39;arquivo&#39;, então &#39;copiar&#39;. Selecione a guia &#39;arquivos de dados&#39;, realce a pasta experimento, e clique em &#39;copiar&#39;. </li></ol> Análise 7. Dados NOTA: Alterar parâmetros do eixo em lotes individuais bivariadas clicando no título em X ou eixo Y e selecionando o filtro apropriado. <ol><li> FCS arquivos abertos na citometria de fluxo programa de análise. </li><li> Com base nas propriedades de dispersão, utilizar uma porta poligonal para definir a população de células (vs SSC FSC) e população singuleto (FSC-H vs FSC-A) a partir de células tratadas com lipossomas vazios, de forma semelhante à que se descreveu na Secção 6. </li><li> Se foi realizada a compensação CFP durante a instalação, não se ajustam mais PCP. </li><li> Criar um traste vs YFP bivariada enredo. Usando linha celular # 3, Definir uma porta de FRET falsa pelo desenho de um portão poligonal que corre ao longo do declive da população de células positiva FRET. Este portão exclui YFP células individuais-positiva que emitem um sinal de FRET dentro do filtro, e é desenhado semelhante ao mostrado anteriormente, proibindo et al. 22 </li><li> Definir um portão FRET traçando células CFP / YFP tratados com lipossomas vazios em um FRET vs PCP bivariada enredo. Introduzir um portão poligonal ao longo da inclinação da população que se estende para cima e para a esquerda para longe da população. Esta porta deve excluir a maioria das células (~ 99%), de tal modo que o fundo FRET é ≥1% das células. Todos os eventos que mudam a este portão são considerados FRET-positivo. NOTA: cada uma das portas anteriormente descrito é aplicado a todas as amostras antes de construir portas posteriores. Após a análise, quatro portas individuais são definidos (população celular; singleto; falsa FRET; FRET). </li><li> Parâmetros de análise da ficha de interesse, incluindo: por cento FRET positividade e MFIcélulas de FRET-positiva. Calcular manualmente a densidade FRET integrado medindo o produto de por cento de positividade e MFI. NOTA: Se a densidade de FRET integrado é usado como uma medida do resultado, definido FRET fundo (tal como definido no passo 7.5) e a maior IMF do que ou igual a 1, a fim de evitar o cálculo de um produto que é menos do que os seus dois factores individuais. </li></ol>

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	<li>Seeley, W. W., Crawford, R. K., Zhou, J., Miller, B. L., Greicius, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+diseases+target+large-scale+human+brain+networks.">Neurodegenerative diseases target large-scale human brain networks.</a> Neuron. 62 (1), 42-52 (2009).</li><li>Zhou, J., Gennatas, E. D., Efstathios, D., Kramer, J. H., Miller, B. L., Seeley, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+Regional+Neurodegeneration+from+the+Healthy+Brain+Functional+Connectome.">Predicting Regional Neurodegeneration from the Healthy Brain Functional Connectome.</a> Neuron. 73 (6), 1216-1227 (2012).</li><li>Raj, A., Kuceyeski, A., Weiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Network+Diffusion+Model+of+Disease+Progression+in+Dementia.">A Network Diffusion Model of Disease Progression in Dementia.</a> Neuron. 73 (6), 1204-1215 (2012).</li><li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathological+stageing+of+Alzheimer-related+changes.">Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes.</a> Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).</li><li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+of+Alzheimer's+disease-related+neurofibrillary+changes.">Staging of Alzheimer's disease-related neurofibrillary changes.</a> Neurobiol Aging. 16 (3), 271-278 (1995).</li><li>Frost, B., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-like+mechanisms+in+neurodegenerative+diseases.">Prion-like mechanisms in neurodegenerative diseases.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (3), 155-159 (2009).</li><li>Holmes, B. B., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+protein+aggregate+propagation.">Cellular mechanisms of protein aggregate propagation.</a> Current Opinion in Neurology. 25 (6), 721-726 (2012).</li><li>Kaufman, S. K., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-like+propagation+of+protein+aggregation+and+related+therapeutic+strategies.">Prion-like propagation of protein aggregation and related therapeutic strategies.</a> Neurotherapeutics. 10 (3), 371-382 (2013).</li><li>Holmes, B. B., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-like+properties+of+Tau+protein:+the+importance+of+extracellular+Tau+as+a+therapeutic+target.">Prion-like properties of Tau protein: the importance of extracellular Tau as a therapeutic target.</a> J Biol Chem. 289 (29), 19855-19861 (2014).</li><li>Guo, J. L., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+transmission+of+pathogenic+proteins+in+neurodegenerative+diseases.">Cell-to-cell transmission of pathogenic proteins in neurodegenerative diseases.</a> Nat Med. 20 (2), 130-138 (2014).</li><li>Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+tau+misfolding+from+the+outside+to+the+inside+of+a+cell.">Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell.</a> J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).</li><li>Guo, J. L., Lee, V. M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeding+of+normal+tau+by+pathological+tau+conformers+drives+pathogenesis+of+Alzheimer-like+tangles.">Seeding of normal tau by pathological tau conformers drives pathogenesis of Alzheimer-like tangles.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2011).</li><li>Holmes, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+proteoglycans+mediate+internalization+and+propagation+of+specific+proteopathic+seeds.">Heparan sulfate proteoglycans mediate internalization and propagation of specific proteopathic seeds.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), E3138-E3147 (2013).</li><li>de Calignon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+Tau+Pathology+in+a+Model+of+Early+Alzheimer's+Disease.">Propagation of Tau Pathology in a Model of Early Alzheimer's Disease.</a> Neuron. 73 (4), 685-697 (2012).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-Synaptic+Spread+of+Tau+Pathology+In+Vivo.">Trans-Synaptic Spread of Tau Pathology In Vivo.</a> PLoS One. 7 (2), e31302 (2012).</li><li>Holmes, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteopathic+tau+seeding+predicts+tauopathy+in+vivo.">Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), E4376-E4385 .</li><li>Yoshiyama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+loss+and+microglial+activation+precede+tangles+in+a+P301S+tauopathy+mouse+model.">Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model.</a> Neuron. 53 (3), 337-351 (2007).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. 65 (65), (2012).</li><li>Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+hippocampal+dentate+gyrus+from+adult+mouse.">Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse.</a> J Vis Exp. (33), (2009).</li><li>Yan, Z. X., Stitz, L., Heeg, P., Pfaff, E., Roth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectivity+of+prion+protein+bound+to+stainless+steel+wires:+a+model+for+testing+decontamination+procedures+for+transmissible+spongiform+encephalopathies.">Infectivity of prion protein bound to stainless steel wires: a model for testing decontamination procedures for transmissible spongiform encephalopathies.</a> Infect Control Hosp Epidemiol. 25 (4), 280-283 (2004).</li><li>McDonnell, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleaning,+disinfection+and+sterilization+of+surface+prion+contamination.">Cleaning, disinfection and sterilization of surface prion contamination.</a> J Hosp Infect. 85 (4), 268-273 (2013).</li><li>Banning, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometry-based+FRET+assay+to+identify+and+analyse+protein-protein+interactions+in+living+cells.">A flow cytometry-based FRET assay to identify and analyse protein-protein interactions in living cells.</a> PLoS One. 5 (2), e9344 (2010).</li><li>Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Features+of+Tau+Fibrils+from+Alzheimer's+Disease+Brain+Are+Faithfully+Propagated+by+Unmodified+Recombinant+Protein.">Conformational Features of Tau Fibrils from Alzheimer's Disease Brain Are Faithfully Propagated by Unmodified Recombinant Protein.</a> Biochemistry. , (2013).</li><li>Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+aggregation+assays+using+hyperphosphorylated+tau+protein.">In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein.</a> J Vis Exp. (95), e51537 (2015).</li></ol>

This assay has been licensed to Janssen Pharmaceuticals.

A citometria de fluxo sistema FRET aqui descrito é uma ferramenta poderosa para a rápida e quantitativamente avaliar a atividade tau semeadura. Ela exige apenas a experiência de cultura celular moderada e um conhecimento prático de FRET e citometria de fluxo. Outros ensaios de semeadura, como Tioflavina T - que exibe fluorescência aumentada quando obrigado a estrutura de folha beta - são trabalhosos e requerem um substrato de proteína pura, recombinante. Além disso, os ensaios in vitro de semeadura para...

A acumulação intracelular de tau amilóides define tauopatias, tais como a doença de Alzheimer. Nas fases iniciais da doença, patologia está geralmente localizada em regiões discretas do cérebro, mas com a progressão da doença, patologia invariavelmente se espalha ao longo de redes neuronais distintas 1-5. Evidências sugerem propagação transcelular de agregados de proteínas tóxicas subjacente a esta patologia (revisto em 10/06). Neste modelo, sementes proteopathic (por exemplo, tau) são libertados a partir de células do doador e entrar nas células vizinhas, transformando proteína tau nativo na forma mal dobrada através modelada alteração conformacional 11-15. O ensaio aqui descrito foi desenvolvido para detectar com sensibilidade tal actividade semeadura. É compatível com a proteína recombinante e amostras biológicas e permite a quantificação dos níveis de actividade de semeadura proteopathic 16 minutos. Células HEK 293T que expressam estavelmente tau d repetiçãoOMain (RD) contendo a mutação P301S associado à doença, quer fundido a PCP ou YFP (daqui em diante referido como células tau-RD-PCP / YFP) servir como um biossensor estável de actividade semeadura. Na ausência de sementes proteopathic, as células manter tau como um monómero solúvel em água, e não têm fundo apreciável de FRET. Absorção espontânea ou transdução mediada por lipossomas de sementes de tau para células, no entanto, resulta em RD-PCP e agregação RD-YFP, que produz um sinal de FRET, que é medida no interior das células individuais através de citometria de fluxo. Numerosos componentes deste ensaio foram modificadas para aumentar a sensibilidade e reduzir a variabilidade. Uma linha celular monoclonal com uma proporção de 1: expressão RD-PCP / YFP 1 foi seleccionado, uma vez que proporciona melhor sinal: ruído. Para aumentar a sensibilidade, fosfolípidos são usados ​​para introduzir sementes directamente em células (embora para estudar os mecanismos biológicos de captação, esta pode ser omitida). Finalmente, citometria de fluxo monitores FRET ao nível da população e uma única célula<html> nível, ao contrário de outros ensaios de agregação de proteínas. A medida do resultado final, a densidade de FRET integrado, é altamente quantitativa e contabilidade, tanto para o número de células com a agregação, e do grau de agregação que ocorreu dentro de cada célula. Todos estes parâmetros optimizados aumentar a sensibilidade e garantir a reprodutibilidade. Este sistema foi recentemente empregado em um estudo abrangente em camundongos transgênicos tauopathy P301S 17 que avaliou o aparecimento temporal e progressão da atividade sementeira tau em relação a outros marcadores patológicos de tau utilizada (por exemplo, MC1, AT8, PG5 e ThioflavinS). Sementeira actividade é, de longe, o marcador mais antigo e mais robusta de patologia tau avaliada, precedendo a detecção histológica por pelo menos 6 semanas. Atividade Sementeira aparece em 1.5 meses e aumenta progressivamente com a idade, sugerindo um papel causal de sementes proteopathic no início e / ou progressão da neurodegeneração 16. e_content &quot;&gt; quantificação precisa dos níveis de material de semente de amostras biológicas hora pode facilitar estudos que monitoram a progressão da doença mais cedo. Ao encurtar a duração julgamento e permitindo o uso de animais mais jovens, isto poderia aumentar a eficiência ea precisão de testes em animais pré-clínicos. Por exemplo, em a P301S rato previamente descrito, os compostos de chumbo pode ser entregue tão cedo quanto 4-6 semanas (imediatamente antes, ou no início da actividade sementeira), e monitorizados quanto à eficácia de 2-4 semanas mais tarde. O ensaio deve quantificar com precisão quaisquer reduções de semeadura actividade. FRET citometria de fluxo tem aplicações in vitro de rastreio bem. Por exemplo, reagentes anti-tau (por exemplo, anticorpos, moléculas pequenas, etc.) pode ser rapidamente testado para a sua capacidade para bloquear a indução sementeira directamente em cultura, utilizando quer a tau recombinante agregados ou lisados ​​derivado do cérebro como uma fonte de sementes (Figura 5). Com esta configuração, quando o material de semente é preparada, um experiment leva apenas três dias para ser concluída, incluindo a análise de dados. A rápida quantificação da actividade de semeadura proteopathic pode, assim, facilitar muitos estudos de neurodegeneração.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5912</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-free)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693159001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-vials</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.694.006</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>XSE 105DU</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing Boats</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-735-743</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1475-0501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni Sonic Ruptor Ultrasonic Homogenizer</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>18-000-115</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Tip for Ultrasonic Homogenizer</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>OR-T-156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A451</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noise Cancelling Ear Muffs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-145-412</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S47299</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td><a href="http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-sterile.aspx">1615-5510</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424 000.215</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-136</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-084</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tubes</td>
			<td>Phenix Research</td>
			<td>SS-PH15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL reagent resevoirs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>41428-954</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi channel pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>TI13-690-049</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottom plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3603</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31985-070</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well round bottom plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3788</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 15710</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ED2SS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14185-052</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 40 Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004509</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIOLiner Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75003796</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15170-172</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQuant VYB Flow Cytomter</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-116</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chill 96 Rack</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-094-459</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Jo analysis software</td>
			<td>Flow Jo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 uL pipet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GPS-L10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL pipet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GPS-250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL pipet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GPS-1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL pipet tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-1800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipett</td>
			<td>Phenix Research</td>
			<td>SPG-606180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipett</td>
			<td>Phenix Research</td>
			<td>SPG-607180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological pipett</td>
			<td>Phenix Research</td>
			<td>SPG-760180</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sensitive detection of proteopathic seeding activity with fret flow cytometry

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and progression of pathology in several neurodegenerative diseases, including Alzheimer's disease and the related tauopathies. The potentially critical role of tau seeds in disease progression strongly supports the need for a sensitive assay that readily detects seeding activity in biological samples. 
By combining the specificity of fluorescence resonance energy transfer (FRET), the sensitivity of flow cytometry, and the stability of a monoclonal cell line, an ultra-sensitive seeding assay has been engineered and is compatible with seed detection from recombinant or biological samples, including human and mouse brain homogenates. The assay employs monoclonal HEK 293T cells that stably express the aggregation-prone repeat domain (RD) of tau harboring the disease-associated P301S mutation fused to either CFP or YFP, which produce a FRET signal upon protein aggregation. The uptake of proteopathic tau seeds (but not other proteins) into the biosensor cells stimulates aggregation of RD-CFP and RD-YFP, and flow cytometry sensitively and quantitatively monitors this aggregation-induced FRET. The assay detects femtomolar concentrations (monomer equivalent) of recombinant tau seeds, has a dynamic range spanning three orders of magnitude, and is compatible with brain homogenates from tauopathy transgenic mice and human tauopathy subjects. With slight modifications, the assay can also detect seeding activity of other proteopathic seeds, such as &#945;-synuclein, and is also compatible with primary neuronal cultures. The ease, sensitivity, and broad applicability of FRET flow cytometry makes it useful to study a wide range of protein aggregation disorders.

FRET citometria de fluxo permite sensível, quantitativa e rápida detecção de atividade semeadura a partir de amostras recombinantes ou biológicas. Ensaio de configuração é fácil: As linhas celulares estáveis ​​que expressam monoclonais derivados de tau-RD-PCP / YFP são transduzidas com material de semente, incubou-se durante 24-48 h, e submeteu-se a análise de citometria de fluxo (Figura 1A). Na ausência de sementes, as células de biossensor manter tau numa forma solúvel, monomérica ...

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Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.

Detecção sensível de Proteopathic Sementeira Atividade com FRET Citometria de Fluxo

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

sensitive-detection-proteopathic-seeding-activity-with-fret-flow

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.8K visualizações.  University of Texas Southwestern Medical Center. Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.

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Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

Analisando internalização celular de nanopartículas e bactérias multi-espectral por Citometria de Fluxo Imagem

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Bioengenharia

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Avaliação de Entrega Gene Polimérico Nanopartículas por Análise Nanoparticle Rastreamento e alta capacidade de Citometria de Fluxo

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general relatively bulky and costly, making them less effective in the resource limited settings. To potentially address these limitations, we have recently demonstrated the integration of wide-field fluorescent microscopy and imaging flow cytometry tools on cell-phones using compact, light-weight, and cost-effective opto-fluidic attachments. In our flow cytometry design, fluorescently labeled cells are flushed through a microfluidic channel that is positioned above the existing cell-phone camera unit. Battery powered light-emitting diodes (LEDs) are butt-coupled to the side of this microfluidic chip, which effectively acts as a multi-mode slab waveguide, where the excitation light is guided to uniformly excite the fluorescent targets. The cell-phone camera records a time lapse movie of the fluorescent cells flowing through the microfluidic channel, where the digital frames of this movie are processed to count the number of the labeled cells within the target solution of interest. Using a similar opto-fluidic design, we can also image these fluorescently labeled cells in static mode by e.g. sandwiching the fluorescent particles between two glass slides and capturing their fluorescent images using the cell-phone camera, which can achieve a spatial resolution of e.g. ~ 10 &mu;m over a very large field-of-view of ~ 81 mm2. This cell-phone based fluorescent imaging flow cytometry and microscopy platform might be useful especially in resource limited settings, for e.g. counting of CD4+ T cells toward monitoring of HIV+ patients or for detection of water-borne parasites in drinking water.

We review our recent results on the integration of fluorescent microscopy and imaging flow cytometry tools on a cell-phone using compact and cost-effective opto-fluidic attachments. These cell-phone based micro-analysis devices might be useful for cytometric analysis, such as performing various cell counting tasks as well as for high-throughput screening of e.g., water samples in resource limited settings.

Largo-campo microscopia de fluorescência e citometria de fluxo fluorescente de imagens em um telefone celular

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich cell structures and de facto there is still no quantitative method to assess their distribution at cell and tissue levels. What we propose here is an innovative method allowing the detection and quantification of CNTs in cells using a multispectral imaging flow cytometer (ImageStream, Amnis). This newly developed device integrates both a high-throughput of cells and high resolution imaging, providing thus images for each cell directly in flow and therefore statistically relevant image analysis. Each cell image is acquired on bright-field (BF), dark-field (DF), and fluorescent channels, giving access respectively to the level and the distribution of light absorption, light scattered and fluorescence for each cell. The analysis consists then in a pixel-by-pixel comparison of each image, of the 7,000-10,000 cells acquired for each condition of the experiment. Localization and quantification of CNTs is made possible thanks to some particular intrinsic properties of CNTs: strong light absorbance and scattering; indeed CNTs appear as strongly absorbed dark spots on BF and bright spots on DF with a precise colocalization.
This methodology could have a considerable impact on studies about interactions between nanomaterials and cells given that this protocol is applicable for a large range of nanomaterials, insofar as they are capable of absorbing (and/or scattering) strongly enough the light.

In this study, the main purpose was to monitor the cellular uptake and eventual exocytosis of carbon nanotubes (CNTs). From this perspective, we proposed here a unique method using multispectral imaging flow cytometry allowing a quantification and localization of CNTs in a statistically relevant number of cells.

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Flying Insect Detection and Classification with Inexpensive Sensors

An inexpensive, noninvasive system that could accurately classify flying insects would have important implications for entomological research, and allow for the development of many useful applications in vector and pest control for both medical and agricultural entomology. Given this, the last sixty years have seen many research efforts devoted to this task. To date, however, none of this research has had a lasting impact. In this work, we show that pseudo-acoustic optical sensors can produce superior data; that additional features, both intrinsic and extrinsic to the insect&#8217;s flight behavior, can be exploited to improve insect classification; that a Bayesian classification approach allows to efficiently learn classification models that are very robust to over-fitting, and a general classification framework allows to easily incorporate arbitrary number of features. We demonstrate the findings with large-scale experiments that dwarf all previous works combined, as measured by the number of insects and the number of species considered.

We proposed a system that uses inexpensive, noninvasive pseudo-acoustic optical sensors to automatically and accurately detect, count, and classify flying insects based on their flying sound.

Vôo Detecção e Classificação Insect com sensores baratos

An inexpensive, noninvasive system that could accurately classify flying insects would have important implications for entomological research, and allow ...

Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. This step is necessary for the generation of small molecular weight peptides, generally with MW &#60; 3,000-4,000 Da, that fall within the effective scan range of mass spectrometry instrumentation. Conventional protocols involve O/N enzymatic digestion at 37 &#186;C. Recent advances have led to the development of a variety of strategies, typically involving the use of a microreactor with immobilized enzymes or of a range of complementary physical processes that reduce the time necessary for proteolytic digestion to a few minutes (e.g., microwave or high-pressure). In this work, we describe a simple and cost-effective approach that can be implemented in any laboratory for achieving fast enzymatic digestion of a protein. The protein (or protein mixture) is adsorbed on C18-bonded reversed-phase high performance liquid chromatography (HPLC) silica particles preloaded in a capillary column, and trypsin in aqueous buffer is infused over the particles for a short period of time. To enable on-line MS detection, the tryptic peptides are eluted with a solvent system with increased organic content directly in the MS ion source. This approach avoids the use of high-priced immobilized enzyme particles and does not necessitate any aid for completing the process. Protein digestion and complete sample analysis can be accomplished in less than ~3 min and ~30 min, respectively.

A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.

Enzimática processamento rápido de proteínas para a detecção MS com um micro-reator de fluxo-through

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

Isolamento de células de gânglio retiniano murino primário (RGCs) por citometria de fluxo

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

Um método automatizado para realizar o ensaio de micronúcleos in vitro usando citometria de fluxo de imagem multiespectral

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies for the detection of CTCs include flow cytometry, microfluidic devices, and real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). Despite recent advances, methods for the detection of early ovarian cancer metastasis still lack the sensitivity and specificity required for clinical translation. Here, a novel method is presented for the detection of ovarian circulating tumor cells by photoacoustic flow cytometry (PAFC) utilizing a custom three dimensional (3D) printed system, including a flow chamber and syringe pump. This method utilizes folic acid-capped copper sulfide nanoparticles (FA-CuS NPs) to target SKOV-3 ovarian cancer cells by PAFC. This work demonstrates the affinity of these contrast agents for ovarian cancer cells. The results show NP characterization, PAFC detection, and NP uptake by fluorescence microscopy, thus demonstrating the potential of this novel system to detect ovarian CTCs at physiologically relevant concentrations.

A protocol is presented to detect circulating ovarian tumor cells utilizing a custom-made photoacoustic flow system and targeted folic acid-capped copper sulfide nanoparticles.

Detecção de câncer de ovário usando citometria de fluxo fotoacústico

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. Considering an implant as a foreign body, a hostile and dysregulated immune response may result in the rejection of the implant, while a regulated response and regaining of homeostasis can lead to its acceptance. Analyzing the microenvironments of implants dissected out under in vivo or ex vivo&#160;settings can help in understanding the pattern of immune response, which can ultimately help in developing new generations of biomaterials. Flow cytometry is a well-known technique for characterizing immune cells and their subsets based on their cell surface markers. This review describes a protocol based on manual dicing, enzymatic digestion, and filtration through a cell strainer for the isolation of uniform cell suspensions from dissected implant tissue. Further, a multicolor flow cytometry staining protocol has been explained, along with steps for initial cytometer settings to characterize and quantify these isolated cells by flow cytometry.

Isolation of cells from dissected implants and their characterization by flow cytometry can significantly contribute to understanding the pattern of immune response against implants. This paper describes a precise method for the isolation of cells from dissected implants and their staining for flow cytometric analysis.