O sequenciamento mRNA de célula única é amplamente utilizado para entender os processos biológicos em um único nível celular. O advento das estratégias de multiplexação ampliou ainda mais suas amplificações, permitindo o perfil de várias amostras em um único experimento, reduzindo drasticamente o custo e evitando os efeitos em lote. Demonstrando o procedimento estarão Wei Feng, um pós-doutor, e Andrew Przysinda, um técnico do meu laboratório.
Após a contagem, divida as células isoladas do dia embrionário 18,5 câmaras cardíacas em cinco vezes 10 para as quintas alíquotas e lave as células duas vezes com PBS fresco por lavagem. Resuspenja as pelotas em 180 microliters de PBS por amostra e adicione 20 microliters de solução de estoque de código de barras âncora a cada tubo com mistura suave. Após uma incubação de cinco minutos no gelo, adicione 20 microliters de solução de estoque de código de barras co-âncora a cada tubo com mistura suave para uma incubação adicional de cinco minutos no gelo antes de lavar as células três vezes com um milímetro de PBS frio suplementado com 1% de albumina de soro bovino por lavagem, em seguida, filtrar as amostras em novos tubos através de um filtro de célula de 40 micrômetros por tubo.
Após a contagem, monte o chip B em um suporte de chip, depois adicione 75 microlitadores de uma solução de 50% glicerol aos poços nãousados na linha um, 40 microliters aos poços nãousados na linha dois, e 280 microliters aos poços nãousados na linha três. Note que um chip de treinamento é usado aqui para demonstrar o procedimento. Adicione o volume apropriado de suspensão celular e água sem nuclease à mistura mestre com tubulação suave.
Adicione 75 microliters da solução celular resultante ao centro inferior da amostra bem na linha um sem bolhas. Vórtice as contas de gel por 30 segundos antes de adicionar lentamente 40 microliters de contas ao centro inferior da conta de gel bem na linha dois sem bolhas. Adicione 280 microliters de óleo particionário na parede lateral do poço de óleo particionário na linha três.
Coloque a junta no chip sem pressionar a junta e manter a junta horizontal para evitar molhar a junta. Carregue o chip montado com a junta no controlador de cromo e execute o programa de célula única de cromo B. Note que a tela mostra treinamento de cromo para o chip de treinamento, mas para os experimentos reais a tela exibirá cromo de célula única B.Quando o programa tiver concluído, remova imediatamente o chip e descarte a junta.
Dobre a tampa para trás para expor os poços em um ângulo de 45 graus e verifique os níveis líquidos para ter certeza de que não há tamancos presentes. A aspire lentamente 100 microliters de contas de gel em emulsão dos pontos mais baixos do poço de recuperação e verifique a uniformidade das contas. Distribua as contas emulsificadas pela parede de um novo tubo PCR no gelo e coloque o tubo em um cicloviário térmico para transcrição reversa.
Para preparar o cDNA para amplificação, adicione 125 microliters de agente de recuperação à amostra à temperatura ambiente. Nenhum líquido opaco deve ser observado e evitar a pipetação ou vórtice. Aguarde 60 segundos antes de remover lentamente o agente de recuperação da parte inferior do tubo e adicione 200 microliters de mistura de limpeza de contas de vórtice à amostra.
Pipete a mistura 10 vezes antes de incubar por 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, coloque as amostras em um ímã na posição alta. Quando a solução for limpa, remova o supernascer e adicione 200 microliters de 80% de etanol à pelota.
Após 30 segundos, retire o etanol e repita a lavagem mais duas vezes. Após a última lavagem, centrifufique brevemente a amostra e coloque o tubo sobre o ímã na posição baixa para permitir que a amostra seque por menos de dois minutos. Quando a amostra secar, remova o tubo do ímã e adicione 35,5 microliters de solução de elução recém-preparada.
Após uma incubação de dois minutos à temperatura ambiente, coloque a amostra no ímã na posição alta até que a solução se limpe antes de transferir 35 microliters da amostra para uma nova tira de tubo. Para amplificação cDNA usando a estratégia de codificação de barras baseada em lipídio, adicione a mistura de reação de amplificação às amostras de cDNA de 35 microliter com mistura completa antes de centrifugar brevemente. No final do giro, incubar a amostra no cicloviário térmico seguindo o procedimento de amplificação cDNA apropriado.
Adicione 120 microliters de reagente seleto e 100 microliters de água ultrauso a 100 microliters de amostra e pipeta o reagente selecionado de 0,6x resultante 15 vezes. Após uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente, coloque a amostra no ímã até que a solução fique clara. Transfira o supernatante para um tubo de ligação baixa de 1,5 mililitro para a construção da biblioteca cDNA com código de barras multiplexing.
Lembre-se de salvar tanto os supernantes quanto a base, pois o conteúdo do supernante monta cDNA com código de barras e o cDNA endógeno de conteúdo base. Limpe o cDNA endógeno com 80% de etanol e elute o DNA com 40 microliters de tampão de elução, em seguida, execute uma verificação de controle de qualidade do cDNA endógeno antes de preparar uma biblioteca de transcrição endógena. A concentração de CDNA deve ser quantificada e qualificada antes da construção da biblioteca.
As bibliotecas construídas, incluindo as bibliotecas endógenas cDNA e código de barras, também devem ser quantificadas e qualificadas antes do sequenciamento. Após o sequenciamento, a expressão do código de barras pode ser analisada em cada célula. Por exemplo, nesta análise foram observados oito grupos de células únicas que expressaram exclusivamente um tipo de código de barras representando células de oito amostras diferentes.
Além disso, algumas células não expressaram nenhum código de barras e, portanto, foram definidas como células negativas, enquanto outras células expressavam dois códigos de barras diferentes representando doublets. Utilizando as células singlet, a heterogeneidade celular e as regulações moleculares poderiam ser avaliadas por anotação do tipo celular, identificação de tipo de célula nova e rara, análise comparativa da zona anatômica e análise da via ontologia genética, como separações de fases do ciclo celular. É útil imaginar as contas de gel em emulsão se você puder, como uma imagem lhe dirá se o procedimento foi ou não bem sucedido até este ponto.
O multiplexing de amostra adiciona grande flexibilidade na concepção de seus experimentos. Depois de assistir a esta demonstração, espero que esteja mais confiante em começar suas próprias experiências.
