Então, usando este protocolo, podemos visualizar citonemes em tecido de rato fixo em todo o embrião com microscopia de luz padrão. Usando esta técnica, podemos sondar proteínas de sinalização endógenas que viajam ao longo de citonês, em vez de confiar em modelos de camundongos geneticamente manipulados que usam proteínas fluorescentes marcadas. Ao tentar este protocolo, é importante manusear suavemente seções de tecido para a preservação ideal de citonemas.
Demonstrando este procedimento estarão Miriam Dillard, uma pesquisadora principal do meu grupo, e Christina Daly, uma estudante de pós-graduação de St.Jude. Para começar, use a tesoura dissecando e fórceps para fazer uma incisão Y na cavidade peritoneal. Excise o útero contendo embrião E 9,5.
Dissecar os embriões em meio completo de crescimento do DMEM. Use fórceps para remover a gema SAC, placenta e membranas circundantes. Enxágüe os embriões isolados no HBSS para remover qualquer tecido amniótico residual e sangue.
Em seguida, prepare o fixador adicionando paraformaldeído ao HBSS para uma concentração de trabalho de 4% de paraformaldeído. Adicione um mililitro desta solução a cada poço de uma placa de 24 poços. Coloque os embriões em poços individuais.
Incubar os embriões por 45 minutos com agitação suave em um roqueiro. Após a incubação, remova o fixador e lave os embriões três vezes, por 30 minutos em PBS com adição de cálcio, magnésio e triton de 0,1%. Em seguida, incubar os embriões na solução de bloqueio com agitação suave duas vezes, por uma hora cada.
Após a segunda incubação, enxágue os embriões usando uma solução de bloqueio fresco. Enquanto isso, prepare a solução primária de anticorpos diluindo os anticorpos em PBS suplementado. Depois que a lavagem estiver completa, remova a solução de bloqueio e adicione um mililitro da solução de anticorpos primários a cada poço.
Incubar a placa a quatro graus Celsius com rotação suave por três dias. Após a incubação primária de anticorpos, lave os embriões com PBS suplementado cinco vezes por uma hora em um roqueiro a 20 RPM. Em seguida, adicione um mililitro de solução de anticorpos secundários a cada poço.
Incubar a placa com balanço suave a quatro graus Celsius no escuro por três dias. Remova a solução de anticorpos secundários e lave os embriões três vezes por 30 minutos em PBS suplementado. Prepare uma solução de 4% em peso de baixo ponto de fusão agarose em PBS com cálcio e magnésio.
Simultaneamente, coloque uma placa de 12 poços no banho de contas Celsius de 55 graus e adicione três mililitros de agarose a cada poço. Em seguida, coloque a placa em uma parte superior do banco e transfira os embriões para poços individuais usando uma colher perfurada. Use pontas de pipeta para incorporar suavemente e orientar o embrião de tal forma que ele esteja centrado dentro da solução.
Uma vez orientados os embriões, coloque a placa a menos 20 graus Celsius por 10 minutos para solidificação. Em seguida, usando um bisturi, remova todo o bloco de agarose do poço. Corte um bloco retangular ao redor do embrião, deixando aproximadamente 0,3 centímetros do bloco de cada lado.
Deixe um comprimento extra do bloco ao longo da extremidade caudal do embrião. Para montar o embrião no vibratome, primeiro aplique uma tira de fita no suporte da amostra. Oriente o embrião em uma posição vertical na parte superior do bloco e super cole o bloco de agarose à fita, de tal forma que a lâmina irá gerar seções axiais em uma sequência anterior a posterior.
Em seguida, encha a câmara de vibratome com HBSS frio para imergir totalmente a amostra e, em seguida, cercar a câmara com gelo. Defina os parâmetros no vibratome e realize a secção axial serial do embrião. Use fórceps para transferir seções individuais para um prato separado cheio de HBSS.
Lembre-se de usar fórceps para segurar apenas a ágarose para evitar danos teciduais e destruição de citonês. Para realizar a coloração F-actin, remova o HBSS e incuba as seções por 40 minutos com a solução ActinRed e DAPI em PBS suplementado. Após a incubação, lave as seções três vezes por 20 minutos em PBS suplementado.
Com uma caneta marcadora hidrofóbica, desenhe uma barreira ao redor das bordas de um slide de microscópio carregado e adicione um pequeno volume de HBSS à área de enchimento. Em seguida, use fórceps para transferir seções para o slide. Remova o excesso de agarose usando fórceps.
Uma vez que todas as seções tenham sido transferidas para o slide, remova o excesso de líquido por pipetação e usando o canto de uma toalha absorvente. Em seguida, adicione várias gotas de meio de montagem ao slide. Monte o deslizamento da tampa colocando-o suavemente no slide.
Para análise, realize imagens das seções teciduais para um mínimo de três embriões por genótipo em um microscópio confocal ou de alta resolução. Seções corretamente orientadas preparadas usando este protocolo são mostradas aqui. Em comparação com a seção vibratome, a secção criostat do tecido não preservou extensões celulares.
Alguns fragmentos de membrana GFP positivo foram detectados entre células do notochord e tubo neural, e entre células de tubo neural adjacentes em seções criostatas. No entanto, a coloração f-actin de extensões celulares nas células mesenquimais ao redor do tubo neural foi prejudicada em seções de criostat. A secção vibratome garantiu o mínimo de interrupção de seções de embriões inteiros e tecidos individuais.
Seções bem manuseadas permitiram a detecção de ctyonemes entre células epiteliais de placa de piso localizadas adjacentes e células mesenquimais. Seções dobradas ou dobradas eram evidentes por uma grande separação entre o notochord e a placa do chão ventral do tubo neural. E uma perda de extensões de membrana celular migrando entre células epiteliais.
As seções manchadas de F-actin e DAPI tinham um espaçamento consistente de células mesenquimais e ctyonemes ao redor do tubo neural e notochord. Pequenas distorções nas seções podem ter causado a fragmentação de extensões baseadas em actina e grandes lacunas para se formar entre as células, ressaltando a necessidade de um manuseio delicado. Após a secção do embrião, é imperativo minimizar qualquer dobra ou dobra de seções de tecido.
para evitar a quebra de citonemes. Usando essa técnica, podemos visualizar diretamente como moléculas de sinalização, como morfogens, se espalham pelos tecidos. Isso está nos dando novas ideias sobre como tecidos e órgãos são padronizados.
