O método clássico no qual as proteínas de membrana são extraídas para seu estudo é por solubilização simples no detergente. Embora isso forneça um método simples e universal, os detergentes têm sido mostrados para alterar a estrutura nativa, função e atividade dessas proteínas sensíveis. Aqui apresentamos o Peptidisc como uma solução para estabilizar proteínas de membrana em solução livre de detergente.
O sistema Peptidisc se adapta espontaneamente ao tamanho, forma e tipologia de uma miríade de proteínas de membrana. Isso contrasta com outras míméticas de membrana que muitas vezes requerem otimização tediosa. FhuA, uma proteína de membrana externa E.coli, será usada como um modelo de proteína alvo para ser reconstituída neste protocolo.
As vesículas da membrana externa serão isoladas seguidas da adição de detergente para solubilizar as proteínas da membrana. O peptídeo Peptidisc é adicionado à solubilização e o detergente é diluído, formando espontaneamente partículas peptidisc. Estas partículas solúveis estabilizadas são agora favoráveis para inúmeras aplicações a jusante.
Este protocolo examinará a interferometria de camada biológica como uma aplicação da tecnologia Peptidisc. Este protocolo se concentrará no método de reconstituição de PeptiQuick, uma técnica útil que facilita a purificação simultânea e a reconstituição das proteínas da membrana. O método PeptiQuick de reconstituição on-beads é realizado em uma coluna de gravidade padrão Nickel-NTA IMAC pré-equilibrada em detergente.
A membrana solubilizada é carregada na resina e proteínas não-alvo são lavadas. Depois que este peptídeo é adicionado à coluna e o detergente é diluído rapidamente. O lado hidrofóbico do peptídeo Peptidisc associa-se às regiões hidrofóbicas expostas.
O lado hidrofílico do peptídeo mantém a proteína solúvel em solução. O excesso de peptídeo é lavado. Imidazol é adicionado ao elute a fúria reconstituída.
O andaime Peptidisc pode ser funcionalizado para rotular indiretamente proteínas de memória e, assim, abrir a porta para um conjunto mais amplo de análises a jusante. Aqui exploramos o peptídeo biotinilado para fixação a sensores revestidos de streptavidin para análise bli. A interferometria de camadas biológicas é uma poderosa técnica livre de rótulos para investigar interações biomoleculares na solução.
Além de simplesmente demonstrar interações, essa técnica faz uma leitura cinética em tempo real e permite o cálculo de uma constante de dissociação vinculante. Através deste protocolo, eliminamos a necessidade de detergente durante a análise bli, pois isso pode alterar a atividade. A interferometria biocamada analisa a interferência que passa da luz branca refletida do sensor, ou ponta, e moléculas macro amarradas durante uma interação.
Para medir as interações, a dica de sentido é passada entre as soluções e o sinal registrado em cada etapa. Cada ponta então dá seu próprio traço em um sensograma. Primeiro, uma linha de base de buffer só é estabelecida.
Segundo, o ligante está ligado. Neste caso, FhuA e Peptidiscs biotinilados liga uma ponta encoated streptavidin. Em seguida, a ponta é lavada em tampão para remover qualquer FhuA não vinculado.
Agora a ponta é movida para uma solução com uma concentração conhecida de analito, aqui ColM. Se ocorrer uma interação, isso dará uma curva de ligação. Finalmente, a ponta é movida para tampão e a dissociação medida.
As taxas observadas de associação e dissociação em cada concentração de coluna podem ser utilizadas para calcular a constante de dissociação. Hexahistidina marcada FhuA é expressa na cepa E-coli AW740 por 18 horas na mídia de amina. As bactérias são colhidas por centrifugação a 5.000 G's 10 minutos a quatro graus Celsius.
A pelota de célula resultante é reinsucionada no buffer TSG e, em seguida, dounced para quebrar aglomerados celulares e garantir a lise completa. TMSF é adicionado às células re-suspensas a uma concentração final de um milimiliar pouco antes da lise. A lise celular é obtida por três passagens através de um microfluidizador a 15.000 PSI ou uma prensa francesa a 8.000 PSI.
As células lysed são coletadas e uma centrifugação de baixa velocidade a 5.000 G's por 10 minutos a quatro graus é realizada. Um supernacido do giro de velocidade lenta é carregado em um rotor de ultracentragem TI70 e centrifuuado a 200.000 G's por 40 minutos a quatro graus para pelotar a membrana bruta E.coli. Após a ultracentrifugação, o supernascimento é descartado e a pelota de membrana bruta é reinserida em uma quantidade mínima de tampão TSG.
Uma membrana bruta é doucida para garantir sua homogeneidade. Um Ensaio bradford é realizado para verificar a concentração proteica da membrana bruta re-suspensa. O buffer TSG é usado para diluir a membrana bruta para aproximadamente três miligramas por mililitro antes da solubilização.
Tritão X-100 é adicionado à membrana bruta re-suspensa em uma concentração final de 1% para solubilizar seletivamente a membrana interna bacteriana. A solubilização é realizada durante uma hora a quatro graus, com balanço suave. A membrana externa não solubilizada é isolada por ultracentrifugação a 200.000 G's por 40 minutos, a quatro graus.
O supernanato resultante contendo a membrana interior solubilizada é descartado. Enquanto a pelota, contendo a membrana externa, é re-suspensa como antes no TSG. LDAO é adicionado a uma concentração final de 1% à membrana externa re-suspensa, e solubilizado por uma hora a quatro graus.
Finalmente, uma ultracentrifugação é realizada, como antes, para pellet material insolúvel. O supernante resultante contém membrana externa solubilizada, incluindo nosso alvo, FhuA marcado por sua marca, agora pronto para purificação simultânea do IMAC e reconstituição de Peptidisc. Uma coluna de gravidade Nickel-NTA IMAC é pré-equilibrada com dois volumes de coluna de buffer de lavagem IMAC.
O imidazol é adicionado em uma concentração final de cinco milimólares à membrana externa solubilizada, diluída a 0,04% LDAO. A membrana externa solubilizada é carregada na resina Nickel-NTA, e o fluxo através coletado. Este fluxo através é recarregado na resina para aumentar a ligação de resina de FhuA.
Após o carregamento, a resina é lavada com 250 mililitros de tampão de lavagem IMAC e os primeiros 50 mililitros coletados. Após a lavagem, o tampão de lavagem é drenado para um pouco acima da altura do leito de resina e a torneira da coluna fechada. Um mililitro de concentrado, 10 miligramas por mililitro, peptídeo peptidisc é adicionado à coluna.
Após a adição de peptídeo concentrado, 50 mililitros de diluição, um miligrama por mililitro, peptídeo peptidisc em TSG é adicionado. A resina é agitada para suspender as contas em TSG, abaixo do CMC de LDAO, formando assim partículas peptidisc. Após a captura de Peptidisc, a resina é permitida a se estabelecer e a solução de um miligrama por peptídeo mililitro é drenada através da resina.
A resina é lavada com 50 mililitros TSG para remover peptídeos peptidisc em excesso. Finalmente, as partículas Peptidisc são diluídas com 50 mililitros de 600 milimidazol em TSG. São adicionadas frações de mililitros e adicionados 10 microlitadores de 0,5 molar EDTA, uma chave de íons de níquel lixiviado.
As frações de partida, fluxo, lavagem e iludidas são carregadas em um gel SDS de 12% e eletroforezadas por 30 minutos a 60 miliamperes. O gel é manchado e visualizado em um scanner de gel. O gel resultante mostra esgotamento de FhuA no fluxo através, e enriquecimento na eluição.
Pequenas faixas contaminantes também são observadas nas frações iludidas. Frações três a sete são selecionadas para a cromatografia de exclusão de tamanho para confirmar a solubilidade de FhuA Peptidisc e esgotar contaminantes. Um concentrador centrífuga cortado de 30 Kilodome é usado para concentrar frações de três a sete.
Um mililitro das frações de elusão IMAC agrupadas é injetado na coluna S200 a uma taxa de fluxo de 0,25 mililitros por minuto no buffer TSG. Uma fração mililitro é coletada e um gel SDS de 12% das frações é executado. As frações relevantes são agrupadas e agora podem ser usadas em aplicações a jusante.
A BLI foi realizada em um ForteBio Octeto RED96. Este instrumento move pinos BLI através de uma placa de 96 poços que é configurada pela primeira vez à mão. Todos os poços estão cheios para um volume final de 200 microliters.
A coluna um é carregada com tampão cinético para permitir que as pontas se equilibrem e formem um sinal de linha de base. A coluna dois está carregada com uma concentração pré-determinada do tampão ligante e cinética. Neste caso, FhuA é o ligante, e é adicionado à concentração de 2,5 microgramas por mililitro.
A ponta na linha E será usada como referência, e é carregada apenas com tampão. A coluna três está carregada com tampão cinético para lavar o excesso de FhuA da ponta. Diluições seriais duplas do analito, neste caso ColM, é carregado de cima para baixo na coluna quatro.
A maior dessas concentrações é utilizada para a linha de referência, para medir a vinculação não específica do analito à ponta. A coluna cinco está carregada com buffer. Aqui, o ColM se dissociará, e a dissociação medida.
Uma vez que a placa esteja preparada, a bandeja de ponta do sensor e a placa preparada são carregadas no instrumento BLI. O software de aquisição de dados BLI é aberto e um novo experimento cinético é iniciado. A guia Definição da placa é usada para inserir o layout da placa de 96 poços no software.
Aqui o fionte FhuA é a entrada como a carga enquanto o ColM analito é a entrada como a amostra. A guia Definição de ensaio é usada para definir o tempo de tempo e a velocidade de rotação da placa para cada etapa do experimento. Aqui incluímos uma etapa de linha de base de 60 segundos, seguida por uma etapa de carregamento de 250 segundos, um segundo passo de linha de base de 300 segundos, uma etapa de associação analito de 450 segundos, e finalmente uma etapa de dissociação de 900 segundos.
Essas etapas são atribuídas individualmente a cada coluna na placa de 96 poços, selecionando a etapa desejada e clicando com o botão direito do mouse no ensaio de ação em cada coluna. A guia de atribuição do sensor é usada para garantir que o instrumento Octet esteja tirando pinos BLI de sua localização correta na bandeja do sensor. A guia Review Experiment fornece uma visão geral final do experimento, antes de executar.
A BLI será agora realizada pelo Octet RED. Isso produzirá um sensograma de dados brutos para análise. A análise é realizada pela primeira abertura do software de análise de biodados do Octet.
A guia Seleção de dados é usada para localizar o experimento e verificar o resumo experimental. As concentrações do ColM analito são entradas aqui. Em seguida, a guia Processamento é usada para subtrair o sinal de referência dos dados experimentais.
A linha de base é definida para alinhar o eixo Y como se sua taxa de desomia fosse aplicada. Finalmente, os Dados de Processo são selecionados. Os dados são isolados para este experimento, e Fit Curves é selecionado.
Uma encaixe parcial da curva de associação e dissociação é escolhida. O Kd é calculado a partir deste ajuste. O cromatograma de exclusão de tamanho é usado para validar a reconstituição do ambute.
O cromatógrama mostra um único pico simétrico, sugerindo uma preparação de proteína monodisperse. O pico elutes vários mililitros após o volume vazio, indicando partículas de Peptidisc solúvel não agregadas. Os agregados proteicos se eluarão no volume vazio, enquanto o excesso de detergentes e peptídeos se elute após o pico principal.
O aumento da lavagem dos Peptidiscs formados enquanto ainda está ligado às contas nickel-nta deve esgotar este último pico. Os agregados proteicos são frequentemente resultado da exposição de proteínas de memória à solução livre de detergente antes da reconstituição. Este último cromatograma de exclusão é um diagnóstico útil para a solução de problemas da reconstituição.
Após o processamento dos dados experimentais, uma curva é adequada ao sensograma. A precisão deste encaixe é essencial para o cálculo da constante de dissociação. O gráfico de visão residual descreve a diferença entre os dados experimentais e o ajuste computacional.
Isso mostra que para as quatro diferentes concentrações de coluna três das curvas se encaixam bem. No entanto, para a maior concentração a curva não produz um bom ajuste. Isso sugere que, nesta maior concentração, há uma ligação heterogênea da coluna ao pino.
Este sinal de maior concentração não está, portanto, incluído na análise cinética, de acordo com as notas de aplicação do ForteBio. As três curvas restantes são utilizadas para a análise cinética. Uma constante de dissociação entre FhuA e ColM, determinada usando o método BLI e Peptidisc, é consistente com as constantes determinadas por outros métodos.
A calorimetria isotérmica e os nanodiscos, e a termoforese de microescala e o Peptidisc produziram constantes de dissociação não significativamente diferentes do nosso valor determinado. Essa consistência valida o método Peptidisc BLI para medir cinética de interação. Tudo bem, então, depois de assistir a este vídeo, esperamos que você tenha adquirido uma compreensão prática da força e ressalva dos métodos PeptiQuick.
Encontramos este método particularmente útil para quantificar a interação FhuA ColM na completa ausência de detergentes. E suspeitamos que o mesmo fluxo de trabalho pode ser aplicado para caracterizar qualquer outra interação receptor-ligante. Boa sorte com suas experiências.
